方法論記事

ヒト落葉歯および永久歯からの歯髄幹細胞の単離、培養、および特性評価

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DOI：

10.3791/65767

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2024年5月17日

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1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、酵素消化による歯髄からの多能性幹細胞の抽出、培養、および保存に重点を置いています。さらに、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化する可能性を示しており、プロセスの精度と一貫性の重要性を強調しています。

要約

再生医療や治療への応用の分野では、幹細胞研究が急速に勢いを増しています。歯髄幹細胞(DPSC)は、乳歯と永久歯の両方に存在するため、そのアクセス可能性、適応性、および先天的な分化能力により、重要な幹細胞源として浮上しています。DPSCは、間葉系幹細胞の容易で利用可能で豊富なリザーバーを提供し、特に再生目的で印象的な汎用性と可能性を示しています。その有望性にもかかわらず、主なハードルは、歯髄細胞内の微小な画分として表現されるDPSCを効果的に分離し、特性評価することにあります。同様に重要なのは、この貴重な細胞資源を適切に保存することです。DPSC単離の2つの主要な方法は、酵素消化(ED)と組織外植片からの伸長(OG)であり、しばしば自発的増殖と呼ばれます。このプロトコールは、主にDPSC単離のための酵素消化アプローチに焦点を当てており、抽出、ラボ内処理、および細胞保存を含むステップを複雑に詳細に説明しています。このプロトコルでは、抽出と保存だけでなく、DPSCの分化能力を掘り下げ、具体的には、これらの幹細胞を脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞に分化させるための手順を概説し、その多能性を示します。その後の比色染色技術の利用により、正確な可視化と成功した分化の確認が容易になり、単離されたDPSCの口径と機能の検証が可能になります。この包括的なプロトコールは、歯髄幹細胞の抽出、培養、保存、および特性評価の全範囲を網羅する青写真として機能します。これは、DPSCが秘めた大きな可能性を強調し、幹細胞の探索を前進させ、将来の再生および治療のブレークスルーを約束します。

概要

幹細胞研究は、再生医療や組織工学への応用が有望であることから、生物医科学の分野で盛んに行われています。ヒトの乳歯と永久歯の両方の歯髄組織に由来する歯髄幹細胞(DPSC)は、その入手可能性と多能性容量により、幹細胞の供給源として大きな関心を集めています1,2。これらの細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞など、さまざまな細胞タイプに分化する可能性を秘めていることが、数多くの研究で確認されています3。

過去数十年にわたって、幹細胞の研究と治療への応用が急増しています。幹細胞の広範な可能性は、幹細胞が取得される供給源を多様化することを求めています。選択した細胞の効率、生存率、幹細胞性には、いくつかの要因が影響します。骨髄や脂肪組織など、さまざまな既知の幹細胞リザーバーが存在するにもかかわらず、これらの発生源に関連する侵襲的な手順、部位の罹患率、および倫理的懸念により、多くの場合、それらの探索が制限されます4,5。さまざまな幹細胞源の中で、歯科用幹細胞は、その容易なアクセス性、高い可塑性、および多様な潜在的な用途により注目を集めています。特にヒト歯髄幹細胞は、その治療の見通しについて広く研究されてきました6。一般的に医療廃棄物として廃棄される歯は、間葉系幹細胞を豊富に保持しています7。この貴重な幹細胞プールを保護するには、患者、歯科医、医師が一丸となって、これらのリソースを無駄にしないようにし、各歯髄幹細胞を将来の再生要件に対応できるようにする必要があります。

ヒト成体歯髄幹細胞(DPSC)や剥離したヒト乳歯幹細胞(SHED)などの歯髄由来幹細胞は、歯髄の血管周囲ニッチに位置しています。これらの細胞は、脳神経堤細胞に由来し、間葉系幹細胞(MSC)と神経外胚葉系幹細胞の両方に早期マーカーを示すと考えられています。DPSCとSHEDは、多能性と多様な組織型を再生する能力を実証しています8。

歯科幹細胞の潜在的な供給源には、健康な乳歯と永久歯が含まれます。幹細胞は、パルプ中の全細胞集団の約1%しか占めておらず、効果的な単離および増殖技術の重要性が強調されています9。したがって、これらの幹細胞の抽出と増殖は、DPSC単離10における極めて重要なステップです。抜歯または剥離した歯は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)やハンクス緩衝生理食塩水(HBSS)などの栄養豊富な輸送培地で保管する必要があります。

歯髄の入手は、歯のタイプ7,11に応じて、さまざまな方法で達成できます。根が吸収された乳歯の場合、根の頂点を介して抜歯を行うことができます。同様に、滅菌されたとげのあるブローチを使用して、未熟な開放頂点を持つ永久歯から歯髄を得ることができます。根が完全に発達した永久歯の場合、歯髄チャンバーにアクセスするには、歯冠を歯根から分離する必要があります。これは、セメントナメル質接合部でダイヤモンドディスクを使用して歯を切断することによって達成されます。この切開部は歯髄室を露出させ、歯髄組織12、13、14の回収を可能にする。

歯髄幹細胞(DPSC)は、酵素消化(ED)または組織外植片からの増殖(OG)(自然増殖とも呼ばれる)によって単離できます。ED法は、主にコラゲナーゼIおよびディスパーゼなどの酵素を用いて、組織を単一細胞懸濁液に分解する15,16。OG法は、より単純で迅速で、パルプ断片を粉砕し、それらを直接培養プレートに置き、細胞が組織外植片17から成長することを可能にする。研究者らは、細胞増殖速度、単離された幹細胞特性の保存、分化、および表面マーカー発現を評価するために、両方の技術を利用し、比較してきた18。DPSCを高効率かつステミーネスで取得するためのプロトコルを確立し標準化することで、効果的で安全な治療法への道を開くことができます19。このプロトコルには、酵素消化、ラボプロセッシング、保存、および脂肪形成、骨形成、および軟骨形成のための比色染色による細胞分化を使用したDPSCの抽出が含まれます。

この記事で概説するプロトコルは、歯から歯髄を最初に分離することから始まり、実験室でのDPSCの培養と維持、そして特定の幹細胞マーカーを使用したそれらの特性評価で終わるという段階的な手順を示しています(図1)。これらの幹細胞を異なる細胞系譜に誘導し、それらの多能性を強調する技術についても説明します。

プロトコル

ここで概説されているプロトコルは、機関のヒト研究倫理委員会(IRB、Pushpagiri Research Center、ケララ州)のガイドラインに準拠しています。抜歯した歯の使用は、参加者の完全性、尊厳、権利を確保するための倫理基準に従って行われました。この研究に選ばれた参加者は、矯正治療のために抜歯が必要な30歳未満の健康な個人でした。広範囲の虫歯または重度の歯周炎のある人は、研究から除外されました。落葉歯は、保持された歯の抜歯が必要な子供から採取されました。インフォームド 書面による同意も、この研究に関与した被験者から得られました。

1. 歯の抜歯・輸送

  1. 乳歯と永久歯のコレクション
    1. 手順の目的と、抜歯した歯を研究目的で使用する可能性を参加者に説明します。
    2. 抜歯する歯の近くに麻酔薬を投与することにより、局所麻酔下で抜歯を行います。具体的には、この研究では、1.75 mLのリドカインとエピネフリンを混合した(材料の表を参照)1:200,000の比率で注射しました。.重度の虫歯や歯周炎を示さない歯を選択することが望ましい20,21。
  2. 抜歯した歯の輸送
    注:汚染を避けるために、無菌条件下での作業をお勧めします。これには、手袋や白衣などの個人用保護具の着用や、バイオハザード層流フードなどの無菌環境での作業が含まれます。
    1. 歯を抜いた後、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいで、血液やその他の破片を取り除きます。滅菌鉗子とメスを使用して、歯の表面から付着した軟組織の残骸を慎重に取り除きます(図2A)。
    2. 歯を70%エタノールなどの消毒液に10秒間浸します。消毒後、滅菌PBSで歯をすすぎ、残留した消毒剤を洗い流します。
    3. 輸送媒体が入った滅菌容器に歯を入れます。
      注:輸送培地は、抗生物質を添加した市販の培養培地であるAlpha-MEMで構成されていました:100 U / mLペニシリン/ストレプトマイシン( 材料の表を参照)。この培地は、抜歯した歯の細胞に必須栄養素を供給し、実験室での処理まで細胞の生存を確保しました。抗生物質は細菌の増殖を抑制するのに役立ちました。
    4. 輸送中は4°Cの温度を維持して、細胞の代謝活動を遅らせ、細胞死を遅らせます。歯髄幹細胞の処理と分離を含む次のステップのために、歯を検査室に運びます。

2. 歯髄組織の採取

  1. 歯科用鉗子を使用して歯を固定し、処置中に歯が所定の位置に留まるようにします。ダイヤモンドディスクを使用して、水冷却剤(図2B)に接続された歯科用ハンドピース(材料の表を参照)で歯を切断します。
    注:目標は、内部の歯髄組織に不必要な損傷を与えることなく、歯髄チャンバーを露出させることです。
  2. デンタルショベル( 材料の表を参照)を使用して、歯髄組織を取り出します。この装置は、損傷を与えることなく歯髄を抽出できるため、歯髄幹細胞の生存率を維持できます(図2C)。
  3. 得られたティッシュをガラスのペトリ皿に置きます。歯髄組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。

3.歯髄組織の消化と細胞の分離

  1. ティッシュミンチと消化
    1. 滅菌済みの外科用ブレードを使用して、歯髄組織を慎重に細かく刻み(図2D)、PBSを使用したミニティッシュグラインダーに入れて、細かく均質化された混合物を得ます。このプロセスにより、組織の表面積が増加し、消化中の酵素作用がより効率的に促進されます。
    2. 細かく刻んだ均質な組織片を15 mLチューブに移し、3 mg/mL I型コラゲナーゼと4 mg/mLのディスパーゼの混合物を利用して酵素的に消化します( 材料の表を参照)。これらの酵素をハンク平衡塩溶液(HBSS)に溶解して、所望の濃度を達成しました。
    3. 酵素混合物(ステップ3.1.2)でパルプ組織を37°Cで約2時間インキュベートします。 インキュベーション後、酵素を中和し、遠心分離(ステップ3.2.1)により細胞を回収し、さらなる培養を行います。
  2. 遠心分離と再懸濁
    1. インキュベーション後、消化した組織を15 mLの遠心チューブに移し、室温で300 x g で5分間遠心して細胞をペレット化します。このステップにより、細胞が残りの未消化の組織断片や酵素から分離されます。上清培地を慎重に捨て、チューブの底にある細胞ペレットを乱さないようにします。
    2. 細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。この培地は、単離された細胞が生存し増殖するために必要な栄養素と環境を提供します。

4. 細胞培養

  1. 細胞のプレーティングとインキュベーション
    1. 再懸濁した細胞を25cm²の培養フラスコに慎重に移します。
      注:1つのパルプからのすべての材料は、単一の25 cm2 細胞培養フラスコに移されます。5〜7mLの培地容量により、細胞の十分なカバレッジと栄養素の利用可能性が保証されます。DPSCの培地は、必要な成長因子を提供するために、10%〜20%のウシ胎児血清(FBS)( 材料表を参照)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)であることを確認してください。さらに、細菌汚染を防ぐために、培地に1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補給します。細胞がフラスコ全体に均一に分布し、均質な成長を促進するようにします。
    2. フラスコを5%のCO2を含む雰囲気中で37°Cでインキュベートします。
  2. 中程度の変更とモニタリングの合流性
    1. 2〜3日ごとに培地を交換して、新鮮な栄養素を提供し、代謝廃棄物を取り除きます。これを行うには、滅菌血清ピペットを使用して古い培地を慎重に吸引し、新しい培地と交換します。
    2. 顕微鏡で細胞培養を定期的に監視して、細胞の成長を追跡し、汚染の兆候がないか確認します。
    3. このプロセスは、細胞が80%〜90%のコンフルエンシー(細胞がフラスコの表面積の大部分を覆っているが、過度に密集していないポイント)に達するまで続けます。
  3. 細胞のトリプシン化と継代または凍結
    1. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、培地を取り出し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄して、残留培地と非接着細胞を除去します。
    2. 0.25%トリプシン-EDTAの溶液をフラスコに加えて、フラスコの表面から細胞を剥離します。細胞が浮き上がるまで、37°Cで2〜5分間インキュベートします。
    3. 等量の培地を添加してトリプシンを中和し、細胞懸濁液をゆっくりと上下にピペットで動かして、細胞が完全に剥離するようにします。
    4. 細胞懸濁液を300 x g で室温で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
    5. 細胞を新鮮な培地に再懸濁し、さらなる増殖のために再播種(継代)するか、将来の使用のために凍結します。凍結するときは、DMSOなどの凍結保護剤を含む凍結培地を使用して、凍結中の損傷から細胞を保護します。

5. DPSCの特性評価

  1. フローサイトメトリー解析
    1. 単離された細胞の間葉系幹細胞の性質を確認するために、フローサイトメトリー分析22,23を行う。最初に、ステップ4.3で説明されているように細胞をトリプシン化して収集します。
    2. トリパン色素排除技術により細胞生存率を測定します。細胞生存率アナライザー( 材料表を参照)を使用して、2回目 と8回目の 継代で解析を行います。フローサイトメーター を用いて 、3回目 と7回目の 継代で表現型解析を行います。
    3. インキュベーション後、フローサイトメトリーバッファーで細胞を洗浄して余分な抗体を除去し、フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。
      注:フローサイトメトリーバッファーは、リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)、1%-2%ウシ胎児血清(FBS)、および0.1%アジ化ナトリウム(NaN3)で構成されています。FBSまたはBSAは抗体の非特異的結合をブロックし、アジ化ナトリウムは防腐剤として機能します。細胞の高率は間葉系幹細胞マーカーを発現し、造血マーカーを欠いているはずであり、DPSCとしての同一性が確認されています24。
    4. DPSCを取り外し、フローサイトメトリー分析用の免疫蛍光抗体で染色します。
      注:間葉系幹細胞(MSC)のフローサイトメトリー解析のためのマーカーの選択は、MSCはCD105、CD73、およびCD90を発現し、CD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79aまたはCD19、およびHLAクラスIIの発現を欠くと述べる国際細胞療法学会(ISCT)によって確立されたコンセンサスに基づいている。これらのマーカーは、歯髄幹細胞を調査する研究で一般的に使用されています26。染色用の抗体の濃度は、使用する特定の抗体によって異なり、抗体の希釈およびインキュベーション条件25については、製造元の指示(材料表を参照)に従うことが推奨される。
    5. 前述のように、CDマーカーの発現に関する分類基準27,28を確立します:10%未満、発現なし。11%から40%、低発現;41%から70%の範囲、中程度の発現。71%以上、高発現。
    6. さらに、CD34およびCD45に対する抗体と別の細胞アリコートをインキュベートすることにより、造血マーカーがないことを確認します。

6.多系統の差別化

注:次の手順は、歯科幹細胞の骨形成性、脂肪形成性、および軟骨形成性分化のためのプロトコルを概説します。まず、フィブロネクチンでコーティングされた組織培養プレートにウェルあたり1 x 105 細胞の密度で培養物を播種し、完全な培地(CM)で播種します。80%〜90%のコンフルエント度が達成されるまで細胞増殖をモニターしてから、目的の分化プロトコルを開始します。DPSCの多系統分化能を評価するには、細胞を24ウェルプレートに播種し、適切な分化培地で培養することにより、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化プロセスを開始します。

  1. 骨形成分化
    1. まず、DPSCを標準条件下で通常の増殖培地で70%〜80%のコンフルエンスに達するまで培養します。
    2. 細胞から増殖培地を取り出し、1x PBSで細胞を一度洗浄します。骨形成分化培地(ODM)を細胞に加えます。
      注:ODMは、10%FBS、100ユニット/ mLペニシリン、100μg / mLストレプトマイシン、0.25μg / mLアムホテリシンB、50μg / mLアスコルビン酸、10 mMベータグリセロリン酸、および100 nMデキサメタゾンを補充したAlpha Minimum Essential Medium( α-MEM)で構成されています。.
    3. 骨形成培地中の細胞を37°Cで5%CO2とインキュベートします。骨形成培地は2〜3日ごとに交換してください。
      注:14〜21日後、DPSCは骨芽細胞様細胞に分化しているはずです。これは、アルカリホスファターゼなどの骨芽細胞特異的マーカーの発現の増加を確認するか、Alizarin Red S染色などの染色技術を使用して石灰化マトリックスを検出することで確認できます。
    4. 細胞を70%氷冷エタノールと-20°Cで1時間インキュベートして固定します。
    5. 固定細胞を40 nM Alizarin Red S(pH 4.2)染色溶液で室温、暗所で10〜15分間染色します。顕微鏡で染色を視覚化し、骨形成の分化を確認します(図3)。Alizarin Red Sで細胞を染色することにより、分化を確認します。これにより、石灰化を示すカルシウム沈着物が同定されます29,30。
  2. 脂肪分化
    1. 前のセクションで詳述したように、DPSCは、37°Cで5%CO2 の加湿雰囲気で標準条件下で培養します。 細胞が約70%〜80%のコンフルエントに達したときに細胞を継代します。
    2. 培地を吸引し、1x PBSで細胞を一度洗浄します。洗い流した培地を脂肪形成分化培地と交換します。この培地は、通常、DMEM、10% FBS、10 μg/mL インスリン、1 μM デキサメタゾン、200 μM インドメタシン、および 0.5 mM IBMX で構成されています( 「資料の表」を参照)。
    3. 分化培地は3〜4日ごとに交換してください。約3週間後、脂肪原性分化型DPSCをPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で20分間固定します。
    4. 固定した細胞をオイルレッドO(材料表を参照)で染色し、脂肪滴の蓄積を可視化します(図4)。脂肪形成の分化をさらに確認するために、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)やアディポネクチンなどの脂肪形成マーカーの遺伝子発現解析を行います31,32。
  3. 軟骨原性分化
    1. 37°Cで5%CO2 の加湿雰囲気で維持されたDPSCs培養物は、軟骨形成分化に使用されます。細胞が約70%〜80%のコンフルエントに達したときに細胞を継代します。
    2. 培地を吸引し、1x PBSで細胞を一度洗浄します。洗い流した培地を、通常、高グルコースのダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)、1% ITS、100 nM デキサメタゾン、50 μg/mL アスコルビン酸-2-リン酸、40 μg/mL プロリン、および 10 ng/mL トランスフォーミング成長因子-β 3(TGF-β3)を含む 軟骨形成分化培地と交換します( 材料の表を参照)。
    3. 細胞を軟骨分化培地に保持し、2〜3日ごとに培地を交換します。約3週間後、DPSCは軟骨細胞様細胞に分化しているはずです。
    4. 細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)と室温で20分間インキュベートして固定します。固定後、細胞をアルシアンブルーで染色し( 材料表を参照)、顕微鏡で観察して軟骨原性の分化を確認します(図5)。
    5. プロテオグリカンのアルシアンブルー染色や、アグリカン、SOX9、II型コラーゲンなどの軟骨形成マーカーの遺伝子発現解析などの技術を用いて、DPSCの軟骨細胞への分化を確認します33,34。

結果

概説されたプロトコルを成功裏に実行した結果、多系統分化が可能な歯髄幹細胞(DPSC)が得られ、その多能性が実証されました。

生存率アッセイ
DPSCの生存率は、さまざまな時点でTrypan Blue排除アッセイを使用して評価されました。その結果、培養期間を通じて一貫して高い生存率(95%以上)が示され、当社の単離および培養プロトコルの堅牢性が実証されました。

コロニー形成ユニット(CFU)アッセイ
CFUアッセイは、DPSCの自己更新能力を評価するために実施されました。単一細胞懸濁液を低密度でプレーティングし、14日間培養しました。その後、形成されたコロニーを染色して数えました。その結果、多くのコロニーが示され、DPSC集団内の自己複製細胞の割合が高いことが示されています。

セル倍加時間
細胞の倍加時間は、DPSCの成長曲線に基づいて計算され、細胞を特定密度で播種し、定期的にカウントして成長曲線を構築しました。次に、曲線の指数関数的成長フェーズを使用して倍加時間を計算しました。結果は、MSCについて報告されたものと一致する倍加時間を示しており、健康で増殖性の細胞集団を示唆しています(図6)。

フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析では、DPSCの大多数(例:>95%)がCD90、CD73、およびCD105に陽性であることが示され、MSCとしての同一性が確認されました(図7)。さらに、CD45、CD34、およびHLA-DRに対して陽性であった細胞は2%未満であり、造血細胞または内皮細胞の重大な汚染がないことが確認されました。

骨形成分化
骨形成分化が完了すると、細胞は石灰化マトリックスを示し、これはAlizarin Red S染色によって視覚化されます(図3)。染色された細胞に赤色の着色が存在することは、骨形成分化の本質的な特徴である石灰化マトリックスの沈着が成功したことを示しています。分化染色を成功裏に達成できないことは、サンプル収集手順で直面する課題に関連している可能性があります。

脂肪分化
脂肪形成分化の間、DPSCは脂肪細胞の液滴を蓄積し、脂肪形成を示しました。脂肪滴は、オイルレッドO染色で観察できます(図4)。分化が成功すると、細胞内にオレンジレッドに染色された脂肪滴が生じました。

軟骨原性分化
最後に、軟骨分化後、DPSCは、これらのグリコサミノグリカンに結合する重要な軟骨成分であるグリコサミノグリカンを産生しました。軟骨形成に成功した細胞は、染色時に青色を示しました(図5)。

染色手順でそれぞれの色の変化を示さなかった細胞は、分化培地の問題やDPSCの初期品質の問題など、最適でない分化が原因である可能性があります。培地やサプリメントの品質、および使用するDPSCの健康状態と継代数を確保することが重要です。DPSCが骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化することが成功したことで、これらの細胞の多能性が検証され、再生医療や治療応用における可能性が強調されています。

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図1:歯髄幹細胞の単離、特性評価、および分化の概要。 この図は、歯髄幹細胞(DPSC)の単離、特性評価、および分化のワークフローの概略図を示しています。このプロセスは、歯(または歯)の抜歯から始まり、続いて歯髄組織の分離が行われ、そこからDPSCが導出されます。単離後、DPSCはさまざまな特性評価試験を受けて、幹細胞の同一性を確認し、生存率、増殖速度、およびその他の主要な属性を評価します。この図に示されている最終段階は、分化の誘導を含み、DPSCは特定の因子で処理され、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などの特殊な細胞タイプへの変換を導きます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:抜歯した歯からの歯髄回収 (A)歯髄組織抜去用に調製した抜歯。(B)ダイヤモンドバーを使用した抜歯歯の切片化(C)歯髄室からの歯髄組織の除去。(d)外科用ブレードを使用した歯髄組織の断片化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:Alizarin Red S染色(40x)によって証明された歯髄幹細胞(DPSC)の骨形成分化。 鮮やかな赤色の染色は、骨芽細胞の特徴である石灰化マトリックスの沈着を明らかにし、骨形成の分化が成功したことを確認しています。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:オイルレッドO染色によって示された歯髄幹細胞(DPSC)の脂肪形成分化 。真っ赤な液滴の存在は、脂肪細胞の特徴である脂質の蓄積を表しており、脂肪形成の分化が成功したことを確認しています。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:Alcian Blue Staining(40x)によって示された歯髄幹細胞(DPSC)の軟骨形成分化 。濃い青色は、軟骨細胞の特徴であるプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスの存在を示しており、軟骨原性分化の成功を確認しています。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:歯髄幹細胞(DPSC)の細胞倍加時間。 この図は、DPSC の経時的な成長曲線を示しています。細胞は最初に特定の密度で播種され、増殖速度を監視するために細胞数を一定の間隔(x軸で表される)で取得しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:DPSC培養における幹細胞表面マーカーの発現。 この図は、DPSC 上の特定のサーフェス マーカーの表現を示しています。間葉系幹細胞マーカーCD44、CD90、およびCD105は高レベルの発現を示し、これらの細胞に間葉系形質が存在することを示しています。逆に、造血マーカー(CD34およびCD45)および主要な組織適合遺伝子複合体クラスII分子(HLA-DR)の発現はほとんど無視でき、培養物中に造血系統細胞が存在しないことが確認されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、ヒトの落葉歯および永久歯からの歯髄幹細胞(DPSC)の分離、培養、および特性評価を概説しています。これには、これらの細胞の貯蔵および増殖の説明、ならびに骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へのそれらの in vitro 分化能の評価が含まれる35。

Chen et al.36 は、歯周炎、根吸収、歯周炎、歯の骨折などの症状に苦しむ感染した重要なヒトの歯や、過剰歯や不整列な歯など、さまざまな供給源から歯髄幹細胞(DPSC)が得られることを実証しました。この発見は、感染した重要な歯をDPSCの潜在的な供給源として特定したその後の研究によってさらに裏付けられました37,38,39,40。しかし、Bernardiら10は、根の吸収の増加がこれらの幹細胞の生存率に悪影響を与える可能性があることを指摘しました。このプロセスの大きなハードルは、細胞を保存し、抜歯または剥離の直後に始まる細胞の劣化を防ぐことです。さらに、根尖周囲膿瘍、腫瘍、または嚢胞などの重篤な状態に罹患した歯は、幹細胞40,41を抽出するために利用すべきではないことに注意することが重要である。

DPSCは、酵素消化(ED)技術または組織外植片からの増殖(OG)法、別名自発増殖技術14,15を通じて調達することができる。研究者は、これらの戦略を使用して、細胞増殖の効率、または単離された幹細胞の形態学的および表現型属性の維持を調査します17。研究によると、OG法で単離された幹細胞は、幹細胞マーカーの増殖速度が遅く、発現が弱いことがわかっています18。逆に、ED法で単離されたDPSCは、OG法で単離されたDPSCよりも増殖、分化、および追加の表面マーカーの発現の増加を示しました。興味深いことに、OG技術を用いて乳歯から抽出した歯髄未熟幹細胞(IDPSC)は、細胞培養がIDPSCの選択的増殖を促進し、それによって早期分化を防ぐことを示しました42。

DPSCの精製は、高度に再生可能な細胞を得るために重要であり、特定の細胞マーカーが必要です。細胞選択は、蛍光または磁気活性化細胞ソーティング法のいずれかを用いて行われます。前述のマーカー以外にも、DSCs 43の不均一な性質のために、他の多くの表面抗原も使用されています。ただし、亜集団を分離する単一のマーカーは特定されていません。

骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して、DPSCは、その多系統性により、多能性細胞の有望な供給源として認識されています44。親知らずは、しばしばDPSCの抜歯の源であり、最後に発達する永久歯であり、したがって骨髄45よりも成熟していないため、この幹細胞性は源組織の相対的な未熟さの結果である可能性が高い。このプロトコルは、歯髄幹細胞に脂肪形成、骨形成、軟骨形成を誘導することにより、歯髄幹細胞の多能性をうまく探求します。特に、DPSCは、骨形成条件下で培養するとDSPP発現をアップレギュレートする唯一の細胞型であり、歯芽細胞46への将来の分化を示しています。

さまざまな供給源から単離された歯科幹細胞は、多くの増殖および分化の可能性を示しています47。 in vitro システムにおける大きな進歩は、幹細胞の生物学と治療に大きな影響を与えています。これらの進歩にもかかわらず、幹細胞治療をベンチからベッドサイドに変換する際には課題が残っています。幹細胞の生存と安定性には特に注意を払い、保存技術がこれらの細胞の生存能力を損なわないようにする必要があります。歯科用幹細胞研究は動物モデルで有望な結果をもたらしていますが、これらの知見をヒトでの試験に拡大することが急務となっています。歯科用幹細胞は、厳格な研究開発を推進し続けることで、幹細胞バンキングの分野を前進させる上で大きな役割を果たす態勢を整えています。

歯髄幹細胞(DPSC)を単離するための酵素消化アプローチは広く使用されていますが、いくつかの制限があります。何よりも、コラゲナーゼやディスパーゼなどの酵素が誤って細胞膜を損傷し、生きた幹細胞が少なくなる可能性があるため、このプロセスは細胞の生存率を損なう可能性があります17。さらに、この方法は、幹細胞の固有の特性を保存するために重要な重要な細胞外マトリックス(ECM)の分解をもたらすことが多い48。この手順はまた、細胞表面マーカーを変化させる可能性があり、DPSCの正確な同定および特性評価を妨げる可能性があります43。これらの生物学的制約を超えると、このアプローチは時間がかかり、37°Cでの長時間のインキュベーションによる微生物汚染のリスクが高まります。 さらに、酵素バッチ間の不一致は、結果にばらつきをもたらし、単離手順の再現性に課題をもたらす可能性があります。組織消化に適した高品位な酵素は高価であるため、財政的な負担は見逃せません49。さらに、消化の余波で、細胞培養に悪影響を及ぼし、細胞の健康、増殖、分化に影響を与える可能性のある残留酵素活性が見られる可能性があります。最後に、酵素消化が特定のDPSC亜集団を他の集団よりも優先的に分離する可能性は、結果として生じる細胞プールを不注意に歪め、それらの治療可能性に影響を与える可能性がある50。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、ティルヴァッラのプシュパギリ研究センターの所長兼所長であるマシュー・マザヴァンチェリル博士が、研究センターでの手続きの文書化を支援してくれたことに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-イソブチ-L-メチル-キサンチン Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
酢酸 シグマ-アルドリッチ株式会社セントルイス、ミズーリ州63103.USAAS001
アルシアンブルー Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S 染色液Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
アルカリホスファターゼ -染色キットThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific、MA 02451、USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
アスコルビン酸-2-リン酸シグマ-アルドリッチ株式会社セントルイス、ミズーリ州63103.USA012-04802
ベータグリセロリン酸 Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
バイオセーフティキャビネット-層流フードLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 & micro;m )ハイメディア研究所 Ltd.ムンバイ、インドTCP025セルストレーナー
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
コラゲナーゼ I 型Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
コラゲナーゼ I 型Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories Ltd.ムンバイ、インドAT006DMEM
コニカル チューブ (15 または 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL および 50 mL
クライオ凍結容器Thermo Fisher Scientific、MA 02451、USA15-350-50
クライオラベルラベル インド:
クライオバイアル収納ボックス クライオストア 収納ボックス
クライオバイアルサーモフィッシャーサイエンティフィック ,MA 02451,USA
クライオバイアル (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282自立
型培養フラスコ (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
カルチャーフラスコHiMedia Laboratories Ltd.インド・ムンバイTCG4/TCG6T25/T75
培養プレートHiMedia Laboratories Ltd.ムンバイ、インドTCP129/TCP00860 mm/100 mm
歯科用ダイヤモンドディスクコメット SC 29730、アメリカコメット 
歯科用スプーン油圧ショベルBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
デキサメタゾンSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
デキサメトゾンSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
デキサメトゾンSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
ジメチルスルホキシド (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories Ltd.ムンバイ、インドMB106
エタノール-70%サーモフィッシャーサイエンティフィック、MA 02451、米国フィッシャーサイエンティフィック
抽出鉗子 デンツプライシロナ、米国
ウシ胎児血清(FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国F2442-500ML
ウシ胎児血清(FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国F2442-500ML
ウシ胎児血清(FBS)HiMedia Laboratories Ltd.ムンバイ、インドRM9954
ウシ胎児血清 (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
ウシ胎児血清 (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
フィブロネクチンコーティング組織培養プレートCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
フローサイトメトリーバッファーBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories Ltd.ムンバイ、インドTCP017
ハンクス バランス ソルト ソリューション (HBSS)ロンザ グループ リミテッド、4002 バーゼル、スイス
高速歯科用ハンドピース NSK株式会社、東京8216、日本Ti-Max Zシリーズ
馬血清サーモフィッシャーサイエンティフィック、MA 02451、米国
IBMX、または3-イソブチル-1-メチルキサンチンSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
インドメタシンファイザー社 NY 10017、米国
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)サーモフィッシャーサイエンティフィック、MA 02451、米国I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
倒立顕微鏡Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60%)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
イソプロピルアルコール Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
層流フードThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
液体窒素貯蔵タンクCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
マイクロピペットEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
ミニティッシュグラインダーBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep ミニグラインダー
マイナス 80 冷凍庫Blue Star Limited
ノイバウアー計数室Marienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
オイルレッド O ステインSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、V5Z 1B3、カナダ
パラホルムアルデヒド(PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Ca++ および Mg++HiMedia Laboratories Ltd.ムンバイ、インドTS1101
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィックGibco
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツギブコ
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
米国P3813-1PAK1x PBS、pH 7.4
プロリン Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
メスの刃のサイズ 15 Swann-Morton Ltd、シェフィールド、S6 2BJ、UKBDF-6955C
次亜塩素酸ナトリウムHiMediaラボラトリーズ Ltd.ムンバイ、インドAS1024% w/v 溶液
滅菌遠心分離管Tarsons Products Pvt. Ltd.
滅菌容器 -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
滅菌ピペット (2, 5, 10 mLEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
滅菌ピペットとチップEppendorf India Limited
Surgical BladeハンドルBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP ハンドル 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)研究開発D Systems、Inc.MN 55413、USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)研究開発D Systems、Inc.MN 55413、米国
トリパンブルー0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
トリパンブルー 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
トリパンブルー 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
トリプシン-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
ウォーターバスThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D
州、米国 サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州、)

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