モルモットの丸窓膜移植による Ex Vivo 研究

サマリー

このプロトコルはモルモットの一時的な骨からの円形の窓の膜のexplantationのための方法を輪郭を描いて、 ex vivo の調査に貴重な資源を提供する。

要約

内耳への効率的で低侵襲な薬物送達は大きな課題です。丸窓膜(RWM)は、内耳への数少ない入り口の1つであり、研究の重要な焦点となっています。しかし、RWMの単離は複雑なため、その薬物動態に関する理解は依然として限られています。RWMは、外側の上皮、中間結合組織層、内側上皮層の3つの異なる層で構成されており、それぞれが独自の送達特性を持っている可能性があります。

RWM全体の輸送を調査するための現在のモデルでは、in vivo動物モデルまたは細胞培養または膜断片に依存するex vivo RWMモデルが利用されています。モルモットは、内耳内の薬物動態を調査するための検証済みの前臨床モデルとして機能し、蝸牛への送達担体のトランスレーショナル開発のための重要な動物モデルです。本研究では、モルモットRWMを周囲の蝸牛骨とともに移植し、卓上での薬物送達実験を行うアプローチについて述べる。この方法では、ネイティブのRWMアーキテクチャを維持でき、現在のベンチトップモデルよりも輸送の障壁をより現実的に表現できる可能性があります。

概要

感音難聴の治療のために、新しいクラスの治療法が登場しました。これらの治療薬の臨床集団への翻訳は、内耳への安全で効果的な輸送経路によって制限されています。動物実験における in vivo 送達の現在の方法は、内耳への開窓または中耳腔と蝸牛^を隔てる非骨性バリアである丸窓膜(RWM)を介した拡散のいずれかに依存しています1。

外科的開窓と内耳へのマイクロインジェクションはどちらも侵襲的であり、残存する内耳機能にリスクをもたらす可能性があります²。したがって、RWMは局所薬物送達の重要な経路であり、モルモットは、医薬品開発のためにRWM全体および内耳で局所薬物動態を研究するために使用される主要な前臨床動物モデルです^3,4。モルモットのRWMは、ヒトのRWMよりも薄いが、同じ3層構造を共有している。直径約1mm、厚さ15〜25μmで、結合組織層⁵を挟む2つの上皮細胞層からなる。中耳に面した上皮層は密集し、タイトジャンクションを介して接続されていますが、内耳とスカラティンパニに面した層は構造が緩く、細胞間接着が顕著ではありません。

モルモットRWMの薬物透過性を調査する現在の前臨床試験は、in vivoの中耳注射とそれに続く内耳内の外リンパ液のサンプリングに依存しており、RWM輸送の特定の研究は不可能です^6,7。RWM外植片の断片は前臨床試験で使用されてきましたが、壊れやすくサイズが小さいため、RWM²全体に水密シールを必要とする薬物および車両輸送の体系的なマイクロ流体研究には適していません。他のグループは、RWM ^8,9,10を近似するために、培養したヒト上皮細胞を用いたin vitroモデルを採用しました。しかし、これらのコンストラクトの大部分は、外側の上皮層にのみ焦点を当てており、天然組織構造の複雑さを捉えていません。RWM全体の輸送メカニズムをより詳細に理解するには、ターゲットを絞ったex vivo研究が必要です。

この研究では、モルモットRWMの移植と周囲の骨サポートを実証し、膜の完全性を維持し、薬物送達車両のRWM輸送の特定の研究のために設計された実験パラダイムでの使用を説明します。

プロトコル

すべての動物処置は、動物実験委員会(GP18M226)によって承認されました。Hartleyアルビノモルモット(雄と雌の両方、体重500〜700g)を本研究で使用しました。

1. 手順の設定と準備

1. 実験を開始する前に、すべての機器をエチレンオキシドで滅菌してください。
2. 施設で承認されたプロトコルに従って動物を安楽死させます。
   注:現在の研究では、市販のシリンダーから100%二酸化炭素(CO₂)を放出するために、プリチャージされていないチャンバーが採用されました。インラインリストリクターを使用してガス流量を調整し、2020年のAVMAガイドライン¹¹に従って、毎分チャンバーの容積の30%から70%の範囲内に維持しました。
3. 動物をチャンバーに入れ、二酸化炭素を5分間分注し、_CO2 の流れは呼吸停止後1分間維持されます。
4. 安楽死を確実にするために、呼吸停止後に斬首を行います。

2.外科的アプローチと摘出

1. 通常の方法でモルモットの頭蓋骨から側頭骨を抽出します¹².ロンゲールで余分な軟部組織を取り除きます。外耳口腔、側頭水疱、および顔面管¹³ を特定します(図1)。
2. 側頭水疱の腹側側面を6mmのダイヤモンドビット( 材料表を参照)でドリルで穴を開け、中耳腔と外耳道を円周方向に露出させます。
3. ロンゲールを使用して、外耳道と鼓膜輪を静かに除去し、同時に関節を分離します。顎関節、顎関節、蝸牛、水平三半規管、および顔面管¹³ を特定する(図2A)。
4. インキュドステープ関節を分離し、鉗子を使用してインカスを除去します。丸い窓の骨のくぼみを特定します。
5. 6mmのダイヤモンドビットを使用して、蝸牛と鼓膜腔の内側壁を鼓膜管に向かって接続している骨の椎弓をドリルで穴あけします。鼓膜張筋の骨チャネルを慎重に減圧し、28Gの針を使用して鼓膜張筋を取り除きます。
   注:鼓膜窩テンソルの内側壁は、RWMの周りの蝸牛骨と直接接続しており、丸い窓まで伸びる可能性のある骨折を引き起こさないように注意が払われています。
6. 蝸牛と鼓膜腔の下壁をつなぐ骨椎弓を、蝸牛に接する骨の出っ張りが1mmになるまでドリルで取り除きます(図2B)。
7. 2mmのダイヤモンドビット( 材料表を参照)を使用して、蝸牛の基底ターンで蝸牛造設を行い、丸い窓に約2mmの骨を残します。蝸牛の基部を蝸牛の頂点から分離するために、丸い窓の膜に平行な平面で下向きに蝸牛造設術を続けます。
8. 蝸牛瘻造設術の切開部を頭蓋底に伸ばすと、頭蓋底部がはるかに密度が高くなり、蝸牛の基底ターンの断面図が得られます。
   注:ドリルを内耳道の口腔に向けると、丸い窓に近づきすぎないようにしながら、骨の除去を最大化する軌道が得られます。
9. 標本を頭蓋底側から検査し、まだ行っていない場合は、内耳道を特定し、蝸牛の開口部にドリルで穴を開けます。28Gの針で蝸牛神経を取り除きます。
10. 蝸牛側から標本を調べます。基底回転の骨性らせん状椎弓と残りのモディオラスを特定して、鉗子または28Gの針で除去します。
11. 結合したスカラ鼓膜-スカラ前庭腔をたっぷりと灌漑して、破片を取り除きます。丸い窓は、重なる破片がなく、結腸切除術からはっきりと見えるはずです(図2C)。
12. 次に、標本を中耳側から調べます。外側三半規管と顔面管を楕円形の窓の高さまでドリルで開けます。鉗子を使用して茎をそっと取り外し、楕円形の窓のニッチを露出させます。注目すべきは、クリスタ・スタペディスとして知られる茎のクルラの間に骨の橋があることです。
13. 1mmのダイヤモンドドリル( 材料表を参照)を使用して、丸い窓のニッチに隣接する1〜2mmの蝸牛骨を維持するように注意しながら、丸い窓の面に沿って楕円形の窓を伸ばして前庭をさらに開きます(図2D)。
14. 円形の窓の切り口と丸い窓の両側の蝸牛切除術の切り口をつないで、側頭骨の切り込みを完了します。
    注:蝸牛の骨は脆弱なため、標本内の鼓膜窩テンソルを保存し、それを切り裂かないようにすることで、RWMにまで伸びて完全性を損なう蝸牛骨折を防ぐことができます。
15. 内耳道に隣接する頭蓋底の密集した骨に最終的な付着物を作り、静かに削って切除されたRWM標本にします(図3A)。

結果

図3Aに示されるように、この方法は、無傷のモルモットの丸い窓膜を、周囲の硬い骨のリングで移植することを可能にする。RWMは、円周方向に骨輪に完全に接続されている必要があります。蝸牛の骨折は認められません。ヒトの丸い窓の標本と比較して、モルモットのRWMは偽膜を覆っていません。さらに、人間とは異なり、モルモットの茎のクルーラの間には骨の橋があり、茎の上部構造を抽出する前に破砕と除去が必要です。代表的なRWMの組織学的分析(図3B)は、隣接する無傷の丸い窓のニッチを持つ明確な3層の上皮構造を示しています。

技術の観点からは、2つの重要なステップがあります。まず、ステップ2.7で結腸切除術を行う場合、バリの先端のジッターが蝸牛の外傷性骨折を引き起こし、丸い窓の膜にまで及ぶ可能性があるため、先端ではなくドリルビットの赤道を使用して切断することが重要です。第二に、内耳道を完全に掘り出すことは、蝸牛神経の完全な除去と骨螺旋状椎弓の解剖を容易にするため、実験的サンプリングのため...

ディスカッション

耳への局所薬物送達では、RWMは治療薬が内耳に到達するための主要な通過経路です。正確で信頼性の高いベンチトップモデルは、新しい送達手段の輸送メカニズムと透過性をよりよく理解し、医薬品開発のために必要です。この研究では、モルモットのRWM移植が実行可能で信頼できる手順であり、薬物と膜の相互作用の体系的な調査を可能にすることを実証します。LundmanらとKelsoらは、以前に同様のRWM透過^{性モデルを利用する}ことを説明しました^2,16;しかし、外科的摘出の具体的なステップはこれまで詳細に説明されておらず、蝸牛の骨の脆弱性と複雑な解剖学的構造は、無傷のRWMを一貫して一括して採取するという課題を提起してきました。

モルモットRWMは、蝸牛のスカラティンパニの末端に位置し、蝸牛骨の薄い層に囲まれています。移植プロセス中にこの骨構造が骨折すると、周囲の蝸牛骨が無傷で残っていないとRWMが引き裂かれる傾向があるため、標本が使用できなくなる可能性があります。私たちのグループは、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mm ダイヤモンドボールドリルビット	Anspach	1SD-G1
2 mm ダイヤモンドボールドリルビット	Anspach	2SD-G1
6 mm ダイヤモンドボールドリルビット	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	どんな骨切断ドリルシステムでも機能します
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. 取り外し可能な 1 mL BD Luer-Lok シリンジ	付きベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	382903057894	27-28 G ニードル
ゴリラ エポキシ	ゴリラ	4200101
Kwik-CAST	ワールド精密機器	KWIK-CAST