Method Article

森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

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ここでは、森林のウッドボーラーから昆虫病原性真菌を取得するためのプロトコルと、鞘翅目モデル昆虫を使用してそれらの昆虫病原性活性を評価するための代替方法を示します。この方法は、自然林の木材を退屈する害虫から昆虫病原性真菌資源を探索するのに効率的で便利です。

Abstract

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森林ウッドボーラー(FWB)は、世界中で深刻な樹木の損傷と経済的損失を引き起こしています。FWBの出現期間中の昆虫病原性真菌(EPF)の放出は、化学的防除の許容可能な代替手段と考えられています。しかし、農業害虫とは対照的に、FWBのEPF資源は大幅に調査されていません。この論文では、野生の Monochamus alternatus 個体群を例に、FWBからEPFリソースを探索するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、トラップの割り当ては Mで餌付けされました。異なる集団への 代替 誘引物質は、カブトムシの出現期間中に、自然感染症状を伴う適切なサンプルの収集を保証しました。外皮を細かく解剖し、選択的な培地に置いた後、カブトムシの体の各部分から真菌種を単離し、分子形質と形態学的形質の両方に基づいて同定しました。

いくつかの真菌種は、健康な M. alternatus の胞子懸濁液による再感染により、寄生性EPFとして認定されました。 M. alternatus の行動表現型を走査型電子顕微鏡を用いて観察し、さらに鞘翅目モデル昆虫 Tribolium castaneumの行動表現型と比較した。両方の甲虫種で一貫した寄生表現型を示すEPFについて、 Tでのそれらの活性の評価。 カスタネウム は、 M. alternatusの将来の研究に致死性に関する貴重な情報を提供しました。このプロトコルは、中国の M. alternatus 個体群について新たに報告されたEPFの発見に役立ち、他のFWBからより多くのEPFリソースを探索するための効率的なアプローチとして適用できる可能性があります。

Introduction

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害虫による荒廃は、森林と農業の生態系の両方に大きな生態学的および経済的損失をもたらしました。ほとんどの農業害虫は、宿主植物に損害を与えながら、天敵や人工的な防除剤にさらされます。それどころか、森林ウッドボーラー(FWB)は、宿主樹の幹1内で全発生サイクルをほぼ完了するため、野生野外でFWBから効率的な生物防除生物を探索するための大きな課題が提起されています。さらに悪いことに、FWBは多数の植物病原体2を保有しているか、これらの病原体と密接な関係を潜在的な媒介者として3,4持っており、森林の健康に対するFWBの悪影響を劇的に増幅しています。化学殺虫剤の過剰使用はFWBの重症度を緩和することができるが、殺虫抵抗性の出現5,6はそれらの環境への適用を制限する。特定のケースでは、昆虫寄生虫、捕食性節足動物、および昆虫病原性微生物が生物防除剤としてFWB7の分布領域に放出され、化学的防除8,9,10

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Protocol

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1. M. alternatus からの菌類の単離(図1)

  1. カブトムシのサンプルを採取する
    1. マツノコギリカブトムシMを収集します。商業用トラップ(資料表を参照)を使用して、自然に感染した松林のカブトムシ個体群の予測出現期間の前に誘引剤を餌にしたオルタナタス。
      注:この研究では、カブトムシは中国南部の5つの地理的地域(湖州/浙江省、梁山/四川省、厦門/福建省、韶関/広東省、楡林/広西チワン族自治区)から収集されました。トラップの仕掛けは、上から順に、丸型天板(直径50cm)、十字型パネル(幅35cm、長さ66cm)、漏斗(上丸型35.5cm、底丸型5.5cm)、コレクションカップ(直径10.5cm、長さ26.5cm)です。宿主の揮発性物質(例えば、エタノールおよびα−ピネン)および凝集フェロモン(2−ウンデシルオキシ−1−エタノール)は、ベイト30として使用される。
    2. 試料を実験室に移す前に、試料にラベルを貼ってください。各カブトムシを新鮮な小枝で個々の滅菌チューブに入れます。小枝は2日ごとに新しい小枝と交換してください。
    3. ....

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Results

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Mからの真菌分離株の単離と同定。 オルタナタス
誘引トラップの助けを借りて、多数の(合計約500匹のカブトムシ) のM。 alternatus は5つの地理的地域から収集されました。昆虫病原性真菌による感染の典型的な症状を持つカブトムシの死体が選ばれました。次に、すべてのカブトムシの体外皮を、プロトコルステップ1.3で説明したようにいくつかの位置に解剖しました。その結果、600を超える真菌分離株がさまざまな体位から分離されました。これにより、マツノコギリハムシに対する病原体をスクリーニングするためのより豊富な真菌候補が可能になります。ITS領域の塩基配列決定により、これらの分離株は15の真菌属と39の種に分類できることが予備的に明らかになりました。さらに、 M. alternatus 成虫の地理的集団間で真菌群集の構成に大きな違いがありました。真菌種、 Aspergillus austwickii、 Akanthomyces attenuatus (syn. Lec.......

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Discussion

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FWBの異なる地理的集団は、EPF種の局所的な気候要因への長期的な環境適応および宿主昆虫の特定の遺伝子型集団44,45のために、天然の昆虫病原性真菌とのさまざまな相互作用を発達させる可能性がある。サンプリングサイトを複数の昆虫発生地域に拡大することは、農業害虫に関する先行研究で説明されているように、自然宿主から多様なEPFの株または種を獲得する可能性を高めるのに役立つ46。このプロトコルでは、誘引剤を餌にしたトラップの助けを借りて、マツノコギリハムシM.alternatusは、高温多湿が高いことを考慮すると、新規EPFを探索するための理想的で豊富な資源貯蔵庫と見なされている中国南部の5つの異なる場所で、緯度を越えたレベルで収集されています。この省力化方法は、カブトムシを生きたまま捕獲し、カブトムシは別々の滅菌チューブで個別に実験室に輸送する必要があります。カブトムシの自然.......

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Disclosures

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著者は、利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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本研究は、National Key Research and Development Program of China(2021YFC2600100)およびThe Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY21C040001)の支援を受けて行われました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL、2 mL遠心分離管バイオシャープBS-15-M
10 & マイクロ;LピペットチップSangon BiotechF601216
10 & micro;L、20 µL、100 µL、200 µL、1,000 µLピペットレイニン
1,000 & マイクロ;LピペットチップSangon BiotechF630102
2 mL 極低温バイアルコーニング430659
20x PBSバッファーSangon BiotechB548117-0500
200 µL ピペットチップSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL チューブNest602052
50% グルタルアルデヒド溶液Sangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
アガロースサンゴン バイオテックA610013
無水エタノールJkchemicalLB10V37
生化学栽培キャビネット上海 恒LRH-250F
クロロホルムジュワ61553
商業用カブトムシ トラップFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
ゲル イメージャーバイオ・ラッドGelDoc XR+
グリセロールサンゴンバイオテックA600232
高速冷蔵遠心分離機シグマD-37520
高圧蒸気滅菌ポットメトラー・トレドJA5003
イソプロピルアルコール一般試薬G75885B
核酸色素サンゴンバイオテックA616696
光学顕微鏡、OMライカDM2000
パラフィルムパラフィルムPM996
PCR メーターHeal ForceTrident960
ペニシリン GマークリンGB15743
ポテト デキストロース 寒天、PDAOxoidCM0139
ポテト デキストロース ブロス、PDBSolarbioP9240
プライマーSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
迅速真菌ゲノムDNA分離キットSangon BiotechB518229
走査型電子顕微鏡、SEM日立S-3400N
ストレプトマイシンマークリンS6153
テトラサイクリンマークリンT829835
Tween-80MarklinT6336
真空凍結乾燥機YamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-t....

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Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

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