核酸比の迅速な探索のための最適化されたマウス胚性幹細胞ベースのリバースポリトランスフェクション技術(英語)

サマリー

本プロトコルは、2iおよびLIF培地による培養中のマウス胚性幹細胞の逆ポリトランスフェクションの方法を記述する。この分析法は、従来のフォワードトランスフェクションプロトコルよりも高い生存率と効率をもたらすと同時に、プラスミド比のワンポット最適化も可能にします。

要約

哺乳類細胞株の核酸による一過性トランスフェクションは、その比較的簡便さと使いやすさから、生物医学研究の主力となっています。最も広く使用されている細胞株には、接着性二次元培養におけるトランスフェクションのための堅牢なプロトコルがありますが、これらのプロトコルは、あまり研究されていない細胞株や、非定型でトランスフェクションが困難な形態を持つ細胞株にはうまく変換されないことがよくあります。この分析法は、再生医療に広く使用されている培養モデルである2i/LIF培地で増殖させたマウス多能性幹細胞を用いて、より高いトランスフェクション効率を達成できる最適化された迅速なリバーストランスフェクションプロトコルの概要を示しています。このプロトコルを活用して、3プラスミドのポリトランスフェクションを行い、プラスミド送達の通常よりも高い効率を利用して、より広い範囲のプラスミド化学量論を研究します。このリバースポリトランスフェクションプロトコルにより、ワンポット実験法が可能になり、複数のコトランスフェクションではなく、単一のウェルでプラスミド比を最適化できます。このプロトコルは、送達された遺伝子回路の全面的な機能に対するDNA化学量論の効果の急速な調査を促進することによって、胚性幹細胞のtransfectionの時間そして費用を最小にする。

概要

哺乳類細胞へのDNAとRNAの送達は、生物医学研究の中核的な柱として機能します¹。外因性核酸(NA)を哺乳類細胞に導入する一般的な方法は、一過性トランスフェクション^2,3です。この技術は、NAをレシピエント細胞に送達できる市販のトランスフェクション試薬と混合することに依存しています。通常、NAはフォワードトランスフェクションを介して送達され、2次元表面に接着した細胞がトランスフェクション複合体を受け取ります。最も一般的な確立された細胞株のフォワードトランスフェクションは頑健であり、プロトコルは十分に公開されていますが、非単層形態のよりニッチな細胞タイプではトランスフェクションが容易ではなく、送達できるNAの量とそれを受け取る細胞の数が制限されます。

多能性幹細胞(PSC)は、無限に分裂し、あらゆる種類の体細胞を産生する能力があるため、発生を理解するための魅力的なモデルとして、また再生医療のツールとして機能します。マウスPSC(mPSC)の場合、2つの阻害剤とLIF(2i/LIF)を用いたルーチンのin vitro培養条件では、ドーム状のコロニー形態が維持され、フォワードトランスフェクションに曝露される細胞の数が直接制限されます^4,5,6。これに対処するために、接^着細胞にトランスフェクション試薬を添加するのではなく、培地とトランスフェクション試薬を含むディッシュに細胞を添加するリバーストランスフェクションを実施することができます7。これにより、試薬に曝露される細胞の数が増加しますが、細胞の継代とトランスフェクションを同時に行う必要もあります。

研究者は、単純な単一NAトランスフェクションを超えて、複数のNAコンストラクトをin vitroの細胞集団に導入することをしばしば目指します。これは典型的には、NAを所定の比率(1:1、9:1など)で混合し、次に選択したトランスフェクション^試薬と組み合わせるコトランスフェクションによって達成される8。これにより、NAと試薬の混合物が得られ、NAの元の比率が互いに維持されます - 処理中の細胞は、この混合物の異なる量を受け取る可能性がありますが、それらはすべて同じ比率^{を受け取ります}9。これは、部品の所望の比率がわかっている場合に有利ですが、この比率を事前に決定することは、各比率が異なる条件を構成するため、労働集約的になる可能性があります。1つの代替案は、個々のNAをトランスフェクション試薬と互いに独立して混合する「ポリトランスフェクション」を行うことである⁹。個々のNAを含むトランスフェクション複合体を組み合わせることにより(複合体を作成する前にNAを組み合わせるのではなく)、研究者は1回のトランスフェクション実験で幅広いNA化学量論を調べることができます⁹。これは、誘導可能な転写系や^1,10,11にフィードバックが組み込まれたシステムなど、複数のNAの産物が互いに相互作用することが予想される場合に特に価値があります。しかし、これを効果的に行うには、高いトランスフェクション効率が必要です。実際、トランスフェクションされた一意のNAの数が増加すると、特定の細胞が所望のNAのすべてを受け取る確率は指数^{関数的に減少し}ます^9,12。

以下の報告では、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いたmPS細胞のリバーストランスフェクションプロトコルについて説明しており、細胞を試薬とNAの混合物に最大5分間曝露することで、生存率を最大化し、通常の培養条件以外での時間を最小限に抑えます。このプロトコルをこれらの細胞の標準的な前方トランスフェクションと比較すると、トランスフェクション効率が高く、トランスフェクションされた細胞の総数が増加していることが実証されます。このリバーストランスフェクションを、単純な蛍光レポーターを用いた3プラスミドポリトランスフェクションと組み合わせることで、高いトランスフェクション効率でNA比をスクリーニングする可能性が広がります。

プロトコル

1. mPSC培養用試薬の調製

1. N2サプリメントを準備します。
   1. 非滅菌状態で、以下の原液(ステップ1.1.1.1)を化学的安全ドラフトで調製します。各化学物質の固体粉末を、事前に計量した50 mLのコニカルチューブに加えます。粉末を添加した後、各チューブの重量を量り、適切な量の溶媒を加えて以下の濃度にします。メディアの 1 バッチについては、記載されている最小量を準備します。
      注:以下の試薬は危険であり、地域の化学物質安全ガイドラインに従って取り扱う必要があります。取り扱いの際は適切なPPEを確保し、吸入を防ぐために、これらの化学物質の固体粉末形態のみを化学ヒュームフードで使用してください。
      1. 0.518 mg/mL の水に 0.05 mL 以上の亜セレン酸ナトリウム、160 mg/mL の水に 0.5 mL のプトレシン、0.6 mg/mL の 100% エタノール中のプロゲステロン 0.165 mL ( 材料表を参照)。
      2. 溶液は-20°Cで最長2年間保存してください。
   2. バイオセーフティキャビネット(BSC)で、58.035 mLのDMEM-F12に以下を添加します。
      1. 0.518 mg / mL亜セレン酸ナトリウム溶液0.05 mL、160 mg / mLプトレシン溶液0.5 mL、0.6 mg / mLプロゲステロン溶液0.165 mL。.
      2. 上記の混合物を0.22μmのフィルターでフィルター滅菌します。
   3. まだBSCで、100 mg / mLのアポトランスフェリンの溶液を調製します。
      1. 5 mLのDMEM-F12を500 mgのアポトランスフェリンに加えます( 材料表を参照)。容器をゆっくりと再懸濁して洗浄し、気泡を避けます。
      2. 5 mLで再懸濁してできるだけ多く除去した後、亜セレン酸塩/プトレシン/プロゲステロン溶液に加えます。前の溶液をさらに取り、アポトランスフェリンボトルを洗浄して、できるだけ多くのものを取り出します。.
   4. 5 mLの7.5% BSAフラクションV( 材料表を参照)を溶液に加えます。
   5. チューブあたり6.875 mLを混合し、分注します。アリコートは-80°Cで最長1年間保管してください。
   6. 上記の N2 アリコートを使用して N2B27 培地を作製する場合は、目的のアリコートを融解し、3.125 mL の 4 mg/mL インスリン溶液( 材料表を参照)を 6.875 N2 に 10 mL の 100x N2 で添加します。
2. N2B27基礎培地を調製します。
   1. N2およびB27サプリメントを4°Cの冷蔵庫で数時間または一晩解凍します。
   2. BSCでは、484.5 mLのDMEM-F12と484.5 mLのNeurobasal medium( 材料表を参照)を滅菌1 Lボトルで混合します。
   3. 培地に 10 mL の B27 と 10 mL の N2 サプリメントを加えます。
   4. 1 mL の 55 mM β-メルカプトエタノールを加えます( 材料表を参照)。100x グルタマックスを10 mL添加します。ボトルを渦巻かせて激しく混ぜます。
   5. アリコートあたり所望の容量(通常100 mL)を分注し、-80°Cで最長1年間保存します。4°Cで解凍後、最大3週間保管してください。
3. NBiLメディアを準備します。
   1. N2B27基礎培地の100 mLアリコートを-80°Cの4°C冷蔵庫で解凍します。
   2. BSCでは、最終濃度が10 μg/LになるようにLIF( 材料表を参照)を添加します。
   3. CHIR99021(3 μM final)とPD0325901(1 μM final)を加えます( 材料表を参照)。50 mLの血清ピペットでよく混ぜます。4°Cで最大2週間保存してください。
4. 0.2%ゼラチン溶液を調製する。
   1. 500mLの二重蒸留H₂Oを1Lのガラス瓶に移す。
   2. 1 gのゼラチン( 材料表を参照)を測定し、水に加えます。ほとんど溶けるまでボトルを振って混ぜます。
   3. ゼラチンと水の混合物を15psi、121°Cで35分間オートクレーブします。冷却したら、BSC内の0.22μmフィルターでフィルター滅菌します。4°Cで保存してください。
5. 洗浄液を準備します。
   1. BSCでは、DMEM-F12 10 mL あたり 7.5% BSA 160 μL を混合します。
   2. 上記をスケールアップし、将来の使用を容易にするために大量に調製します(例:7.5% BSAの8 mLからDMEM-F12の500 mL)。4°Cで保存してください。

2. mPSCポリトランスフェクション用試薬の調製

注:以下の値は、24ウェルプレートのシングルウェルに対して提供されます。値はそれに応じてスケーリングできます。すべてのDNA/プラスミドの配列は、 補足ファイル1に詳述されています。

1. 処理ごとに必要なDNA溶液の量を計算します。
   1. ウェル/条件ごとに 500 ng の DNA を調製します。
      1. 100 ng/μL の DNA 溶液で 1 つのプラスミドをトランスフェクションする場合は、5 μL の DNA が入ったチューブを 1 本調製します。
      2. 2 つのプラスミドをそれぞれ 100 ng/μL でトランスフェクションする場合は、それぞれ 2.5 μL のチューブを 2 本、プラスミドごとに 1 本ずつ調製します。
2. BSC では、次の手順を実行します。 500 ng トランスフェクション処理( 材料表を参照)ごとに、25 μL の OptiMEM を 1.5 mL チューブに分注します。
   1. 上記の例では、それぞれ250 ngのDNA(2.5 μL)と12.5 μLのOptiMEMが入った2本のチューブを用意します。
3. その処理に必要な量のDNAをチューブ内のOptiMEMに加えます。
4. 500 ng の DNA と OptiMEM が入ったチューブごとに、さらに 25 μL の OptiMEM と 1 μL のカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を同封したマッチングチューブを作成します。
   1. 繰り返しになりますが、これらの値はそれに応じてスケーリングする必要があります。上記の例では、それぞれ12.5 μLのOptiMEMと0.5 μLのトランスフェクション試薬が入った2本のチューブを用意します。
      注:値をスケーリングするときは、その量のDNAに必要な容量ではなく、添加したDNAの質量を使用してください。トランスフェクション試薬とDNAによる反応はスケーリングできます(例えば、5つのウェルに同じDNAをトランスフェクションする場合)。試薬の比率は同じに保ちますが、それに応じてスケーリングします(例:1000 ng DNA:50 μL OptiMEM:2 μLトランスフェクション試薬:50 μL OptiMEM)。

3. トランスフェクション用mPS細胞の作製

注:リバーストランスフェクションの場合は、トランスフェクション試薬を添加する前に、培養容器を準備し、mPSCを直接継代してください。フォワードトランスフェクションの場合、トランスフェクションの12〜18時間前に細胞を継代してプレーティングし、細胞がプレートに接着できるようにします。

1. 0.2%ゼラチンでコーティングした細胞培養容器を調製します。
   1. トランスフェクションに必要なウェルの数を計画します(治療/グループごとに24ウェルプレートのウェルを1つ)。
   2. 200 μL の 0.2% ゼラチン溶液を 24 ウェルプレート内の目的の各ウェルに加えます。
   3. プレートを静かに振って溶液を均一に広げ、ウェルの底全体を覆うようにします。
   4. ウェルを室温で最低15分間コーティングします。
   5. 真空吸引器を使用して、ウェルから残ったゼラチンを慎重に取り除きます(プレートを傾けて、ゼラチン層をこすり落とさずにすべての液体を確実に除去します)。
   6. 各ウェルに0.5 mLのNBiL培地を添加し(ステップ1.3)、プレートを組織培養インキュベーターに入れて予温します。
2. 継代mPSC。
   1. 30 mLの洗浄培地(ステップ1.5)を50 mLのコニカルチューブに分注します。
   2. mESCの組織培養皿から古い培地を吸引します。
      注:いくつかの吸引技術が許容されます。どのような手法を選択するにしても、細胞が長期間(最大約30秒)乾燥したままにならないようにしてください。
   3. 市販の細胞除去培地(10 cmのディッシュに1.5 mL、それに応じてスケール、 材料表を参照)を必要量添加します。
   4. 3〜5分待ってから、P1000ピペットで15〜20回ピペッティングしてシングルセル懸濁液を得ます。細胞を顕微鏡で観察し、単一細胞懸濁液を確認します。
   5. 脱液培地中の細胞を、洗浄培地を含む50 mLチューブに移します。
   6. 室温で300 x g で5分間遠心分離します。洗浄液を吸引し、チューブ内に残留液が残らないようにします。
   7. ペレットを少量の洗浄培地(~300 μL)に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞懸濁液をカウントし、細胞密度を取得します。

4. mPS細胞のリバーストランスフェクション

1. ステップ2に従ってポリトランスフェクション試薬を調製します。
2. ステップ3に従って細胞培養容器と継代mPSCを調製する。
3. 200 μL の NBiL 培地を 1.5 mL チューブに 1 本ずつ分注します。
4. 26 μLのOptiMEM:トランスフェクション試薬混合物をDNA:OptiMEM混合物に加えます。試薬を約10回ピペッティングして迅速かつ激しく混合します。混合物を室温で5分間インキュベートします。
5. 細胞密度に基づいて、必要な量の細胞を300 μLの細胞懸濁液から200 μLのNBiLチューブに移し、チューブあたり25,000個の細胞を得ます。
6. Lipofectamine 2000(L2K、トランスフェクション試薬)とDNA混合物を5分間インキュベートした後、1.5 mLの細胞チューブに加え、ピペッティングでよく混合します。細胞を試薬とともに室温で5分間インキュベートします。
7. 室温で300 x g で5分間遠心分離します。液体をピペットで取り出し、約50μLを残します。
8. 細胞ペレットを100 μLのNBiL培地で再懸濁します。細胞をプレートに移し、プレートをインキュベーターに入れます。24時間後に新しいNBiLメディアでメディアを交換します。

5. mPS細胞のフォワードトランスフェクション

1. トランスフェクションの12〜18時間前に、ステップ3に従って細胞培養容器および継代mPSCを調製します。
2. 細胞密度に基づいて、必要な量の細胞を 300 μL の細胞混合物から 25,000 細胞/ウェルの播種に移します。プレートをインキュベーターに入れます。
3. トランスフェクションの1時間前に、すべてのウェルから培地を吸引し、0.5 mLのNBiL培地と交換します。プレートをインキュベーターに入れます。
4. トランスフェクション時には、ステップ2に従ってmPSCポリトランスフェクション試薬を調製します。
5. 26 μLのOptiMEM:トランスフェクション試薬混合物をDNA:OptiMEM混合物に加えます。試薬を約10回ピペッティングして迅速かつ激しく混合します。混合混合物を室温で5分間インキュベートします。
6. 混ぜ合わせた混合物をウェルに滴下します。プレートをインキュベーターに入れます。24時間後にメディアを交換します。

6. フローサイトメトリー

1. トランスフェクションの48時間後にトランスフェクションした24ウェルプレートから培地を吸引します。
2. 各ウェルに200 μLのトリプシンを添加し、スワイアリングし、37°Cで30秒間インキュベートします。 プレートの側面を軽くたたき、氷冷したFACSバッファー(PBS中の2%FBS)200 μLを加えます。
3. Vボトムの96ウェルプレートをA1から開けてラベル付けします。トランスフェクションしたプレート上で各ウェルの内容物を混合して細胞を取り除き、P200ピペットでシングルセル溶液を調製します。各ウェルから 96 ウェルプレート上の適切なウェルに 200 μL を移します。
4. 15 mL の FACS バッファーを 50 mL の試薬リザーバーに加えます。プレートを室温で300 x g で5分間遠心分離します。96ウェルプレートを迅速かつ滑らかな動きでシンクに反転させて、上清を廃棄します。
5. マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート上のペレットを試薬リザーバーから採取した150 μLのFACSバッファーに再懸濁します。手順6.4〜6.5を2回繰り返します。96ウェルプレートを、光から保護された氷で満たされた箱に入れます。
6. サンプルをフローサイトメーターに通し、蛍光レポーターの集団分布を取得します。
   1. サイトメーターが、実施する実験にレーザーとフィルターの組み合わせに関して適切であることを確認してください(例えば、遠赤外スペクトルで励起または検出できない場合は、赤外線レポーターを使用しないでください)。
   2. 標準化ビーズ用のサンプルを追加して、分析中にデータのMEFL変換を可能にします。適切な統計解析のために、サンプルごとに十分な細胞が収集されていることを確認します⁹.
7. 生のサイトメーターファイルから蛍光ユニットを変換し、PythonまたはMATLABベースのパイプラインや市^{販のソフトウェア}など、いくつかの方法のいずれかを使用してデータを解析します^9,13。

結果

順方向トランスフェクションと逆方向トランスフェクションはどちらも、細胞膜と入ってくるトランスフェクション試薬-DNA複合体との相互作用に依存し、レシピエント細胞へのNAの送達を可能にします。従来のフォワードトランスフェクションでは、DNAは通常、接着細胞単層に送達されますが、リバーストランスフェクションでは、シングルセル懸濁液中で試薬とDNA複合体を細胞に接触させることに依存しています。この違いは、細胞が均一で平坦な単層として増殖せず、mPS細胞のようにドーム型またはコロニー状の形態をとる状況で特に重要になります。コトランスフェクションの代わりにポリトランスフェクションを実施するなど、従来のトランスフェクションに追加のバリエーションを採用することができます。この修飾により、特定の処理における各DNA種の相対的な分布が変化し、研究者は表現型とプラスミドの投与量との関係を迅速に調査できます。これらの実験を行う際には、サイトメーター自体の標準化と品質管理を行うことも重要です。以下のいくつかの実験の蛍光ユニットは、確立されたプロトコル¹³に従って、実験日間での正確な比較を可能にするために、蛍光ビー...

ディスカッション

トランスフェクションプロトコルが広く採用されている主な理由は、その再現性とアクセス性です。ただし、これらのプロトコルには、実験コンテキスト全体での最適化が必要です。上記には記載されていませんが、新しい細胞株を初めてトランスフェクションしようとするときに必要な標準的な試験です。まず、市販の試薬は万能ではなく、NA送達の効率は細胞タイプによって異なるため、トランスフェクション試薬の選択が重要です。さらに、NAとトランスフェクション試薬の理想的な量、およびそれらの最適な比率を見つけるには、試験が必要です。多くの場合、トランスフェクション試薬サプライヤーが推奨する最適化手順に従うだけで、NA試薬とトランスフェクション試薬の両方の理想的な量を得ることができます。

トランスフェクションが失敗した場合、まず、使用する試薬の適合性を考慮する必要があります:NAがバリデーションされ、配列決定されているかどうか、トランスフェクション前に細胞が最適に生存可能な状態にあるかどうか、トランスフェクション試薬がロットテストされているかどうか、または他のより細胞特異的な試薬と比較されているかどうかを検討します。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュターゼ	ミリポアシグマ	SCR005
アポトランスフェリン	ミリポアシグマ	T1147-500MG
B27 サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック
β-メルカプトエタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック
BSA フラクション V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
フローサイトメトリー標準化ビーズ	Spherotech	URCP-38-2K
ゼラチン	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック
35050061インスリン	Gibco	12585-0014
リポフェクタミン 2000	Invitrogen	11668-019	トランスフェクション試薬
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific
OptiMEM	インビトジェン	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	化学的危険性 - 地域の安全ガイドラインを参照し、適切なPPEが着用されていることを確認し、化学ヒュームフードでのみ固体粉末形態を使用してください
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	化学的危険性 - 地域の安全ガイドラインを参照し、適切なPPEが着用されていることを確認し、化学ヒュームフード
内でのみ固体粉末形態を使用してください組換えmLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
亜セレン酸ナトリウム	MilliporeSigma	S5261-25G	化学的危険性 - 地域の安全ガイドラインを参照し、適切なPPEが着用されていることを確認し、化学ヒュームフード内でのみ固体粉末の形で作業
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック