微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

Summary

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。

Abstract

有益なプロバイオティクス細菌は、宿主で重要な役割を果たし、感染症に対する免疫を含むさまざまな健康上の利点を提供します。ラクトバチル科は、プロバイオティクスの特性が確認されたグラム陽性菌で構成されています。この研究では、ラクトバチル科の種をモデルとして利用し、細胞凝集の研究におけるシングルセルハイスループット分析の有効性を実証します。焦点は、食事からの単純な炭水化物に対するこれらの有益な種の反応を分析することです。

この研究は、イメージングフローサイトメトリー(IFC)が、炭水化物の存在下と非存在下でのプロバイオティクス細菌の集合における基本的な違いをどのように克服できるかを示しています。IFCは、従来のフローサイトメトリーのパワーとスピードを顕微鏡法の空間分解能と組み合わせることで、有益な細菌株と病態のライブラリー全体で表現型的に定義された方法で、複雑な形態測定を高速に行うことができます。このプロトコルは、ラクトバクラ科の種の自己凝集に関する洞察を提供し、食事性炭水化物に対するそれらの応答に光を当て、これらのプロバイオティクス細菌の有益な効果の背後にあるメカニズムの理解に貢献します。

Introduction

細菌の自己凝集は、バイオフィルム形成の主要なステップと考えられています。このプロセス(自己凝集または凝集とも呼ばれる)では、同じ種類の細菌が多細胞塊を形成し、最終的に培養チューブの底に沈殿するか、標的組織または表面に付着します¹。

自己凝集は広く観察された現象であり、これまでに日和見病原体Acinetobacter baumannii²、歯科病原体Aggregobacter actinomycetemcomitans³、新興病原体Burkholderia pseudomallei⁴などのグラム陰性病原体で示されています。自己凝集は、いくつかのプロバイオティクスグラム陽性株5,6,7,8でも記載されています。Lactobacillus (L.) acidophilusでは、自己凝集は部分的にS層タンパク質によって媒介され、キシラン^....

Protocol

.ast ファイルは、 例として Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) のテンプレートを含み、 Supplementary Coding File 1 で提供されています。

1. 培地の準備

1. 製造元の指示に従って乳酸桿菌MRSブロス(1 Lの脱イオン水に55 g)と1.5%(w / v)寒天を含む乳酸桿菌MRS寒天プレートを準備します( 材料の表を参照)。オートクレーブ滅菌後、培地は直接使用する準備ができているか、4°Cで保存することができます。
2. 50%(1Lの脱イオン水に15 g)トリプシン大豆ブロス(TSB)( 材料の表を参照)を調製し、TSBに1%(w / v)D-(+)-グルコースと1%(w / v)D-(+)-ラフィノースを補給し、次にオートクレーブして培地を滅菌します。汚染を避けるために、4°Cで保存することをお勧めします。
3. グルコースを含む緩衝培地の場合、1%(w / v)D-(+)-グルコース、5 mMのリン酸カリウム一塩基性カリウムと二塩基性カリウム、および100 mM MOPS(3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸、 材料表を参照)pH 7を添加したTSBを調製します。....

Results

この結果は、この方法がLAB細菌の食事糖に対する自己凝集の違いを容易に測定できることを示しています。個体を凝集体から分離することにより、この方法は、食餌からの発酵性または非発酵性の糖に応答して、すべてのイベントのうち、凝集イベントの人口の割合を計算することを可能にする。さらに、治療間で凝集体の母集団の平均サイズに違いがあるかどうかを測定することができました。

図3の代表的な画像は、各LAB細菌のゲーティング戦略を示しています。LGGおよびL.paracaseiでは、単一細胞、小さな凝集体、大きな凝集体、および鎖が検出されました(図3)。しかし、鎖と大きな骨材を分離することはできませんでした。

図4の代表的な画像は、発酵性または非発酵性の糖に応答して提示される異なるLAB株間の凝集特性にかなりの変動があることを明らかにし、これは集団の.......

Discussion

フローサイトメトリーは、真核細胞の蛍光強度を定量化するために広く使用されている方法ですが、細菌細胞のサイズが大きいか凝集体が小さいため、細菌細胞の正確な測定が得られない場合があります。これらの要因は、さまざまな条件での自己凝集の正確な定量化と凝集体形成の基礎レベルに大きな影響を与える可能性があります。これに対処するために、イメージングフローサイトメトリー(IFC)を使用して、炭水化物がプロバイオティクス細菌の凝集にどのように影響するかをより詳細に調べました⁵。IFCは、サンプルごとに多数のデジタル画像を収集し、数値画像ベースの特徴を抽出することにより、従来のフローサイトメトリーにおける大きなサンプルサイズの統計的有意性と標準的な顕微鏡法の細胞ごとの情報量を組み合わせます¹⁶。

これまで、IFCは、枯草菌における抗生物質産生やデュアルスピーシーズバイオフィルムの組成など、さまざまな細菌の挙動を研究するために使用されてきた^{18,19<.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL培養チューブ	Falcon	352051
15 mL遠心分離チューブ	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose五水和物	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	詳細については、https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	詳細については、https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸	、フィッシャーバイオ試薬	、BP308-500
リン酸カリウム二塩基性	、フィッシャーサイエンティフィック、174.18 g / mol	BP363-1
リン酸カリウム一塩基性	シグマ、136.09 g / mol	、P0662-500G