Method Article

キメラ低分子ノンコーディングRNAの計算解析チュートリアル:ターゲットRNAシーケンシングライブラリ

DOI:

10.3791/65779

⸱

December 1st, 2023

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1Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

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ここでは、 in vivo RNA:RNA相互作用の研究に使用されるキメラRNAシーケンシングデータを分析するためのバイオインフォマティクスパイプラインのインストールと使用を実証するプロトコルを紹介します。

Abstract

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近年、マイクロRNA(miRNA)などの低分子ノンコーディングRNA(sncRNA)と標的RNAとのin vivo 遺伝子制御相互作用の理解が、キメラRNAの形成とその後のシーケンシングライブラリーを通じて、架橋とそれに続くライゲーションを使用してsncRNA:標的RNAの相互作用を捕捉する生化学的アプローチによって進められています。キメラRNAシーケンシングのデータセットは、miRNA予測ソフトウェアよりもゲノムワイドで曖昧さの少ないインプットを提供しますが、このデータを意味のある実用的な情報に抽出するには、追加の分析が必要であり、計算のバックグラウンドを持たない研究者を思いとどまらせる可能性があります。このレポートでは、エントリーレベルの計算生物学者が最新のオープンソースソフトウェアツールであるSmall Chimeric RNA Analysis Pipeline(SCRAP)をインストールして適用するためのチュートリアルを提供します。プラットフォームの要件、更新、およびパイプラインの手順と主要なユーザー入力変数の操作について説明します。生物学者がキメラRNAシーケンシングアプローチから洞察を得るための障壁を減らすことは、複数の生物学的状況における制御性sncRNAと標的RNAの相互作用の発見に基づく研究の出発点となる可能性があります。

Introduction

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低分子ノンコーディングRNAは、分化や発生、シグナルプロセシング、疾患などの多様なプロセスにおいて、一連の遺伝子からの発現を調整する転写後の役割について高度に研究されています1,2,3。マイクロRNA(miRNA)を含む遺伝子制御低分子ノンコーディングRNA(sncRNA)の標的転写産物を正確に決定する能力は、基礎レベルと翻訳レベルの両方でRNA生物学の研究にとって重要です。miRNAシード配列とその潜在的な標的との間に予想される相補性を利用するバイオインフォマティクスアルゴリズムは、miRNA:標的RNA相互作用の予測に頻繁に使用されています。これらのバイオインフォマティクスアルゴリズムは成功していますが、他の場所でレビューされているように、偽陽性と偽陰性の両方の結果を隠す可能性もあります4,5,6。最近、いくつかの生化学的アプローチが設計され、実装されており、in vivo架橋とそれに続くライゲーションステップの組み込みにより、in vivoでのsncRNA:標的RNA相互作用の明確かつ半定量的な決定が可能になり、sncRNAを標的に物理的....

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Protocol

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注:プロトコルは、SCRAPを使用してキメラRNAシーケンシングライブラリを解析するために必要なソフトウェアのダウンロードとインストールから始まります。

1. インストール

  1. SCRAP をインストールする前に、分析に使用するマシンに依存関係 Git と Miniconda をインストールします。Git は既にインストールされている可能性があります。たとえば、Mac OSXプラットフォームでは、どのgitを使用してこれを検証し、「 git 」ユーティリティが存在し、このディレクトリにインストールされていることを確認します。Minicondaが どのcondaを使用してインストールされているかを確認します。何も返されない場合は、Miniconda をインストールします。Miniconda のインストールには 400 MB のディスク容量が必要です。
    1. Miniconda をインストールする方法はいくつかあり、プラットフォームによって異なります。Windows、MacOS、Ubuntu へのインストールに関する詳細な手順については、Meffert Lab GitHub リポジトリ [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] の PLATFORM-....

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Results

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CLEAR-CLIP9 を用いて作製した既公開のシークエンスデータセットについて、SCRAPの改変版(rRNAフィルタリングの改良を施したSCRAPリリース2.0)で検出したsncRNA:target RNAの結果を 図2 および 表1に示します。ユーザーは、SCRAPでのピークコールによる信頼性の高い相互作用の分離後に発生するイントロン領域との相対的な分画miRNA相互作用の減少を実感できます。SCRAPを使用した分析からの追加データは、このパイプライン6の最初の公開でも入手できます。実験的アプローチによっては、結果のアーチファクトを減らすために、調製されたキメラRNAライブラリーからのシーケンシングデータのフィルタリングが必要になる場合があります。シーケンシングライブラリの生化学的調製が最適でない、および/またはシーケンシングデータのフィルタリングが最適でないと、Argonauteによって結合されたsncRNAおよび標的RNAのライゲーションから.......

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Discussion

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sncRNA:標的RNA相互作用の分析のためのSCRAPパイプラインの使用に関するこのプロトコルは、計算分析に入ろうとしている研究者を支援するように設計されています。チュートリアルの完了は、このパイプラインのインストールと使用、およびキメラRNAシーケンシングライブラリから得られたデータを分析するためのそのアプリケーションに必要な手順を通じて、エントリーレベル以上の計算経験を持つ研究者を導くことが期待されています。このプロトコルの完了に不可欠な手順には、SCRAPの正しいリファレンスインストールと実行が含まれますが、これは時間がかかり、特にAnacondaを使用した依存関係のインストールやコマンドライン引数の入力中に注意を払わなかった場合、エラーの原因となる可能性があります。

ここでは、キメラsncRNA:標的RNAシーケンシングライブラリの解析にSCRAPパイプラインを実用化するためのヒントとステップに特に焦点を当てています。SCRAPは、sncRNA:標的RNA相互作用の検出において、他のキメラRNA解析プラットフォームよりも優れていることがわかっています

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Disclosures

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著者は何も開示していません。

Acknowledgements

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BH Powell氏やWT Mills IV氏など、有益な議論をしてくれたMeffert研究所のメンバーに、パイプラインの設置と実施に関する重要なフィードバックをいただいたことに感謝します。この研究は、Braude Foundation賞、Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program、Blaustein Endowment for Pain Research and Education賞、NINDS RO1NS103974およびNIMH RO1MH129292 to M.K.M.の支援を受けました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ゲノムUCSC、ゲノムブラウザ、N / Ahttps://genome.ucsc.edu/ または
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ LinuxUbuntuUbuntu、20.04または22.04、LTS推奨
、Mac、AppleMac OSX(>11)
プラットフォームのセットアップ、GitHub、N / A、https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]
SCRAPパイプラインGitHubN/A
https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP UnixシェルUnixオペレーティングシステムbash >=5.0
UnixシェルUnixオペレーティングシステムzsh(5.9を推奨)
WindowsWindowsWSL Ubuntuの20.04または22.04 LTS
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References

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  1. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  2. Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury resp....

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Chimeric RNA SequencingSmall Noncoding RNATarget RNA InteractionsComputational PipelineSCRAP SoftwarePeak CallingReference GenomeRNA Sequencing LibrariesmiRNA InteractionsGenomic Visualization

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