Method Article

核酸比の迅速な探索のための最適化されたマウス胚性幹細胞ベースのリバースポリトランスフェクション技術(英語)

DOI:

10.3791/65766

⸱

December 8th, 2023

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、2iおよびLIF培地による培養中のマウス胚性幹細胞の逆ポリトランスフェクションの方法を記述する。この分析法は、従来のフォワードトランスフェクションプロトコルよりも高い生存率と効率をもたらすと同時に、プラスミド比のワンポット最適化も可能にします。

Abstract

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哺乳類細胞株の核酸による一過性トランスフェクションは、その比較的簡便さと使いやすさから、生物医学研究の主力となっています。最も広く使用されている細胞株には、接着性二次元培養におけるトランスフェクションのための堅牢なプロトコルがありますが、これらのプロトコルは、あまり研究されていない細胞株や、非定型でトランスフェクションが困難な形態を持つ細胞株にはうまく変換されないことがよくあります。この分析法は、再生医療に広く使用されている培養モデルである2i/LIF培地で増殖させたマウス多能性幹細胞を用いて、より高いトランスフェクション効率を達成できる最適化された迅速なリバーストランスフェクションプロトコルの概要を示しています。このプロトコルを活用して、3プラスミドのポリトランスフェクションを行い、プラスミド送達の通常よりも高い効率を利用して、より広い範囲のプラスミド化学量論を研究します。このリバースポリトランスフェクションプロトコルにより、ワンポット実験法が可能になり、複数のコトランスフェクションではなく、単一のウェルでプラスミド比を最適化できます。このプロトコルは、送達された遺伝子回路の全面的な機能に対するDNA化学量論の効果の急速な調査を促進することによって、胚性幹細胞のtransfectionの時間そして費用を最小にする。

Introduction

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哺乳類細胞へのDNAとRNAの送達は、生物医学研究の中核的な柱として機能します1。外因性核酸(NA)を哺乳類細胞に導入する一般的な方法は、一過性トランスフェクション2,3です。この技術は、NAをレシピエント細胞に送達できる市販のトランスフェクション試薬と混合することに依存しています。通常、NAはフォワードトランスフェクションを介して送達され、2次元表面に接着した細胞がトランスフェクション複合体を受け取ります。最も一般的な確立された細胞株のフォワードトランスフェクションは頑健であり、プロトコルは十分に公開されていますが、非単層形態のよりニッチな細胞タイプではトランスフェクションが容易ではなく、送達できるNAの量とそれを受け取る細胞の数が制限されます。

多能性幹細胞(PSC)は、無限に分裂し、あらゆる種類の体細胞を産生する能力があるため、発生を理解するための魅力的なモデルとして、また再生医療のツールとして機能します。マウスPSC(mPSC)の場合、2つの阻害剤とLIF(2i/LIF)を用いたルーチンのin vitro培養条件では、ドーム状のコロニー形態が維持され、フォワードトランスフェクションに曝露される細胞の数が直接制限されます

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Protocol

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1. mPSC培養用試薬の調製

  1. N2サプリメントを準備します。
    1. 非滅菌状態で、以下の原液(ステップ1.1.1.1)を化学的安全ドラフトで調製します。各化学物質の固体粉末を、事前に計量した50 mLのコニカルチューブに加えます。粉末を添加した後、各チューブの重量を量り、適切な量の溶媒を加えて以下の濃度にします。メディアの 1 バッチについては、記載されている最小量を準備します。
      注:以下の試薬は危険であり、地域の化学物質安全ガイドラインに従って取り扱う必要があります。取り扱いの際は適切なPPEを確保し、吸入を防ぐために、これらの化学物質の固体粉末形態のみを化学ヒュームフードで使用してください。
      1. 0.518 mg/mL の水に 0.05 mL 以上の亜セレン酸ナトリウム、160 mg/mL の水に 0.5 mL のプトレシン、0.6 mg/mL の 100% エタノール中のプロゲステロン 0.165 mL ( 材料表を参照)。
      2. 溶液は-20°Cで最長2年間保存してください。
    2. バイオセーフティキャビネット(BSC)で、58.035 mLのDMEM-F12に以下を添加します。
      1. 0.518 mg / mL亜セレン酸ナトリウム溶液0.05 mL、160 mg / mLプトレシン溶液0.5 mL、0.6 mg / mLプロゲステロン溶液0.....

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Results

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順方向トランスフェクションと逆方向トランスフェクションはどちらも、細胞膜と入ってくるトランスフェクション試薬-DNA複合体との相互作用に依存し、レシピエント細胞へのNAの送達を可能にします。従来のフォワードトランスフェクションでは、DNAは通常、接着細胞単層に送達されますが、リバーストランスフェクションでは、シングルセル懸濁液中で試薬とDNA複合体を細胞に接触させることに依存しています。この違いは、細胞が均一で平坦な単層として増殖せず、mPS細胞のようにドーム型またはコロニー状の形態をとる状況で特に重要になります。コトランスフェクションの代わりにポリトランスフェクションを実施するなど、従来のトランスフェクションに追加のバリエーションを採用することができます。この修飾により、特定の処理における各DNA種の相対的な分布が変化し、研究者は表現型とプラスミドの投与量との関係を迅速に調査できます。これらの実験を行う際には、サイトメーター自体の標準化と品質管理を行うことも重要です。以下のいくつかの実験の蛍光ユニットは、確立されたプロトコル13に従って、実験日間での正確な比較を可能にするために、蛍光ビー.......

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Discussion

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トランスフェクションプロトコルが広く採用されている主な理由は、その再現性とアクセス性です。ただし、これらのプロトコルには、実験コンテキスト全体での最適化が必要です。上記には記載されていませんが、新しい細胞株を初めてトランスフェクションしようとするときに必要な標準的な試験です。まず、市販の試薬は万能ではなく、NA送達の効率は細胞タイプによって異なるため、トランスフェクション試薬の選択が重要です。さらに、NAとトランスフェクション試薬の理想的な量、およびそれらの最適な比率を見つけるには、試験が必要です。多くの場合、トランスフェクション試薬サプライヤーが推奨する最適化手順に従うだけで、NA試薬とトランスフェクション試薬の両方の理想的な量を得ることができます。

トランスフェクションが失敗した場合、まず、使用する試薬の適合性を考慮する必要があります:NAがバリデーションされ、配列決定されているかどうか、トランスフェクション前に細胞が最適に生存可能な状態にあるかどうか、トランスフェクション試薬がロットテストされているかどうか、または他のより細胞特異的な試薬と比較されているかどうかを検討します。.......

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Disclosures

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著者らは利益相反を報告していない。

Acknowledgements

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著者らは、スペースの都合上、本研究で引用しなかったこの分野への多くの貢献と、この機会を提供してくれた資金提供機関に感謝したい。著者らは、この研究を支援したカナダ自然科学・工学研究評議会(NSERC)とカナダ衛生研究所(CIHR)からの資金提供を認めている。K.M.は、NSERCからCGS-M奨学金を、ブリティッシュコロンビア大学からキラム博士奨学金を受給しています。N.S.は、Michael Smith Health Research BC Scholar Awardを受賞しています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アキュターゼ ミリポアシグマSCR005
アポトランスフェリン ミリポアシグマT1147-500MG
B27 サプリメント サーモフィッシャーサイエンティフィック 
β-メルカプトエタノールサーモフィッシャーサイエンティフィック 
BSA フラクション V (7.5%)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
フローサイトメトリー標準化ビーズSpherotechURCP-38-2K
ゼラチン MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX サプリメント サーモフィッシャーサイエンティフィック 
35050061インスリン Gibco12585-0014
リポフェクタミン 2000 Invitrogen11668-019トランスフェクション試薬
Neurobasal mediaThermoFisher Scientific 
OptiMEM インビトジェン31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
ProgesteroneMilliporeSigmaP8783化学的危険性 - 地域の安全ガイドラインを参照し、適切なPPEが着用されていることを確認し、化学ヒュームフードでのみ固体粉末形態を使用してください
PutrescineMilliporeSigmaP6780化学的危険性 - 地域の安全ガイドラインを参照し、適切なPPEが着用されていることを確認し、化学ヒュームフード
内でのみ固体粉末形態を使用してください組換えmLIF BioTechne8878-LF-500/CF
亜セレン酸ナトリウム MilliporeSigmaS5261-25G化学的危険性 - 地域の安全ガイドラインを参照し、適切なPPEが着用されていることを確認し、化学ヒュームフード内でのみ固体粉末の形で作業
トリプシン-EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック 
175040442198502321103049してください 25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....

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Reverse Poly TransfectionMouse Embryonic Stem CellsNucleic Acid RatiosPlasmid DeliveryTransient TransfectionGene DosageFlow CytometryPluripotent Stem CellsDNA StoichiometryLipofectamine Transfection

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