細胞創傷治癒アッセイの信頼性を向上させるための、安定した再現性のある無細胞ギャップを自動的に作成するツール

サマリー

インタラクション体験設計とユーザー要件分析を組み込むことで、再現性、信頼性、実用性、細胞完全性、ユーザーエクスペリエンスの観点から細胞創傷治癒アッセイを強化する革新的な細胞スクレーパーを導入します。

要約

創傷治癒アッセイにおける細胞移動測定の信頼性は、一般的な方法論的不安定性、すなわちチップベースの方法によってしばしば損なわれます。これらの制限に対処するために設計された革新的な機器をご紹介します。当社の新しいセルスクレーパーは、現在のアプローチを凌駕し、より一貫性のある安定した無細胞ギャップを生み出します。生物学的実験を繰り返すと、セルスクレーパーによって生成される無細胞ギャップは、チップベースの手法と比較して、よりまっすぐなエッジと均一なサイズと形状を示すことが明らかになりました（p < 0.05)。製品設計の面では、セルスクレーパーは実験室環境に適した洗練された配色を誇り、実験結果のモニタリングを強化し、オートクレーブによる滅菌を可能にして再利用することができます。特に、処理後、細胞スクレーパーは細胞生存率と増殖にほとんど影響を与えません(それぞれ97.31%と24.41%)。逆に、チップベースの方法では、細胞生存率(91.37%)と増殖(18.79%)が低くなります。この調査では、セルスクレーパーが、細胞の生存率を維持しながら再現性のある無細胞ギャップを生成できる新しい再利用可能なデバイスとして示されており、それにより、既存の技術と比較して創傷治癒アッセイの信頼性が向上します。

概要

腫瘍は、選択的増殖の利点、代謝の再配線、免疫調節などの明確な特徴によって特徴付けられ、これらすべてが興味深いことに、腫瘍細胞の重要な悪性挙動である細胞遊走の促進に貢献しています。この特徴は、原発腫瘍の遠隔転移に直接影響し、患者の長期生存を損なう ^1,2,3。選択的増殖の利点により、がん細胞は正常細胞に打ち勝つことができ、代謝の再配線はエネルギー経路を変えることでこの急速な増殖をサポートします。同時に、免疫調節により、腫瘍は体の防御を回避することができます。研究はこの問題の深刻さを強調しており、肺転移は、多くの場合、細胞遊走の亢進の結果であり、さまざまながん患者の死につながる末期イベントであることを示しています⁴。例えば、乳がん⁵、子宮頸がん⁴、骨肉腫⁶は、それぞれ20%、9%、30%を占めています。したがって、腫瘍細胞の遊走の評価は、現在の腫瘍学研究に不可欠となっており、腫瘍進行の多面的な性質がさらに強調されています。

細胞創傷治癒アッセイは、 in vitro 細胞遊走を測定するための使いやすい方法であり、腫瘍学研究でよく採用されています⁷。ほとんどの実験者は、ピペットチップを使用して細胞の傷を手動で作成します⁸。このような方法は、細胞創傷を迅速かつ便利に形成することができるが、細胞遊走の評価の再現性および精度に影響を与える多くの制限がまだある。まず、ピペットチップを使用して手動で傷を作ることは、オペレーターの操作角度、力、および速度に大きく影響され、メソッドの再現性に影響を与えます⁸。第二に、チップによって生成された細胞欠陥は、ピペットチップが特定の弾性を持つプラスチック製品であるため、通常、まっすぐなエッジではなくギザギザのエッジを持っています⁹。いくつかの研究では、細胞増殖の範囲を制限するために、プレハブの培養インサートを細胞培養プレートに直接配置することによって創傷を生じさせる¹⁰。このアプローチにより、ギザギザのエッジや再現性など、チップベースの方法の制限を回避できます。しかし、生体適合性材料であっても、細胞との埋め込みの長期的な共存は依然として細胞増殖に影響を与える¹¹。さらに、埋め込みは、接触制限¹²により、辺縁領域における細胞のエピジェネティックな変化も引き起こす可能性がある。また、生体適合性材料から製造されたコンタクトインサートは高価で再利用が困難であり、その実現可能性が制限されています¹³。したがって、 in vitro 細胞遊走を容易に定量するためには、新しく、再現性があり、実用的なツールが必要です。

この方法の主な目標は、腫瘍学研究における in vitro 細胞移動を定量化するための革新的なツールを導入し、既存の技術の限界に対処し、細胞移動の評価における再現性と精度を向上させることです。

この技術の開発の背後にある理論的根拠は、腫瘍学における腫瘍細胞の遊走を評価することの決定的な重要性にあります。腫瘍は、選択的増殖の利点、代謝の再配線、免疫調節などの特徴的な特徴を示し、これらすべてががん悪性腫瘍の基本的な側面である細胞遊走の促進に寄与しています。この方法は、細胞遊走を研究するためのより信頼性の高い手段を提供し、腫瘍の挙動のより深い理解に貢献することを目的としています。

この方法は、既存の技術に比べて大きな利点があります。手動スクラッチアッセイはオペレーター依存の干渉を受ける可能性がありますが、培養インサートは細胞増殖や遺伝子発現に影響を与える可能性があります。対照的に、この方法は再現性、精度、および実用性が向上しており、腫瘍学研究における in vitro 細胞移動を測定するための費用対効果の高いソリューションを提供します。これは、さまざまな種類のがんにおける細胞移動を研究するための信頼性が高くアクセス可能なツールに対する重要なニーズに対応しており、この分野への貴重な追加となっています。

プロトコル

すべての参加者によって完全な書面によるインフォームドコンセントが提供されました。本研究には動物またはヒトの組織サンプルが含まれていなかったため、倫理承認は適用されませんでした。

1. ユーザーコミュニティの要件の調査

1. 細胞創傷治癒アッセイに取り組んでいる生物学者/実験者にアンケートを配布します。記入済みのアンケートを収集し、調査に使用します。この研究では、2021年10月12日から2022年2月3日まで、100人の生物学者に100のアンケートが配信されました。回答率は97%でした。
2. 回答者に、細胞引っ掻き実験の中で一番気になったのはどれか、次のような質問に答えてもらいます。また、セルスクラッチを実行するためにどのツールが使用されましたか?これらの質問に続いてサブ質問を行い、原因を突き止めます。
3. 細胞創傷治癒実験におけるピペットチップや細胞培養インサートなどのツールに対する実験家の認識を調査します。アンケートセクション^14,15のはしご技術に基づくミーンズエンドチェーン理論を使用して、あるツールを別のツールよりも選択する理由を理解し、収集します。
   注:ラダー法は、詳細なインタビューを行うソフトラダー法と、アンケートまたは紙と鉛筆のクイズ¹⁶を使用するハードラダー法の2つのタイプに分けられます。ハードラダー法は、この研究で利用された主要な手法でした。ミーンズ・エンド・チェーン理論は、対象ユーザーが持つ明示的な知識は表面的で具体的であるのに対し、暗黙知は深く抽象的であることを示唆している17,18,19。

2. デザイン・立体モデリング

1. 前回のアンケート調査で得た知見からスケッチを描き、デザインプロセスを開始します。この下絵を基本設計図として使用します。
   1. モデリングソフトウェアの Dim、 DimRadius、および DimDiameter 関数を適用して、各コンポーネントの寸法とレイアウトを詳しく説明します。
   2. 実際の6ウェルプレートでバーニアキャリパーによる0.02mmの精度で測定を行い、セルスクレーパーの最終寸法を確認します。長さ42.1mm、幅42.1mm、高さ18.5mmであることを確認します。設計段階の詳細、特に製品の高さと井戸内の適合性に注意を払い、よりスムーズな組み立てを容易にします。
2. 3次元モデルを構築してレンダリングします。
   1. ソフトウェアで基本モデルを作成することから3D設計を開始します。ストレッチ用の ExtrudeCrv やデザインを形作るための Loft などのボタンをクリックします。モデルをリファインし、エッジを滑らかにするために [FilletEdge ]をクリックします。
      注:その他の使用機能ボタンには、 線 -直線セグメントを描画する、 ポリライン -複数のセグメントで構成される連続線を作成する、 長方形 -長方形を描く、 円- 円形を描く、 円 弧-円弧または楕円形状を描く、 ポイント -単一ポイントマーカーを配置する、 テキスト -テキストラベルを追加する、 寸法 -モデルに測定された寸法を追加する、 配列 - オブジェクトのコピーパターンを作成する、 回転 - オブジェクトを希望の角度に回転させる、 移動 - オブジェクトを新しい位置に移動する、 スケール - オブジェクトのサイズを大きくまたは小さく変更する、 トリム/延長 - オブジェクトをトリミングまたは延長して他のジオメトリに合わせる、 ブールユニオン/差分/交差 - オブジェクトを組み合わせる、オブジェクトから減算する、またはオブジェクトの交差を見つける、 レイヤー - 異なるレイヤー上のオブジェクトを整理する、 レンダリング - マテリアルと照明を使用してレンダリングされたビューを生成し、 エクスポート - モデル ジオメトリを他のファイル形式にエクスポートします。
   2. モデルを3Dレンダリングソフトウェアにインポートします。プラスチック、スポンジ、スチールなどのマテリアルを適用し、照明を調整してリアルなレンダリングを実現します。
      注: 機能ボタンの一般的なリストには、 ドラッグ アンド ドロップ - ライブラリから材料をドラッグし、リアルタイム ビューで目的のコンポーネントにドロップすることで、材料を部品またはモデルに直接適用するには、 右クリック - ライブラリ内の材料を右クリックすると、通常、次のオプションが表示されます。 選択範囲 に適用 - リアルタイム ビューで選択した部品に材料を適用します。 [マテリアルの編集 ] - マテリアルのプロパティを調整します。 マテリアル プロパティ (マテリアルを選択した後) - カラー、粗さ、屈折率、その他の属性など、マテリアルの特定のプロパティにアクセスして変更します。検索バー - ライブラリ内の資料の名前または関連するキーワードを入力してすばやく見つけることができます。 カテゴリ/フォルダ - 金属、プラスチック、ガラスなどの材料のさまざまなカテゴリまたはフォルダ間をナビゲートします。 お気に入りに追加 - 特定の材料をお気に入りとしてマークして、将来のセッションで簡単にアクセスできるようにします。 ホットキー - 一部の操作にはホットキーを使用してアクセスできます。たとえば、Mは通常、選択したパーツの材料特性をすばやく表示するためのホットキーです。
   3. 最後に、写真およびデザインソフトウェアで画像のコントラスト(+56)と彩度(自然な彩度+19、彩度+7)を強化し、背景要素(テキスト情報と白から明るい灰色のグラデーション背景への色)を追加して、高品質でリアルな製品表現を確保します。
      1. 画像のコントラストを調整するには、画像の>調整、明るさ/コントラストを使用します。「画像>色相/彩度」を使用して、画像の彩度レベルを変更します。テキストツール(Tアイコン)を使用して、画像にテキスト情報を追加します。
         注:機能ボタンの一般的なリストには、 楕円ツール(U) -ドット/円を描くことが含まれます。図形を描画するようにツールを設定し、必要な塗りつぶしの色を選択してから、クリックしてドラッグし (Shift キーを押しながら完全な円を維持します)、ドットを作成します。 ラインツール(U) - 画像上に直線を描画します。ツールを選択し、目的の線幅を設定してから、クリックしてドラッグし、線を描画します。 ブラシツール(B) - 点と線を描画する別の方法。ブラシのサイズと形状を選択してから、クリック(ドットの場合)またはクリックしてドラッグ(線の場合)します。
3. 3次元モデルが完成したら、研削および組み立て方法^20,21,22を介してセルスクレーパの製造に進む。

3. 生産

1. 現在の研究で色、材料、仕上げ(CMF)理論を使用して、セルスクレーパーのプロトタイプを設計します。CMF理論は、科学研究における設計方法論として機能します。それは、製品のユーザビリティを向上させ、ユーザーの知覚を形作り、そして材料の選択を指示する23,24,25。
   1. セルスクレーパーで使用する色は、ブラック6C、クールグレー6C、11-0601TPG^26,27などの標準カラーシステムから選択します。
   2. ラボの基準を満たすセルスクレーパーを構築するには、ポリプロピレン(PP)、スポンジ、高炭素鋼などの適切な材料を選択します。物理的なプロトタイプの製作には、まず3Dプリンターを使用して構造フレームワークを作成します。その後、コネクタまたは接着剤を使用して、スクレーパーの組み立てを完了します。
      注意: セルスクレーパーの物理的な製品を準備するには、必要な材料を粉砕して組み立てます。安全で効果的な最終製品を確保するためには、プロセス全体を通じて安全プロトコルに従う必要があります。
   3. 次に、切断、研削、研磨、スタンピング、またはその他の技術を含む仕上げプロセスに進みます。まず、中粒度、120グリットのサンドペーパーを使用してモデルを研磨し、粗いエッジを取り除きます。
   4. これに続いて、細かいグリットの220グリットのサンドペーパーで滑らかな表面を実現します。
   5. 表面を滑らかにするためのポストサンディング、プラグインコネクタまたは組み込みコネクタが正しく一致していることを確認します。
   6. スライドIとIIをコネクタ(固定ロッド)を使用してしっかりと結合し、セルスクレーパの堅牢で耐久性のあるアセンブリを確保します。セルスクレーパーの最終的な固定形態は、機械的な固定と接着剤の接着の組み合わせにより実現します。留め具、特にほぞ穴とほぞの構造を使用して、機械的な力で部品を固定します。さらに、アセンブリの強度を高めるために、接着剤(接着剤)を塗布してコンポーネントをさらに接着します。
   7. スクレーパーを121.3°Cで30分間オートクレーブ処理し、元の形状と物理的特性を保持していることを確認します。

4. 細胞培養

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した最小限の必須培地でHOS細胞を増殖させます。37°Cで5%_CO2で培養します。
2. 培地は2日ごとに交換してください。
3. 細胞増殖が80%の密度を超えたら、0.25%EDTAを含むトリプシン1mLを加え、60秒間消化します。その後、細胞を300 x g で5分間遠心分離し、継代培養します。上清を取り除き、培地を添加して、ウェルあたり5 x 10⁴ 細胞の最終濃度を得ます。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。

5. セルスクレーパーの細胞創傷電能の評価とチップベース法

1. 傷つけるためのすべての材料を準備し、30分間さらして紫外線で滅菌します。
2. 滅菌後、セルスクレーパー法またはチップベースの方法のいずれかを使用して、ウェルあたり5 x 10⁴ 細胞の濃度で6ウェルプレートに100%コンフルエントHOS細胞を巻き取ります。
   1. チップベースの方法では、100 μLのチップを使用し、培地を含むセル上を水平方向に1ストローク、垂直方向に1ストロークずつドラッグします。
   2. セルスクレーパー法では、スクレーパープロトタイプをウェルの1つに置き、ピンセットの助けを借りて一度静かに押します。細胞は傷ついています。各傷害実験を3回に分けて実施します。
3. デジタル顕微鏡システムとイメージングソフトウェアを使用して、すべての細胞創傷を解析します。

6. 細胞生存率と細胞増殖の測定

1. すべての細胞生存率アッセイは、CCK-8キットに規定されているプロトコルに従って実施します。
2. 細胞をCCK-8溶液で37°Cで2時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを使用して450 nmで吸光度を測定し、細胞の生存率を定量化します。
3. 5-エチニル-20-デオキシウリジン(EdU)取り込みアッセイを設計して、DNA重複を正確に定量し、細胞増殖率を直接定量化します。EdUアッセイを使用して、細胞増殖に対する細胞創傷を生成するさまざまな方法の影響を、以前の出版物²⁸で概説したプロトコルに従って決定します。
4. 細胞を染色し、デジタル顕微鏡システムを使用して画像化します。各実験が3回で実施されるようにします。

結果

細胞創傷を生成するためのツールに対するユーザーの要求を解剖
細胞創傷を作製する現在の実験的手法は、生物学的再現性、堅牢性、経済性、および細胞創傷治癒アッセイのユーザーエクスペリエンスを損なう多くの問題に対処するために、さらなる強化を必要としています。ハードラダー法を利用して、アンケート²⁹ (図1A)を通じて生物学的実験に関与するユーザーの要件を分析しました。アンケートに含まれる名前などの情報は、プライバシーを保護するために匿名化されています。アンケートの詳細を 表1に示します。100人を対象とした6週間の調査では、97の完全に記入されたアンケートが受信され、3つの疑わしい無効なアンケートが除外されました。回答率は97.00%でした。

結果は、細胞創傷治癒アッセイで最も厄介な問題は、鋸歯状のエッジ(まっすぐではない)と不安定な幅または創傷領域であり、それぞれ55.67%と29.90%を占めていることを示しています。これらは、細胞増殖率、細胞汚染、その他の選択肢が低いものよりも有意に高く、それぞれ3.09%、5.15%、6.19%でした(p < 0.001、 図1B)。創傷を作成するためのツールの選択に関しては、ピペットチップの使用が細胞培養インサートよりもはるかに一般的でした(図1C)。これは主に、細胞培養インサートがかなり高価で再利用できない(図1D)のに対し、ピペットチップは安価で、実験再現性(6.59%)と細胞生存率(20.88%、 図1E)を示しているという事実に起因していました。重要なことに、ユーザーの最大69.23%が、細胞培養インサートの価格が予算を超えていると主張しました(図1D)。対照的に、細胞培養インサートを選択した被験者はわずか6人で、価格が許容できると考えていたのはわずか16.67%でした(図1F)。最後に、細胞創傷を生成する革新的なツールについては、86.60%が楽観的であり、望まないユーザーは少なかった(4.12%、 図1G)。

続いて、ユーザーが緊急に必要としている製品の特徴が分析された30,31,32。これらの特徴には、まっすぐな創傷、創傷の幅と面積が安定していること、高い再現性、および許容可能な価格が含まれていました。したがって、その後の設計活動が実施されました。

セルスクレーパーの開発に使用する要素と材料の設計を決定
上記のデータは、日常的な生物学的研究で実施される実験室用消耗品は、細胞汚染を避けるために厳密に無菌でなければならないことを示しています³³。したがって、提案されたセルスクレーパーは無菌である必要があります。使い捨ての道具はエチレンオキシドで滅菌することができますが、実験コストは必然的に増加します34,35,36。したがって、使い捨て材料の代わりに、高圧蒸気滅菌(121.3°C)に対する耐性が高い再利用可能な材料を使用してセルスクレーパーを設計することを提案します。これにより、コストを削減し、さまざまなケースで適用された場合の柔軟性が向上します³⁷。これらの要件を満たすために、セルスクレーパーの構築に使用される材料は、耐熱性、高圧性、水蒸気腐食に対する耐性など、特定の物理的および化学的特性を備えている必要があります。

セルスクレーパーの使用目的には、エッジストレートの傷を作るなどの基本的な機能を満たすだけでなく、魅力的なデザインと色も備えている必要があります。モデリングに関しては、対象分野と応用分野を考慮すると、全体的なスタイルは研究室にとって相性が良いものでなければなりません。外観は、職員が実験の進行を観察するのを妨げるほど派手すぎるものであってはなりません。さらに、そのサイズは6ウェルプレートに適している必要があり、表面にはピンセットが安定して持ち上げるための突起が必要です。

デザインにおけるCMFは、美観とユーザーエクスペリエンスに影響を与える製品設計の重要な側面です。色の選択は感情的な反応に影響を与え、素材の選択は機能性と持続可能性に影響を与え、仕上げは触感と視覚的な魅力を決定します。CMFのデザイナーは、市場動向やブランドアイデンティティを考慮しながら、これらの要素を調和させ、ユーザーの共感を呼ぶ商品を生み出しています。

CMF理論によれば、色、素材、仕上げプロセスを含む3つの重要な要素が、機能と視覚効果への影響を決定するために考慮された²⁴。最初に色の選択が行われました。この文脈では、色とは固有の色を指し、これは、外部の光源や反射の影響を受けない、標準的な照明条件下でのオブジェクトまたは物質の固有の色です。6ウェルプレートは表面が透明なPPでできていることから、固有色としてダークグレーが選ばれました。この選択は、ダークグレーが他の色と重ね合わせたときに最適なコントラストと視認性を提供するため、識別と操作を容易にするために行われました。また、ダークグレーは他の色と組み合わせても色の歪みが発生しにくく、これも観察に重要です。必須の機能コンポーネントは、黒でさらに区別されました(図2A)。

市販のカラーマッチングシステムは、さまざまな業界で広く受け入れられ、使用されているため、色選択の標準として選択されました。さまざまな媒体で一貫した色を再現する同社の能力に依存して、正確で一貫した色表現を確保するために重要であるため、この研究に選ばれました。

資料の選定は、前述のアンケート結果に基づいて行われました。スクレーパーのシェルとコンポーネントは、 図2Bに示すようなオートクレーブによる滅菌の要件を満たすために、耐熱性プラスチックであるポリプロピレン(PP)で作られました。高炭素鋼は、高温および低温、耐腐食性の実験室環境に対して安定しているため、ばねに適しています。高密度スポンジを緩衝材として使用し、スライドの端に配置しました。

最後に、仕上げプロセスが開発されました。セルスクレーパーは使用頻度が高く、汚染されやすく、表面品質が滅菌に影響を与えるため、セルスクレーパーは滑らかで光沢のある表面が好ましく、ユーザーが汚染源を迅速に特定して対処し、清潔感を与えることができます。先端部は、培養皿の底部への損傷を避けるために部分的に研磨されており、これは培養環境に影響を及ぼし、細胞増殖の制限をもたらす可能性がある³⁸。

セルスクレーパーの設計とプロトタイプ
セルスクレーパーのプロトタイプは、上記の結果に基づいて3つ設計されました(図3A)。研究によると、細胞培養プレート内で最も一般的に使用される細胞創傷は十字型^であり39、これは長方形の創傷を採用したプロトタイプIとはかなり異なっていました。したがって、プロトタイプIは放棄されました(図3A)。プロトタイプIIとIIIはどちらも十字型の無細胞領域を作ることができましたが、プロトタイプIIのスライドレールは細胞培養ディスクに固定するのが難しく、そのインフラストラクチャはかなり複雑でした(図3A)。慎重な議論の結果、プロトタイプIIIはセルスクレーパーを製造する最終モデルとして区別されました。

特に、先端の形状がエッジやサイズの点でセルフリー領域に直接影響を与える可能性があることを考慮して、選択用に3つのスケッチが設計されました。スケッチはシャープなトップを持っていたので、非常にまっすぐなエッジを提供することができました。ただし、先端が鋭すぎると、細胞増殖を可能にする培養界面が損なわれる可能性があります(図3B)。スケッチIIは、細胞培養プレートの損傷を避けることができる正方形の上部を提供しました。しかし、培養プレートの先端と底面の接触面が正方形であるため、使用時には不安定です(図3B)。スケッチIIIは、先端が鈍く丸みを帯びているため、上記の問題を効果的に回避できます(図3C)。そのため、最終デザインとして選ばれました。

フィクサー固定方式、内蔵クッションスポンジ、握りやすさの3つの側面でデザインを最適化しました。まず、期待される製品固定方法には、座屈⁴⁰、ほぞ穴⁴¹、およびピボット⁴²が含まれていました。実際の製造コストと操作性を考慮し、十字型のフィクサーの下には、ウェルの端をクランプしやすくするための爪を設計しました。また、細胞スクラッチヒーリング試験では、スライドの長さや硬さが固定されているため、端部付近の壁に触れた後、先端が跳ね返り、スクラッチ状態に影響を与えることが観察されました。そこで、スライドの端にクッションスポンジを付け、先端の動きを安定させました。(図3A、C)。最後に、ピンセットのグリップを容易にするために、表面のくぼみが突起に追加されました。

さらに、3D設計ソフトウェアを使用して3次元モデルを構築しました。そのレンダリングを図 4A に示します。爆発プロットは、セルスクレーパーの詳細な内部構造を詳しく説明しており、これは上記の必要な特性を示しています(図4B)。さらに、先端と直進角のスムーズなスライドという目標を達成するために、内部の機械的な動力伝達構造が採用されています。セルスクレーパーの全機能ユニットは、制御部分で構成されています。実際の作業では、セルスクレーパー内部のリンケージレバーをトップボタンに接続し、圧力を加えた後に端部が下に移動して端部をバックルにします。スライド内部のスプリングを離して先端を押すと動きます。最後に、細いスリットでスポンジで止まって削り取りを終え、再度使用するとトグルしてリセットします(図5A)。さらに、学習のしやすさと便利な操作性は、生物学者が製品の品質を測定するための基準です。したがって、製品の外観デザインでは、表面レイアウトは対称性と整然性^43,44の原則に従い、黒、白、灰色のさまざまな色合いを通じてさまざまなコンポーネントを区別し、強調表示しました(図5A)。

セルスクレーパーは、実用化では先端引っ掻き方法よりも優れています
セルスクレーパーの物理的製品は、研削および組み立て方法を使用して調製されました(図5B)。予想通り、セルスクレーパーは6ウェルプレートと見事に一体化しており、上部の十字型ホルダーがプレートの端に密着して、強力な固定を提供しました(図5C)。さらに、チップは6ウェルプレートの底部に正確にフィットし、無細胞領域のスムーズな生成を促進しました。最後に、セルスクレーパーをオートクレーブ滅菌して、再利用できるかどうかをテストしました。 図5Dに示す結果として、本セルスクレーパーは、121.3°C以下で30分間オートクレーブした後でも、元の形状と物理的性能を保持しました。

セルスクレーパーは、ベンチマークテストで既存の細胞創傷作成法を上回る性能を示しました。繰り返しテストを行った後、セルスクラッチャーは創傷の準備において高い安定性と再現性を示し、各創傷の領域とほぼ直線的なエッジの変動が少なく、セルフリー領域の標準偏差は483.73、直線エッジへの偏差は5041.33±2420.00でした。対照的に、ピペットチップによって調製された各創傷の面積は、より大きな変動を示し、無細胞面積の標準偏差は3905.80、直線端への偏差は19562.33±1068.39でした(図6A-C)。

最後に、細胞創傷後の細胞生存率への影響を評価しました(図6D)。その結果、細胞創傷完了の12時間後、細胞生存率は、チップ群よりも細胞スクレーパー群の方がわずかに、しかし有意に高かったことが示された。これらの結果をさらに確認し、さまざまな細胞創傷調製方法が細胞増殖、すなわちDNA複製に与える影響を明らかにするために、EdUアッセイを実施しました。EdUアッセイの結果は、細胞スクレーパー群の増殖細胞の割合(0.48±24.41%)が、12時間後のtips法(1.46±18.79%)よりも有意に高かったことを示しました(図6E、F)。

これらのデータは、現在の細胞創傷発生装置が、安定性と生物学的再現性の点で、細胞創傷を作成する現在の方法よりも優れていることを強く証明しています。細胞の生存率と増殖への影響は少なかった。細胞創傷発生器のこれらすべての顕著な利点は、結果として得られるデータの信頼性と再現性を確保することにより、現在の細胞創傷アッセイを改善する可能性を確認しました。

図1:ユーザーの要求分析 (A)サンキープロットは、実験者向けのアンケートベースの調査のワークフローを示しています。(B)〜(G)は、質問1〜6を含むアンケートの結果を展示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:色と素材を使用した製品デザイン(A)色の選択。(B)生物実験に用いるオートクレーブこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:詳細構造の製品設計 (A)セルスクレーパーの試作候補3種。(B)先端デザインの3つのスケッチ。(C)選択されたプロトタイプIIIの3ビュー図面で、その全体的な設計と物理的および空間的パラメータを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:レンダリングされた3次元モデルと内部構造の表示(A)3次元モデルのレンダリング。(B)提案されたセルスクレーパーの内部構造を示す爆発プロット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:セルスクレーパーの動作メカニズム (A)スケッチは、セルスクレーパーがどのように機能するかを示しています。(B)セルスクレーパーの物理的製品。(C)セルスクレーパーは6ウェルプレートに収まります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:細胞スクレーパーの実験的検証 (A)異なる方法で生成された細胞創傷とそれらのグループ化された比較結果を(B)と(C)に示し、スケールバーは100μmです。 (D)細胞生存率の結果。(E)および(F)Eduアッセイの結果、スケールバーは50μmである。統計的評価のために、グループ化された比較のためにt検定を実施し、偽陽性の結果を避けるために元のp値をHolm-Bonferroni検定によって調整しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

I) 細胞引っ掻き実験であなたにとって最も厄介な問題は何ですか?

A)ストレートエッジなし

B) 不安定な幅

C) 増殖が遅い

D) 細胞の汚染

E) その他

II) 細胞創傷を生成するためにどのツールを使用していますか?

A)ピペットのヒント(質問IIIに進んでください)

B) 細胞培養インサート(IV-Vの質問に移る)

III) なぜ細胞培養インサートを選ばないのですか?

A) 細胞生存率

B) 再利用できません

C) コスト

D) その他

IV) なぜ細胞培養インサートを選んだのですか?

A) 費用

B) 再現性

C) その他

V) 細胞培養インサートの最も深刻な問題は何だと思いますか?

A) 細胞の状態

B) 再利用できません

C) 高価

D) その他

E) 満足

VI) もし、安価で、再利用可能で(オートクレーブ可能)、再現性の高いスクラッチツールがあったら、それを購入して使う意欲はどれくらいありますか?

A) 非常に意欲的

B) 意欲的

C) わからない

D) 不本意

表1: この研究で使用された質問票は、細胞創傷治癒アッセイ中に生物学者が遭遇する状況を理解することを目的とした6つの質問で構成されています。

ディスカッション

本研究は、細胞創傷治癒アッセイのための自動機械化ツールの開発を目的としています。私たちの知る限りでは、これは機械化された駆動構造を適用して、ワンクリックで自動的に細胞創傷を作成する最初の試みを表しています。これにより、従来のチップベースの方法が抱えていた、再現性の低さやスクラッチ状態の不安定さといった欠点を解消することを目指しています。肯定的な結果とユーザーコミュニティからの励ましのフィードバックの恩恵を受けて、セルスクレーパーは、細胞創傷を作成するための効率的で安定した代替手段を実験者に提供することが期待されており、したがって、実験分析結果の信頼性レベルが大幅に向上します。

現在の細胞スクレーパーの使用のために、ユーザーは、1)チップベースの方法のような従来の方法、すなわち、所与の密度で6ウェルプレートに細胞を播種するのと同様の無細胞ギャップを作成するために保留中の細胞を準備する必要があります。2)細胞の収束率が>90%に達するのを待ちます。3)滅菌細胞スクレーパーをプレートのウェルに入れ、 図5に示すようにボタンをクリックすると、1〜2秒以内に無細胞ギャップが自動的に作成されます。

細胞創傷治癒アッセイは、細胞遊走能力の測定に広く採用されています。通常、実験者はピペットチップを使用して細胞の傷を作成します。例えば、Tariqらは、ピペットチップを使用して細胞創傷を作成し、細胞移動能力を評価した⁴⁵。Rahimiらがピペットチップを使用して、PC3細胞の遊走能力を観察したのは偶然ではない⁴⁶。マウス間葉系細胞遊走アッセイにおいて、Cormierらはピペットガンも使用した⁴⁷;皮膚細胞の遊走に対するヒ素の影響を実証するために、Pintoらは、とりわけ、垂直掻き取りのためのピペットチップを使用した⁴⁸。

しかし、先述したように、先端部を用いて細胞創傷を作製することは、無細胞面積の変動、ギザギザのエッジ、操作者の力や引っ掻き角度への依存性など、いくつかの問題があり、再現性が低くなる⁴⁹。また、今回のアンケート結果から、チップベースの方法は、特に価格、細胞生存率、ツールの再利用性において、細胞培養インサートよりも明らかな利点があることも証明されました。あるいは、セルインサートはコストがかかりすぎて再利用が難しく、どちらのツールにも欠陥があります。したがって、ユーザーコミュニティは一般的に楽観的で、革新的なツールを試す意欲があります。この研究では、細胞創傷の生成を促進および安定させるための新しい無細胞領域調製ツールを設計および開発しました。

本研究の最も重要な貢献は、セルスクレーパーの開発と実験的検証にあります。これまでの研究と比較して、本セルスクレーパーの改良点は、大きく分けて以下の3点です。1)細胞創傷の安定した便利な製造。この研究は、従来のチップベースの方法と比較して、現在の細胞スクレーパーによって製造された細胞創傷は直線的なエッジを持ち、繰り返しの実験で同様の創傷を作り出すことができることを示しました。2)現在のセルスクレーパーは、セルの状態への影響が少なかった。細胞の生存率と増殖(DNA増幅)に影響を与えず、チップベースの方法よりも有意に優れていました。したがって、このセルスクレーパーは、日常的な実験における細胞創傷治癒アッセイに対する外部要因の影響をさらに低減することが期待されます。3)このセルスクレーパーは、ユーザーコミュニティの要求とよく一致しています。前回のアンケート調査の結果、新しい細胞創傷ツールに対するユーザーの要求には、主に均一なストローク幅、高い再現性、簡単な操作手順、および手頃な価格が含まれていることが示されました。また、セルスクレーパーはニュートラルカラーでデザインし、本製品のシンプルで実用的なデザインコンセプトを伝えています。同時に、強い黒と白のコントラストが、その機能領域を効果的に強調します。全体のスタイルは、曲面の丸みを帯びた関節によって形成されたクロス形状であり、従来の巻き形状を参照し、製品の役割を示唆しています。操作の簡素化と手動リセット機能により、操作の難易度が軽減されます。要約すると、この結果は、実験者がワンクリックで、自動化された、堅牢な方法で細胞スクラッチを準備するための有望な代替ツールを示しており、したがって、科学結果の再現性を向上させます。

この研究の限界を認識する必要があります。アンケート回答者のサンプルサイズは、この研究の一般化可能性を制限します。したがって、セルスクレーパーを改善するためのフォローアップ研究でサンプルサイズをさらに拡大します。第二に、セルスクラッチャーは、このセルスクレイパーの性能をより包括的に評価できるように、より多くのユーザーを対象としたよく計画された研究に含める必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CCK-8 キット	Beyotime Company, China	C0037
デジタル顕微鏡システム	Olympus	IX81
Feal Bovine Serum	Gibco, USA	16000044
HOS	プロセルライフサイエンス&テクノロジー株式会社	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	version 6.0
KeyShot	Luxion	version 11.0	3Dレンダリングソフト
マイクロプレートリーダー	BioTek, ドイツ	ELX808
Minimum Essential Medium	Gibco, USA	11095080
Pantone マッチングシステム	Pantone		商用カラーマッチング
ペニシリン-ストレプトマイシン	Beyotime会社、中国	ST488
フォトショップ	Adobe		の写真とデザインソフトウェア
サイ3D	ロバートマクニール&Associates	バージョン 7.0	3D デザインソフトウェア
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	TC20
Trypsin Cytiva	HyClone、アメリカ合衆国	SH30042.01