ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞の精製のための細胞選別における生ミトコンドリア染色の応用

サマリー

多能性幹細胞に由来する肝細胞は、ミトコンドリアと活性化白血球細胞接着分子(ALCAM、CD166)染色の組み合わせを使用して、細胞選別によって精製できます。

要約

ヒト胚性幹細胞(ES)細胞や人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、その無限の増殖性と多能性により、重篤な臓器の治療に応用できる可能性が期待されています。しかし、ヒトES/iPS細胞を100%純粋な標的細胞に分化させることは、環境に対する感度が高いため困難です。移植後の腫瘍形成は、汚染された細胞、増殖する細胞、未分化細胞によって引き起こされるため、再生医療を安全に実現するためには、高精製技術が不可欠です。腫瘍形成のリスクを軽減するために、ヒトiPS細胞由来肝細胞を対象とした高精製技術が開発されました。この方法は、高ミトコンドリア含有量と細胞表面マーカーALCAM(活性化白血球接着分子)を遺伝子組み換えなしで組み合わせたFACS(蛍光活性化細胞ソーティング)を採用しています。この方法を用いて精製された肝細胞の97%±0.38%(n = 5)は、アルブミンタンパク質の発現を示した。本稿では、ヒトiPS細胞の肝細胞への最新の二次元分化法に適用された、この方法の詳細な手順を提供することを目的としています。

概要

胚性幹細胞と人工多能性幹細胞(ESおよびiPS細胞)は、再生治療の有望な細胞源と考えられています。しかし、これらの細胞を特定の標的細胞型に分化する効率は、同じ細胞株、プロトコール、および実験者1,2,3,4を使用する場合でも、異なる可能性があります。このばらつきは、ヒトES/iPS細胞の環境に対する感度が高いことに起因していると考えられます。そのため、純粋な標的細胞を安定して得ることは現状では困難です。安全性の高い再生医療を実現するためには、治療用細胞から増殖細胞や未分化幹細胞を排除することが重要であり、標的細胞の高度な精製技術が不可欠^{である5,6,7}。

セルソーターは、個々の細胞を瞬時に解析し、蛍光シグナルの強度に基づいて目的の生細胞を選別する装置で、有望なソリューションを提供します。これは、細胞タイプ特異的な表面マーカーの抗体染色、または細胞タイプ特異的なレポーター遺伝子発現を利用することで達成できます。この技術を用いて、多能性幹細胞由来心筋細胞^8,9,10および肝細胞^11,12を精製する方法について、いくつかの報告があります。服部らは、セルソーターを用いた革新的なミトコンドリア精製法を開発した¹³。心筋細胞はミトコンドリアの活性を通じて高いエネルギー需要を持つという事実を利用して、生きたミトコンドリア指標色素TMRM(テトラメチルローダミンメチルエステル)で細胞を染色するために使用できます。これにより、さまざまな細胞タイプを含むヒトES細胞由来胚様体からFACSによる心筋細胞を標識し、高度に精製することができます。腫瘍原性の欠如は、精製された心筋細胞を用いた奇形腫形成アッセイによって確認されました。さらに、山下らは、ミトコンドリア活性が高くALCAM陽性発現を持つ画分を単離することにより、ヒトES細胞由来胚様体から肝細胞を精製する方法を思いがけず発見しました¹⁴。この方法の理論的根拠は、肝細胞は、栄養代謝および解毒のためのATPの大量消費のために、比較的多くのミトコンドリアも有しており¹⁵、肝細胞は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるALCAMを発現し、これは細胞接着および移動¹⁶に役割を果たすというものである。

従来の多能性幹細胞由来肝細胞の高度に精製する方法は遺伝子改変が必要であり、非遺伝的精製法は効率が低かった¹⁷。ミトコンドリアの非遺伝的法は、高純度を達成するメリットがあります。肝前駆細胞が必要な場合、CD133およびCD13またはDlk1ベースの方法^18,19を選択することができる。ゲノム編集技術の精度は向上していますが、予期せぬゲノム変化(発がんなど)の潜在的なリスクを完全に排除することはできません。ミトコンドリアの活性に基づく方法は、遺伝子組み換えを伴わず、そのようなリスクから解放されることができます。

新生児ラット心筋細胞における種々のミトコンドリア指標を調べた結果、TMRMは24時間以内に完全に消失することが観察されたが、他の色素は少なくとも5日間は残った¹³。さらに、TMRMおよびJC-1は、3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイで評価した場合、細胞生存率に影響を与えなかったが、他の色素は細胞生存率に対して異なる効果を示したことに注意することが重要です¹³。TMRMはより高い安全性を示します。

これまでに、3次元(3D)胚様体形成と比較して、より効率的な分化誘導方法として、いくつかの2次元(2D)分化法が開発されてきました。これは、段階的な分化誘導化合物またはサイトカインを、3D空間ではなく2D平面上の細胞に均一に投与できるためです。本研究では、先に報告された方法²⁰ を改変し、ヒトiPS細胞由来肝細胞への分化を誘導した。ここでは、ヒトiPS細胞由来の肝細胞を最新の2次元分化・精製する手順について詳しく説明します。

プロトコル

本研究では、市販のヒトiPS細胞(253G1系統)を使用しました( 材料表参照)。

1. ヒトiPS細胞のメンテナンス

1. 0.25 μg/cm² iMatrix-511 をコーティングした培養皿に、AK02 培地でヒト iPS 細胞をフィーダーフリー状態で保持します ( 材料表を参照)。

2. 2D培養におけるヒトiPS細胞の肝臓分化

注:肝臓分化の毎日のスケジュールについては、 図1A を参照してください。.プロセス全体を通して、6ウェル培養プレートを使用し、指定された洗浄液または培地2 mLを各ウェルに加えます。細胞培養条件を湿度100%、_CO25%、_O20 %、37°Cで維持します。

1. 6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの基底膜マトリックス(PBS(-)で1/25に希釈)をコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。
2. 10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加したAK02N培地を使用して、20,000〜30,000細胞/cm²の密度でヒトiPS細胞をコーティング皿に継代します( 材料の表を参照)。翌日、Y-27632を含まない培地を交換し、さらに2日間培養します。
3. 細胞をRPMI-1640培地で一度洗浄します。培地をRPMI-B27-Glu(RPMI-1640 + 2% B27インスリン + 1% ジペプチドL-アラニル-L-グルタミン)に交換し、3-6 μM CHIR-99021および100 ng/mLアクチビンAを24時間補充することにより、内胚葉の分化を開始します( 材料の表を参照)。
4. 培地をRPMI-B27-Gluに50 ng/mLのアクチビンAを添加したものを24時間交換します。
5. 肝臓前駆細胞の分化を誘導するには、培地を RPMI-B27-Glu に 1% ジメチルスルホキシド (DMSO) を 5 日間補充して交換します。
6. 肝細胞の成熟を促進するには、肝細胞成熟培地に切り替えます:10 μMヒドロコルチゾン21-ヘミスコハク酸、8.3%トリプトースリン酸ブロス、100 nMデキサメタゾン(DEX)、50 μg/mLナトリウム-L-アスコルビン酸、0.58%インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、8.3%ウシ胎児血清(FBS)、2 mMジペプチドL-アラニル-L-グルタミン、および100 nM N-ヘキサノ-トライ-イル-(6)-アミノヘキサノアミド(ジヘキサ)を含むLeibovitzのL-15培地( 材料の表を参照)。
7. 20日間、2日ごとに媒体を交換します。分化開始から約27日後に細胞を選別します。

3. ヒトiPS細胞由来肝細胞の精製のための細胞調製

1. 肝臓分化細胞をウェルあたり2 mLのPBS(-)で洗浄します。
2. 0.1% コラゲナーゼ、0.083% トリプシン、10 μM ROCK 阻害剤 (Y-27632)、20 nM シクロスポリン A、および 50 μg/mL の S-L-アスコルビン酸ナトリウムを含む 1 ウェルあたり 1 mL の酵素溶液を Ads バッファー (116 mM NaCl、12.5 mM NaH₂PO₄、20 mM HEPES、5.4 mM KCl、5.6 mM グルコース、および 0.8 mM MgSO4、pH 7.35) に添加します ( 材料の表を参照)。37°Cで約2時間水平に回転させて、細胞をプレートから分離します。
3. 顕微鏡で細胞が剥離し、丸みを帯びていることを確認した後、穏やかなピペッティングで単一細胞に分散させ、50mLのチューブに回収します。
4. 細胞を200 x g で5分間、18°Cで遠心分離し、ペレット化します。吸引器を使用して上清を取り除きます。
5. 100 nM TMRM(テトラメチルローダミン、メトルエステル)を含む5 mLの肝細胞成熟培地に細胞を分散させることにより、細胞のミトコンドリアを染色します( 材料の表を参照)。37°Cで30分間インキュベートし、アルミホイルで包んで光から保護します。
6. 細胞を200 x g で5分間、18°Cで遠心分離し、ペレット化します。上清を取り除きます。
7. 2% FBSを含む1〜5mLの冷たいAdsバッファーで細胞を再懸濁します。
8. 0.4%トリパンブルー溶液とセルカウントプレートを使用してセル数をカウントします。
9. 細胞を200 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、ペレット化します。上清を取り除きます。
10. 抗ALCAM抗体(一次抗体、 材料表参照)をAdsバッファー中で1:50の比率で希釈し、希釈した抗体を10^{6細胞あたり} 100 μL加えます。細胞を氷上で50分間染色します。一次抗体で染色されていない細胞をネガティブコントロールとして調製します。
11. 2%FBSを含む冷たいAdsバッファーで細胞を2回洗浄します。
12. Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (secondary antibody, see Table of Materials) を Ads バッファーで 1:100 の比率で希釈し、希釈した抗体を 10 個⁶ 細胞あたり 100 μL 加えます。細胞を氷上で30分間染色します。一次抗体で染色しなかった細胞を二次抗体で染色します。
13. 2%FBSを含む冷たいAdsバッファーで細胞を2回洗浄します。
14. 細胞をAdsバッファーに再懸濁し、スナップキャップセルストレーナー(35 μmメッシュ)でろ過し、FACSで選別して大きな細胞塊や破片を除去します。

4. ヒトiPS細胞由来肝細胞のFACS解析と選別

1. 製造元の指示に従って、細胞選別用にFACSマシンをセットアップします( 材料の表を参照)。
   注:85μmまたは100μmのノズルサイズと、肝細胞用のNDフィルター2.0を使用してください。ALCAM の Alexa Flour 488 の検出には FITC チャンネルを、ミトコンドリアの TMRM 蛍光の検出には PE チャンネルを使用します。
2. FSC(前方散乱)およびSSC(側方散乱)電圧を調整して、細胞集団を適切に視覚化します。
3. FITCおよびPE蛍光チャンネルの電圧を調整します。標識されていない細胞から開始し、細胞集団を各チャネルプロットの下部の中央に配置します。ラベル付けされたセルがプロット内に適切に配置されていることを確認します。
4. ダブレットを排除するための一般的なゲーティング戦略を使用する: 主要なFSC-A と.SSC-A母集団(図2A)、続いてFSC-H と。-W、次にSSC-H 対。-W (図 2B、C)。
5. TMRM^hi および ALCAM⁺ 集団 ( 図 2E の P2) をゲートして、肝細胞を選別します。TMRM^hi と ALCAM^- の集団 ( 図 2E の P1) をゲートして、非肝細胞を選別します。選別した肝細胞と非肝細胞を、肝細胞成熟培地が入った15 mLの採取チューブに集めます。
6. 選別した細胞を含むコレクションチューブを200 x g で18°Cで5分間遠心分離します。
7. 上清を除去し、細胞を肝細胞成熟培地に再懸濁します。
8. マイトマイシンC処理マウス胚性線維芽細胞(MEF)またはゲル状基底膜マトリックスに、10 μM Y-27632および20 nMシクロスポリンAを添加した肝細胞成熟培地で細胞を播種し、37°Cの_CO2 インキュベーターで細胞を5日間培養します。

5. ヒトiPS細胞由来肝細胞の検出のための免疫細胞化学

1. 培養した細胞をPBS(-)で選別後、5日間洗浄します。
2. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で5分間固定します。
3. TBS-Tバッファー(1x TBS、1% Tween 20)で細胞を2回洗浄し、パラホルムアルデヒドを除去します。
4. 細胞を0.1% Triton X-100希釈TBS-Tバッファーと室温で5分間インキュベートします。
5. 細胞をTBS-Tバッファーで2回洗浄し、Triton X-100を除去します。
6. 市販のブロッキング溶液( 材料表を参照)を細胞に室温で30分間加えます。
7. アルブミン(肝細胞マーカー)およびヒト核抗原(hNA、 材料表を参照)に対する一次抗体を、ブロッキング溶液で1:50に希釈して添加します。
8. 細胞を4°Cで一晩インキュベートします。細胞をTBS-Tバッファーで2回洗浄します。
9. 二次抗体を添加する:Alexa Fluor 488ロバ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 546ロバ抗マウスIgGをブロッキング溶液で1:100に希釈してください( 材料の表を参照)。
10. 細胞を室温で30分間インキュベートします。細胞をTBS-Tバッファーで2回洗浄します。
11. 蛍光顕微鏡でアルブミン陽性細胞とhNA陽性細胞をカウントすることにより、肝細胞の純度を評価します。P1 集団と P2 集団の両方について、hNA 陽性細胞あたりのアルブミン陽性細胞の割合を計算します。

結果

ヒトiPS細胞が2D培養によって肝細胞に分化する過程(図1A)と代表的な細胞特徴(図1B)の時系列を示します。分化12日目頃、細胞は肝細胞の特徴である多角形の細胞形状と丸い核を示し始めました。一部の肝細胞も多核形成を示しました。

FACS解析は、分化27日目に細胞を用いて行った。ALCAM⁺ 集団を同定するために、最初の抗ALCAM抗体がある場合とない場合の比較プロットをそれぞれ 図2D、Eに示します。2D培養による肝臓分化の誘導により、この実験では肝細胞の集団(P2)が10.1%であることが判明し、3D胚様体形成法で得られた0.8%(データは示さず)から大幅に増加しました。

選別したP1細胞とP2細胞をマイトマイシンCで処理したマウス胚性線維芽細胞で培養したところ、P2細胞は緻密な球状のコロニ...

ディスカッション

肝細胞は、栄養素の代謝と解毒におけるそれらの機能のために、他の細胞タイプと比較して比較的多くのミトコンドリアを持っています¹⁵。ALCAMは免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、細胞の接着と遊走に役割を果たします。それは、肝臓細胞、上皮細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、およびニューロン細胞¹⁶を含む様々な細胞タイプで発現される。ミトコンドリアを用いた方法とALCAM抗体の組み合わせにより、ヒトiPS細胞由来肝細胞の同定に成功しました。

精製した肝細胞の分泌機能や酵素活性を特徴づけるアッセイは行わなかったが、精製したヒトiPS細胞由来肝細胞におけるCYP3A4遺伝子のmRNA発現を確認した。さらに、ヒトES細胞由来の胚様体から単離されたTMRM(高)およびALCAM(+)を有する肝細胞集団では、ES細胞由来心筋細胞と比較して、肝細胞関連遺伝子セット(VTN、 SERPINA1、 CYP1A1、 FGB、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
253G1ヒトiPS細胞株	理化学研究所バイオリソース研究センター	HPS0002
4%パラホルムアルデヒド	富士フイルム和光純薬	163-20145
アクチビンA溶液 ヒト 組換えナ	カライテスク	18585
抗核抗体、クローン 235-1	Chemicon	MAB1281	ヒト核抗原
に対する抗体 B-27 Supplement (50x)、無血清	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell Sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
シクロスポリンA	富士フイルム和光純薬	035-18961
コラゲナーゼ	富士フイルム和光純薬	034-22363
コーニング GFR(Matrigel Growth Factor Reduced) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	ゲル状基底膜マトリックス
CultureSure Y-27632	富士フイルム和光純薬	036-24023	ROCK阻害剤
デキサメタゾン	富士フイルム和光純薬	047-18863
ジメチルスルホキシド(DMSO)	フイルム和光純薬	047-29353
ロバ抗ヤギIgG(H+L)交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11055
ロバ抗マウスIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
ロバ抗ウサギIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナー付き スナップキャップ	コーニング	352235
ウシ胎児血清	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	ジペプチド L-アラニル-L-グルタミン
ヒト/マウス/ラット/イヌ ALCAM/CD166 抗体	R&D Systems	AF1172
ヒドロコルチゾン 21-ヘミスコハク酸ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 シルク	ニッピ	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	ブロッキング溶液
ITS-G サプリメント(×100)	富士フイルム和光純薬	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	富士フイルム和光純薬	128-06075
N-ヘキサノイック-トライ-イル-(6)-アミノヘキサン酸アミド(ジヘキサ)	トロントリサーチケミカルズ	H293745
ポリクローナルウサギ 抗ヒトアルブミン	ダコ	A0001
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	富士フイルム和光純薬工業	189-02025
L-アスコルビン酸ナトリウム	ナカライ・テスク	03422-32
StemFit AK02N	リプロセル	RCAK02N
TBS (10個入り)	ナカライテスク	12748-31
テトラメチルローダミン・メチルエステル(TMRM)	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
トリパン ブルー ソリューション	ナカライ テスク	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
トリプトースリン酸ブロス溶液	Sigma-Aldrich	T8159