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方法論記事

細胞創傷治癒アッセイの信頼性を向上させるための、安定した再現性のある無細胞ギャップを自動的に作成するツール

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DOI:

10.3791/65794

⸱

2024年10月4日

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

インタラクション体験設計とユーザー要件分析を組み込むことで、再現性、信頼性、実用性、細胞完全性、ユーザーエクスペリエンスの観点から細胞創傷治癒アッセイを強化する革新的な細胞スクレーパーを導入します。

要約

創傷治癒アッセイにおける細胞移動測定の信頼性は、一般的な方法論的不安定性、すなわちチップベースの方法によってしばしば損なわれます。これらの制限に対処するために設計された革新的な機器をご紹介します。当社の新しいセルスクレーパーは、現在のアプローチを凌駕し、より一貫性のある安定した無細胞ギャップを生み出します。生物学的実験を繰り返すと、セルスクレーパーによって生成される無細胞ギャップは、チップベースの手法と比較して、よりまっすぐなエッジと均一なサイズと形状を示すことが明らかになりました（p < 0.05)。製品設計の面では、セルスクレーパーは実験室環境に適した洗練された配色を誇り、実験結果のモニタリングを強化し、オートクレーブによる滅菌を可能にして再利用することができます。特に、処理後、細胞スクレーパーは細胞生存率と増殖にほとんど影響を与えません(それぞれ97.31%と24.41%)。逆に、チップベースの方法では、細胞生存率(91.37%)と増殖(18.79%)が低くなります。この調査では、セルスクレーパーが、細胞の生存率を維持しながら再現性のある無細胞ギャップを生成できる新しい再利用可能なデバイスとして示されており、それにより、既存の技術と比較して創傷治癒アッセイの信頼性が向上します。

概要

腫瘍は、選択的増殖の利点、代謝の再配線、免疫調節などの明確な特徴によって特徴付けられ、これらすべてが興味深いことに、腫瘍細胞の重要な悪性挙動である細胞遊走の促進に貢献しています。この特徴は、原発腫瘍の遠隔転移に直接影響し、患者の長期生存を損なう 1,2,3。選択的増殖の利点により、がん細胞は正常細胞に打ち勝つことができ、代謝の再配線はエネルギー経路を変えることでこの急速な増殖をサポートします。同時に、免疫調節により、腫瘍は体の防御を回避することができます。研究はこの問題の深刻さを強調しており、肺転移は、多くの場合、細胞遊走の亢進の結果であり、さまざまながん患者の死につながる末期イベントであることを示しています4。例えば、乳がん5、子宮頸がん4、骨肉腫6は、それぞれ20%、9%、30%を占めています。したがって、腫瘍細胞の遊走の評価は、現在の腫瘍学研究に不可欠となっており、腫瘍進行の多面的な性質がさらに強調されています。

細胞創傷治癒アッセイは、 in vitro 細胞遊走を測定するための使いやすい方法であり、腫瘍学研究でよく採用されています7。ほとんどの実験者は、ピペットチップを使用して細胞の傷を手動で作成します8。このような方法は、細胞創傷を迅速かつ便利に形成することができるが、細胞遊走の評価の再現性および精度に影響を与える多くの制限がまだある。まず、ピペットチップを使用して手動で傷を作ることは、オペレーターの操作角度、力、および速度に大きく影響され、メソッドの再現性に影響を与えます8。第二に、チップによって生成された細胞欠陥は、ピペットチップが特定の弾性を持つプラスチック製品であるため、通常、まっすぐなエッジではなくギザギザのエッジを持っています9。いくつかの研究では、細胞増殖の範囲を制限するために、プレハブの培養インサートを細胞培養プレートに直接配置することによって創傷を生じさせる10。このアプローチにより、ギザギザのエッジや再現性など、チップベースの方法の制限を回避できます。しかし、生体適合性材料であっても、細胞との埋め込みの長期的な共存は依然として細胞増殖に影響を与える11。さらに、埋め込みは、接触制限12により、辺縁領域における細胞のエピジェネティックな変化も引き起こす可能性がある。また、生体適合性材料から製造されたコンタクトインサートは高価で再利用が困難であり、その実現可能性が制限されています13。したがって、 in vitro 細胞遊走を容易に定量するためには、新しく、再現性があり、実用的なツールが必要です。

この方法の主な目標は、腫瘍学研究における in vitro 細胞移動を定量化するための革新的なツールを導入し、既存の技術の限界に対処し、細胞移動の評価における再現性と精度を向上させることです。

この技術の開発の背後にある理論的根拠は、腫瘍学における腫瘍細胞の遊走を評価することの決定的な重要性にあります。腫瘍は、選択的増殖の利点、代謝の再配線、免疫調節などの特徴的な特徴を示し、これらすべてががん悪性腫瘍の基本的な側面である細胞遊走の促進に寄与しています。この方法は、細胞遊走を研究するためのより信頼性の高い手段を提供し、腫瘍の挙動のより深い理解に貢献することを目的としています。

この方法は、既存の技術に比べて大きな利点があります。手動スクラッチアッセイはオペレーター依存の干渉を受ける可能性がありますが、培養インサートは細胞増殖や遺伝子発現に影響を与える可能性があります。対照的に、この方法は再現性、精度、および実用性が向上しており、腫瘍学研究における in vitro 細胞移動を測定するための費用対効果の高いソリューションを提供します。これは、さまざまな種類のがんにおける細胞移動を研究するための信頼性が高くアクセス可能なツールに対する重要なニーズに対応しており、この分野への貴重な追加となっています。

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プロトコル

すべての参加者によって完全な書面によるインフォームドコンセントが提供されました。本研究には動物またはヒトの組織サンプルが含まれていなかったため、倫理承認は適用されませんでした。

1. ユーザーコミュニティの要件の調査

  1. 細胞創傷治癒アッセイに取り組んでいる生物学者/実験者にアンケートを配布します。記入済みのアンケートを収集し、調査に使用します。この研究では、2021年10月12日から2022年2月3日まで、100人の生物学者に100のアンケートが配信されました。回答率は97%でした。
  2. 回答者に、細胞引っ掻き実験の中で一番気になったのはどれか、次のような質問に答えてもらいます。また、セルスクラッチを実行するためにどのツールが使用されましたか?これらの質問に続いてサブ質問を行い、原因を突き止めます。
  3. 細胞創傷治癒実験におけるピペットチップや細胞培養インサートなどのツールに対する実験家の認識を調査します。アンケートセクション14,15のはしご技術に基づくミーンズエンドチェーン理論を使用して、あるツールを別のツールよりも選択する理由を理解し、収集します。
    注:ラダー法は、詳細なインタビューを行うソフトラダー法と、アンケートまたは紙と鉛筆のクイズ16を使用するハードラダー法の2つのタイプに分けられます。ハードラダー法は、この研究で利用された主要な手法でした。ミーンズ・エンド・チェーン理論は、対象ユーザーが持つ明示的な知識は表面的で具体的であるのに対し、暗黙知は深く抽象的であることを示唆している17,18,19。

2. デザイン・立体モデリング

  1. 前回のアンケート調査で得た知見からスケッチを描き、デザインプロセスを開始します。この下絵を基本設計図として使用します。
    1. モデリングソフトウェアの Dim、 DimRadius、および DimDiameter 関数を適用して、各コンポーネントの寸法とレイアウトを詳しく説明します。
    2. 実際の6ウェルプレートでバーニアキャリパーによる0.02mmの精度で測定を行い、セルスクレーパーの最終寸法を確認します。長さ42.1mm、幅42.1mm、高さ18.5mmであることを確認します。設計段階の詳細、特に製品の高さと井戸内の適合性に注意を払い、よりスムーズな組み立てを容易にします。
  2. 3次元モデルを構築してレンダリングします。
    1. ソフトウェアで基本モデルを作成することから3D設計を開始します。ストレッチ用の ExtrudeCrv やデザインを形作るための Loft などのボタンをクリックします。モデルをリファインし、エッジを滑らかにするために [FilletEdge ]をクリックします。
      注:その他の使用機能ボタンには、 線 -直線セグメントを描画する、 ポリライン -複数のセグメントで構成される連続線を作成する、 長方形 -長方形を描く、 円- 円形を描く、 円 弧-円弧または楕円形状を描く、 ポイント -単一ポイントマーカーを配置する、 テキスト -テキストラベルを追加する、 寸法 -モデルに測定された寸法を追加する、 配列 - オブジェクトのコピーパターンを作成する、 回転 - オブジェクトを希望の角度に回転させる、 移動 - オブジェクトを新しい位置に移動する、 スケール - オブジェクトのサイズを大きくまたは小さく変更する、 トリム/延長 - オブジェクトをトリミングまたは延長して他のジオメトリに合わせる、 ブールユニオン/差分/交差 - オブジェクトを組み合わせる、オブジェクトから減算する、またはオブジェクトの交差を見つける、 レイヤー - 異なるレイヤー上のオブジェクトを整理する、 レンダリング - マテリアルと照明を使用してレンダリングされたビューを生成し、 エクスポート - モデル ジオメトリを他のファイル形式にエクスポートします。
    2. モデルを3Dレンダリングソフトウェアにインポートします。プラスチック、スポンジ、スチールなどのマテリアルを適用し、照明を調整してリアルなレンダリングを実現します。
      注: 機能ボタンの一般的なリストには、 ドラッグ アンド ドロップ - ライブラリから材料をドラッグし、リアルタイム ビューで目的のコンポーネントにドロップすることで、材料を部品またはモデルに直接適用するには、 右クリック - ライブラリ内の材料を右クリックすると、通常、次のオプションが表示されます。 選択範囲 に適用 - リアルタイム ビューで選択した部品に材料を適用します。 [マテリアルの編集 ] - マテリアルのプロパティを調整します。 マテリアル プロパティ (マテリアルを選択した後) - カラー、粗さ、屈折率、その他の属性など、マテリアルの特定のプロパティにアクセスして変更します。検索バー - ライブラリ内の資料の名前または関連するキーワードを入力してすばやく見つけることができます。 カテゴリ/フォルダ - 金属、プラスチック、ガラスなどの材料のさまざまなカテゴリまたはフォルダ間をナビゲートします。 お気に入りに追加 - 特定の材料をお気に入りとしてマークして、将来のセッションで簡単にアクセスできるようにします。 ホットキー - 一部の操作にはホットキーを使用してアクセスできます。たとえば、Mは通常、選択したパーツの材料特性をすばやく表示するためのホットキーです。
    3. 最後に、写真およびデザインソフトウェアで画像のコントラスト(+56)と彩度(自然な彩度+19、彩度+7)を強化し、背景要素(テキスト情報と白から明るい灰色のグラデーション背景への色)を追加して、高品質でリアルな製品表現を確保します。
      1. 画像のコントラストを調整するには、画像の>調整、明るさ/コントラストを使用します。「画像>色相/彩度」を使用して、画像の彩度レベルを変更します。テキストツール(Tアイコン)を使用して、画像にテキスト情報を追加します。
        注:機能ボタンの一般的なリストには、 楕円ツール(U) -ドット/円を描くことが含まれます。図形を描画するようにツールを設定し、必要な塗りつぶしの色を選択してから、クリックしてドラッグし (Shift キーを押しながら完全な円を維持します)、ドットを作成します。 ラインツール(U) - 画像上に直線を描画します。ツールを選択し、目的の線幅を設定してから、クリックしてドラッグし、線を描画します。 ブラシツール(B) - 点と線を描画する別の方法。ブラシのサイズと形状を選択してから、クリック(ドットの場合)またはクリックしてドラッグ(線の場合)します。
  3. 3次元モデルが完成したら、研削および組み立て方法20,21,22を介してセルスクレーパの製造に進む。

3. 生産

  1. 現在の研究で色、材料、仕上げ(CMF)理論を使用して、セルスクレーパーのプロトタイプを設計します。CMF理論は、科学研究における設計方法論として機能します。それは、製品のユーザビリティを向上させ、ユーザーの知覚を形作り、そして材料の選択を指示する23,24,25。
    1. セルスクレーパーで使用する色は、ブラック6C、クールグレー6C、11-0601TPG26,27などの標準カラーシステムから選択します。
    2. ラボの基準を満たすセルスクレーパーを構築するには、ポリプロピレン(PP)、スポンジ、高炭素鋼などの適切な材料を選択します。物理的なプロトタイプの製作には、まず3Dプリンターを使用して構造フレームワークを作成します。その後、コネクタまたは接着剤を使用して、スクレーパーの組み立てを完了します。
      注意: セルスクレーパーの物理的な製品を準備するには、必要な材料を粉砕して組み立てます。安全で効果的な最終製品を確保するためには、プロセス全体を通じて安全プロトコルに従う必要があります。
    3. 次に、切断、研削、研磨、スタンピング、またはその他の技術を含む仕上げプロセスに進みます。まず、中粒度、120グリットのサンドペーパーを使用してモデルを研磨し、粗いエッジを取り除きます。
    4. これに続いて、細かいグリットの220グリットのサンドペーパーで滑らかな表面を実現します。
    5. 表面を滑らかにするためのポストサンディング、プラグインコネクタまたは組み込みコネクタが正しく一致していることを確認します。
    6. スライドIとIIをコネクタ(固定ロッド)を使用してしっかりと結合し、セルスクレーパの堅牢で耐久性のあるアセンブリを確保します。セルスクレーパーの最終的な固定形態は、機械的な固定と接着剤の接着の組み合わせにより実現します。留め具、特にほぞ穴とほぞの構造を使用して、機械的な力で部品を固定します。さらに、アセンブリの強度を高めるために、接着剤(接着剤)を塗布してコンポーネントをさらに接着します。
    7. スクレーパーを121.3°Cで30分間オートクレーブ処理し、元の形状と物理的特性を保持していることを確認します。

4. 細胞培養

  1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した最小限の必須培地でHOS細胞を増殖させます。37°Cで5%CO2で培養します。
  2. 培地は2日ごとに交換してください。
  3. 細胞増殖が80%の密度を超えたら、0.25%EDTAを含むトリプシン1mLを加え、60秒間消化します。その後、細胞を300 x g で5分間遠心分離し、継代培養します。上清を取り除き、培地を添加して、ウェルあたり5 x 104 細胞の最終濃度を得ます。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。

5. セルスクレーパーの細胞創傷電能の評価とチップベース法

  1. 傷つけるためのすべての材料を準備し、30分間さらして紫外線で滅菌します。
  2. 滅菌後、セルスクレーパー法またはチップベースの方法のいずれかを使用して、ウェルあたり5 x 104 細胞の濃度で6ウェルプレートに100%コンフルエントHOS細胞を巻き取ります。
    1. チップベースの方法では、100 μLのチップを使用し、培地を含むセル上を水平方向に1ストローク、垂直方向に1ストロークずつドラッグします。
    2. セルスクレーパー法では、スクレーパープロトタイプをウェルの1つに置き、ピンセットの助けを借りて一度静かに押します。細胞は傷ついています。各傷害実験を3回に分けて実施します。
  3. デジタル顕微鏡システムとイメージングソフトウェアを使用して、すべての細胞創傷を解析します。

6. 細胞生存率と細胞増殖の測定

  1. すべての細胞生存率アッセイは、CCK-8キットに規定されているプロトコルに従って実施します。
  2. 細胞をCCK-8溶液で37°Cで2時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを使用して450 nmで吸光度を測定し、細胞の生存率を定量化します。
  3. 5-エチニル-20-デオキシウリジン(EdU)取り込みアッセイを設計して、DNA重複を正確に定量し、細胞増殖率を直接定量化します。EdUアッセイを使用して、細胞増殖に対する細胞創傷を生成するさまざまな方法の影響を、以前の出版物28で概説したプロトコルに従って決定します。
  4. 細胞を染色し、デジタル顕微鏡システムを使用して画像化します。各実験が3回で実施されるようにします。

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結果

細胞創傷を生成するためのツールに対するユーザーの要求を解剖
細胞創傷を作製する現在の実験的手法は、生物学的再現性、堅牢性、経済性、および細胞創傷治癒アッセイのユーザーエクスペリエンスを損なう多くの問題に対処するために、さらなる強化を必要としています。ハードラダー法を利用して、アンケート29 (図1A)を通じて生物学的実験に関与するユーザーの要件を分析しました。アンケートに含まれる名前などの情報は、プライバシーを保護するために匿名化されています。アンケートの詳細を 表1に示します。100人を対象とした6週間の調査では、97の完全に記入されたアンケートが受信され、3つの疑わしい無効なアンケートが除外されました。回答率は97.00%でした。

結果は、細胞創傷治癒アッセイで最も厄介な問題は、鋸歯状のエッジ(まっすぐではない)と不安定な幅または創傷領域であり、それぞれ55.67%と29.90%を占めていることを示...

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ディスカッション

本研究は、細胞創傷治癒アッセイのための自動機械化ツールの開発を目的としています。私たちの知る限りでは、これは機械化された駆動構造を適用して、ワンクリックで自動的に細胞創傷を作成する最初の試みを表しています。これにより、従来のチップベースの方法が抱えていた、再現性の低さやスクラッチ状態の不安定さといった欠点を解消することを目指しています。肯定的な結果とユーザーコミュニティからの励ましのフィードバックの恩恵を受けて、セルスクレーパーは、細胞創傷を作成するための効率的で安定した代替手段を実験者に提供することが期待されており、したがって、実験分析結果の信頼性レベルが大幅に向上します。

現在の細胞スクレーパーの使用のために、ユーザーは、1)チップベースの方法のような従来の方法、すなわち、所与の密度で6ウェルプレートに細胞を播種するのと同様の無細胞ギャップを作成するために保留中の細胞を準備する必要があります。2)細胞の収束率が>90%に達するのを待ちます。3)滅菌細胞スクレーパーをプレートのウェルに入れ、

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開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、国立社会科学基金会(22FYSB023)、湖北省工業デザインセンター研究基金会(08hqt201412046)、および湖北省教育局の人文社会科学基金会(15Y054)の助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CCK-8 キットBeyotime Company, ChinaC0037
デジタル顕微鏡システムOlympusIX81
Feal Bovine SerumGibco, USA16000044
HOS プロセルライフサイエンス&テクノロジー株式会社CL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversion 6.0
KeyShotLuxionversion 11.03Dレンダリングソフト
マイクロプレートリーダーBioTek, ドイツELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Pantone マッチングシステムPantone商用カラーマッチング
ペニシリン-ストレプトマイシンBeyotime会社、中国ST488
フォトショップAdobeの写真とデザインソフトウェア
サイ3Dロバートマクニール&Associatesバージョン 7.03D デザインソフトウェア
TC20 Automated Cell CounterBio-RadTC20
Trypsin Cytiva HyClone、アメリカ合衆国SH30042.01

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