方法論記事

酵素結合免疫吸着アッセイ/免疫蛍光光度法による植物組織中のカロース定量

DOI：

10.3791/65833

⸱

2026年5月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、植物組織内のカロースを定量化する免疫蛍光分光光度法(ELISA)を用い、植物サンプル中のカロースをカロース特異的抗体に結合させ、酵素標識検出抗体で結合したカルロースを定量し、その結果得られる酵素活性を測定します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物組織からのカロース定量の既存の方法には、エピ蛍光顕微鏡、蛍光分光光度法、免疫蛍光顕微鏡法、そしてカロース合成酵素およびβ-(1,3)-グルカナーゼ活性の間接評価が含まれます。しかし、これらの方法には時間がかかる、コに特異的でない、労力がかかる、主観的、高い自己蛍光、感度が低、定量的ではなく質的であること、ソフトウェア資源や技術的スキルの習得が必要といった重大な制約があります。したがって、植物組織におけるカロース定量の代替方法を探求する緊急の必要性があります。カルロース特異的抗体を用いた免疫蛍光分光光度法または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が、現在のカルロース定量法のいくつかの制約を克服できると仮説が立てられました。バイオティックストレスは、組織培養由来のバナナ苗に Xanthomonas vasicola pvを接種することで投与されました。カロース産生を誘導した musacearum (Xvm)菌。バナナ球茎の組織サンプルは接種後14日(dpi)に新しい免疫蛍光分光光度法を用いてカルロス定量のために採取されました。 Xvm接種群および対照群の球茎の産生は、バナナ遺伝子型の両方で有意に異動しました(独立標本 t検定、 p < 0.05)。ここで説明する免疫蛍光分光光度法は、異なる植物組織におけるカロースの定量に応用可能であり、高特異性、感度、信頼性、再現性を持つ。さらに、96ウェルプレートの使用により、サンプリングや分析バイアスを最小限に抑えた高スループットのカロース定量研究に適しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カロースはβ-1,3-グルカンの多糖類であり、さまざまな高等植物の細胞壁に自然に存在する化合物です。カロースはカロースシンターゼ(CalS)によって合成され、β-(1,3)-グルカンナーゼ1,2,3によって分解されます。成長や発達、非生物的および生物的ストレスへの応答など、いくつかの生物学的プロセスに関与しています 4,5,6。病原体感染時には、乳頭内のカロース沈着の増加がさらなる微生物定着を防ぎ、隣接する植物細胞間の透過性障壁として機能します。.攻撃された組織への病原体の侵入を遅らせることで、カロース沈着により追加の防御反応が誘導される時間が与えられます13。植物組織中のカロースの正確な時空間的定量化は、さまざまな生理学的過程におけるその役割を理解する上で不可欠です。しかし、現在の植物組織からのカロース定量方法、すなわちエピ蛍光顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、蛍光分光光度法は、重大な制約と定量上の課題を抱えています。したがって、これらの欠点を克服するためにカルロス定量の代替方法を探る緊急の必要性があります。免疫蛍光分光光度法または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が、植物サンプルにおけるより効率的なカロース定量法を提供し、特異性、感度、信頼性、再現性が高く、高スループットの方法を提供すると仮説が立てられました。

カルロース定量のゴールドスタンダード法は、エピフルオレッセン顕微鏡14,15,16,17によるアニリン青色染色カロース粒子のイメージングです。アニリン青色に染まったカロースは、青色または紫外線励起を受けると黄色い蛍光粒子として現れ、これは蛍光を発光するカロース粒子数を手動で数えるか、自動カロース計数ソフトで数えることができます。カルロース粒子の手動カウントは、研究者にとって手間がかかり時間がかかり、主観的なものである一方、自動カウントはソフトウェアリソースの取得とかなりの技術的スキルを必要とします。自動カロースカウントに使われるソフトウェアには、ImageJ19、20、21、22、Photoshop23、CalloseMeasurer24、Icy18、25、Ilastik26などがあります。アニリン青色染色されたカロースは蛍光分光光度17,19,27,28,29でも定量化可能です。しかし、エピ蛍光顕微鏡や蛍光分光光度法に伴う高い背景・自己蛍光度により、これらの手法は信号対雑音比が低いため困難かつ信頼性に欠ける26。さらに、アニリンブルーはカロース30以外のβ-1,3-グルカンを染色するため、エピフルオレセンス顕微鏡および蛍光分光光度法によるカロース検出・定量の両手法は部分的に非特異的かつ信頼性に欠けます。カロース定量のための免疫蛍光顕微鏡法は、コゲース特異的抗体に基づくもので、いくつかの研究で用いられています。この方法はアニリン青色のコロースのエピフルオレッセンス顕微鏡といくつかの欠点を共有しますが、ここで使われる抗体のためにタコ特異的であるという利点があります。カロース定量は酵素活性ベースの手法でも行われています。酵素活性に基づくカルロース定量法には、カロース合成酵素(CalS)20,33およびβ-(1,3)-グルカナーゼ活性34,35の評価が含まれます。酵素活性ベースの方法は、エピフルオレッセンス顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、蛍光分光光度法と比較していくつかの欠点があります。これには、コゲースの間接推定、酵素抽出や酵素活性アッセイの困難さ、植物組織内のカロース分布の不均等さなどが含まれます。

現在のカルロース定量法には、エピフルオレッセンス顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、蛍光分光光度法、CalSおよびβ-(1,3)-グルカナーゼアッセイが含まれ、新たなカロース定量法の考案が必要となりました。これには、1) 高い特異性、感度、信頼性、再現性、2) 高スループットで容易なカルロス定量が可能であることが求められました。カルロース定量のための免疫蛍光分光光度法の使用は、まだ検討されていません。ここでは、免疫蛍光分光光度法に基づく新しいカロース量定法、特に酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が報告されています。この方法は、異なる植物やその組織におけるカロース定量に最適化され、コロースにかなり特異的で、精度、再現性、そして高スループットの実験能力を備えています。この方法は、植物由来の分析物に対する抗体が利用可能な場合、その分析対象を定量するために修正することも可能です。植物組織内のカロースの正確で効率的かつ信頼性の高い時空間分布を確保するために、顕微鏡法、分光光度法、酵素活性ベースの方法など、さまざまなカロース定量法を同時に用いることが推奨されます。したがって、これによりカロースがさまざまな生理的およびストレス反応に果たす役割を正確かつ効率的に理解できるようになります。

プロトコル

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1. 実験植物の接種

  1. 標準手順36、37を用いてXvm接種点を分離、準備、確認してください。組織培養由来のMusa balbisianaおよびMbwazirume植物10株を無作為に選び、最も若い完全開葉柄の背面側にPCR確認済みXvm接種物の200μL(1×108細胞)を接種します(図1)38。
  2. 同様に、ムサ・バルビシアナ とムブワジルメのバナナ苗を10株ランダムに選び、200μLの滅菌蒸留水(SDW)で接種します。
  3. Xvm接種済みのバナナは、スクリーンハウス内で同様の条件下で管理し、25°Cで12時間の光と12時間の暗光時間で3日ごとに水やりを行います。
    注:材料表および機器の一覧およびバッファーのレシピについては、それぞれ材料 表 および 表1 を参照してください。

2. 球茎組織のサンプリングとサンプル調製

  1. 実験植物から球茎サンプルを得るために破壊サンプリングを行います(図1)。
  2. 接種後14日目(DPI)に無菌の外科用刃で約2gの球茎サンプルを素早く切除し、個別にラベル付き50mLチューブに入れます。 Xvm接種プラントと対照プラントから採取した10サンプルすべてに対してこれを行います。
  3. すぐにサンプルを入れた50mLのチューブを液体窒素に浸します。
  4. サンプルを実験室に運び、-80°Cで保存して準備が整うまで保管してください。サンプルは−80°Cで最大1年以上、凍結融解サイクルを最小限に抑えて保存します。
  5. サンプルはフリーズドライヤーで72時間フリーズ乾燥させます(図1)。
  6. 凍結乾燥サンプルを正確に30mgを2mLチューブに2個のスチール製自転車ビーズを入れ、粉末に粉砕します。速度は5に設定し、1分間(図1)。
  7. 粉砕試料は室温の涼しく乾燥した環境で、十分に密封して保管し、使用準備が整うまで保管してください。粉砕サンプルは室温で最大4か月間保存、または−80°Cで最大1年間、凍結融解サイクルを最小限に抑えて保存します。

3. カロースの抽出およびラミナリン標準物質およびブランクの準備

  1. 粉砕した球茎サンプル30mgからカルロースを抽出するには、1 M NaOHを800 μL加え、80°Cの水浴で30分間培養し、10分ごとに時折渦巻きを行います(図1、ステップ6)。
  2. 試料を室温(約5分)まで冷却し、その後15,294 x g で5分間遠心分離します。
  3. 上清液(カロース抽出物)を無菌の2 mLチューブに移し、ブロッキングバッファー(表1)で1:2の比率で希釈します。
    注意:希釈係数は予備的な実験と最適化に基づいて選択してください。カロース抽出物の希釈は必ずしも必要かどうかも分かりません。必要に応じて、ブロッキングバッファ内で希釈を行い、希釈比を標準曲線の範囲内に収めるように、異なる試料タイプに最適化されます。
  4. カリロス抽出物は-20°Cで保存し、準備が整うまで保存してください。カロース抽出物は最大6ヶ月間、凍結・解凍サイクルを最小限に抑えて保存してください。
  5. 100 mg/mLの濃縮ラミナリン標準液を1 M NaOH 6,42,43,44,45に準備します。
    注:ラミナリンは1-3-β-グルカンポリマーであり、免疫蛍光分光光度測定におけるカロース相当物の標準として使用できます。
  6. 標準物質の懸浮液を80°Cの水浴で培養し、間隔をあけて優しく振る。すべての層流が完全に溶解するまで(約20〜40分)。
  7. 溶解した標準物質を室温(約10分)まで冷却します。
  8. 濃縮された100 mg/mLの濃縮液から、ブロッキングバッファーを使用して、80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.01 mg/mLの濃度でラミナリン標準を準備します。
  9. ブランクは1MのNaOHとブロッキングバッファーを1:2の比率で混ぜて準備します。希釈が必要な場合は、カルロース抽出物の調製に使ったのと同じ希釈比率を用いてください。
  10. ラミナリン標準剤とブランクは−20°Cで保管してください。 標準と空洞は凍結融解サイクルを最小限に抑えて最大6ヶ月間保管できます。

4. 免疫蛍光分光光度法によるカラス定量

  1. コーティングバッファーで調製した一次抗体(1-3-β-グルカン指向マウスIgG)を100μL、ポリスチレンELISAプレートの96ウェルそれぞれに加えます(図2)。
  2. 板をパラフィンフィルムでしっかり密封し、冷蔵庫で4°Cで一晩培養します。
  3. 翌日、皿をベンチに置き、室温(約10分)まで置きます。
  4. 標準的な吸い取りと洗浄手順で皿を洗う46。簡単に、ウォッシュバッファー200μL(表1)をウェルに加え、デジタルシェーカーで500rpmで30秒ほどボルテックスし、ティッシュペーパーにブロットします。この洗浄工程を2回繰り返します(図2)。ウェルが完全に乾かないようにし、滅菌マイクロピペットの先端を使って、ウェルの基部や壁に触れない状態でウェル内の気泡を除去してください。
  5. 各ウェルにブロッキングバッファー200μLを加え、パラフィンフィルムでプレートをしっかりと密封します。37°Cで4時間孵化します。 上記の通り(図2)にプレートを洗いましょう。
  6. 指定されたウェルに10の Xvm接種プラントと10基の対照プラントから抽出したカロース抽出物100μLを加えます。他の井戸にラミナリン標準物質を100μL添加します。他の井戸に100μLのブランクを加えます(図2)。
  7. 板をパラフィンフィルムでしっかり密封し、冷蔵庫で4°Cで一晩培養します。上記の通り(図2)再度皿を洗います。
  8. ブロッキングバッファーで調製した一次抗体(1-3-β-グルカン誘導マウスIgG)を各ウェルに100 μL加えます(図2)。
  9. プレートをパラフィンフィルムでしっかりと密封し、37°Cで4時間培養した後、上記のように洗い流します(図2)。
  10. 各ウェル46,47(図2)に抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ二次抗体100 μLを加えます。
  11. 板をパラフィンフィルムでしっかり密封し、冷蔵庫で4°Cで一晩培養します。その後、上記のように皿を洗います(図2)。
  12. ウェルに1 mg/mL濃度の新たに調製されたパラニトロフェニルリン酸塩(pNPP)溶液100 μLを加えます(表1参照)。
  13. 実験台の上で室温の30分48分孵化します。
    注意:孵化時間は植物サンプルや使用する標準によって異なります。この研究では、ラミナリンが最も高い反応を示し、30分でした。
  14. 反応を終了させ、各ウェル48 に新たに調製された停止液(0.5 M NaOH)を100 μL加算します(図2)。
  15. プレートをマイクロプレートリーダー(37°Cに平衡)に移し、中速で1分間振って吸光度を405nm48 で読み取ります(図1、 図2)。

5. データ分析

  1. ラミナリン吸光度を405nmでラミナリン濃度(μg/mL)に対して単純な線形回帰を行い、標準曲線を得ます。標準曲線の方程式は次の通りです。
    Y = β1X + β0
    ここでYは405 nmのラミナリン吸収、β1は回 帰線の傾き(ピアソン相関係数)、XはLog10 (ラミナリン濃度(μg/mL)、β0はy 切片を表します。
  2. 球茎サンプル中のカルロース濃度は、サンプルの吸収力からブランクの吸収度を差し引いて計算します。次に標準曲線を用いて、ラミナリン当量(LE)としてカルロス濃度(μg/mL)を推定します。
  3. すべてのデータをシャピロ・ウィルク検定で分布の正規性を調べ、分散の等方差性はレヴェーン検定(α > 0.05)で検証します。
  4. 独立標本 t検定を用いて 、Xvm接種群と対照群間のカロース産生を比較します(p≤ 0.05)。

結果

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既知のラミナリン標準濃度は分光光度測定法で分析され、対応する吸光度値が記録されました。このデータを用いて、ラミナリン標準物質の濃度を横軸に、吸光を横軸にプロットすることでビア・ランバートプロットを構築しました。回帰直線の方程式は y = 0.5079x − 0.04534(図3)49でした。ビア・ランバートプロットは相関係数(r)が0.9988、決定係数(r²)が0.9975で、濃度と吸収率の間に強い線形関係があることを示し、従属変数(吸収度)の分散最大0.9975は独立変数(濃度)で説明されました。図3;p<0.0001)。したがって、このモデルはラミナリンとコロースの濃度を予測するのに適しており、正確かつ信頼性がありました。バナナコウサンプル中のカロース濃度は、分光光度法で吸収を測定し、その吸光度値を用いて方程式を用いてカロース濃度を算出することで決定されました。

免疫蛍光分光光度測定法では、 Xvm接種植物における誘導カロースが対照群と比較して有意に増加し、両バナナ遺伝子型で認められました(独立標本 t検定、 p < 0.05; 図4)。対照植物の14 dpiでのカロース産生は、それぞれMbwazirumeと M. balbisianaで1474.34 mg/mL、M. balbisianaで1037.11 mg/mLでした(図4)。 Xvm ワクチン接種により、 Xvm接種されたムブワジルメと M. balbisianaの 小苗の球根にそれぞれ14dpiの茎に4190.78 mg/mLおよび1996.07 mg/mLのカロースが検出されました(図4)。 Xvm 接種は対照植物と比較して1.9倍から2.8倍のカロース産生をもたらしました(独立標本 tテスト、 p < 0.001; 図4)。

figure-results-1
図1:新しい免疫蛍光分光光度法によるカロース定量に関わる主要なステップの概略図。 この図は、バナナ組織からのカロース定量に関わる主要なステップを示しています。これには、組織培養由来の小株の培養、 Xvmの接種、球茎組織の破壊的サンプリング、サンプルの凍結乾燥、カロースの抽出、そして新しい免疫蛍光分光光度法によるカロースの定量が含まれます。この図は50枚再版されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2
図2:カロース定量のための免疫蛍光分光光度法の詳細な回路図。 この図は、ELISAプレートに各成分を充填し、最終的に分光光度測定によってカルロスが定量化される免疫蛍光分光光度法の詳細なデモンストレーションを示しています。この図は50枚再版されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-3
図3:タンパク質定量。 Beer-Lambertプロットは、既知濃度のラミナリン標準および吸収度(405nm)に基づくもので、球茎サンプルの吸収度測定からカローネス濃度(ラミナーリン当量、LEとして)を算出するために用いられています。この図は49巻に再版されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-4
図4:カロース濃度の比較。Xvm±接種されたM. balbisianaおよびMbwazirumeバナナ苗の球根の平均カルロース濃度(SEM平均、n = 9)の比較(独立したサンプルt検定、α ≤ 0.05)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧いただけます。

バッファー作曲保管
ブロッキングバッファ牛血清アルブミン(BSA;1% w/v)10g、PBS1Lに溶解。-20°Cで最大6か月間
コーティングバッファー炭酸ナトリウム1.59g(Na2CO3)、炭酸水素ナトリウム2.93g(NaHCO3)、0.2gのアジドナトリウム(NaN3)を脱イオン化水素2O1Lに溶解し、pH 9.6。-20°Cで最大12ヶ月間
共役バッファPVP2g(2% w/v)、ブロッキングバッファー1Lに溶解。-20°Cで最大6か月間
パラニトロフェニルリン酸(pNPP)溶液基質バッファーにパラニトロフェニルリン酸塩(pNPP)を1 mg/mLの作動濃度で溶解します-20°Cで最大12ヶ月間
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)塩化ナトリウム8.0g(NaCl)、0.2g単塩基リン酸カリウム(KH2PO4)、1.15gの二塩基リン酸ナトリウム(Na2HPO4)、0.2g塩化カリウム(KCl)、0.2gのアジ化ナトリウム(NaN3)、脱イオン化H2O1Lに溶解、pH7.4。-20°Cで最大12ヶ月間
ブロッキングバッファー内の一次抗体製造者の指示に従って凍結乾燥した一次抗体を再構成し、濃縮されたストックを得ます。得られた再構成された一次抗体をブロッキングバッファー中に希釈し、作動濃度2 μg/mLにします。-20°Cで最大6か月間
コーティングバッファー内の一次抗体製造者の指示に従って凍結乾燥した一次抗体を再構成し、濃縮されたストックを得ます。コーティングバッファー内の再構成された一次抗体ストックを希釈し、作動濃度2 μg/mLにします。-20°Cで最大6か月間
二次抗体二次抗体濃縮物1:1000:共役バッファー-20°Cで最大6か月間
基板バッファージタノールミン97 mL、アジ化ナトリウム0.2 g(NaN3)を脱イオン化水1Lに溶解し、pH 9.8-20°Cで最大12ヶ月間
ウォッシュバッファーTween 20 0.5mL(0.05% v/v)、PBS1Lに溶解、pH 7.5-20°Cで最大12ヶ月間

表1:バッファーのレシピ。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

バナナの球茎中のカロースを定量するために初めて免疫蛍光分光光度法が適用されました。これは、バナナの粗1MナOH抽出物中のカロースを定量するために、コゲース特異的抗体47,51,52を用いる酵素免疫測定法(EIA)に基づいています。簡単に言うと、この新しい免疫蛍光分光光度法に基づくコロース特異的定量アッセイは、マイクロプレートにコロース特異的抗体をコーティングし、植物抽出物中のカロースに結合させ、続いてコゲースに特異的な二次抗体を施しました。酵素(アルカリホスファターゼ)に結合した抗体の検出が加えられ、二次抗体と複合体を形成します。次に基質としてパラニトロフェニルリン酸塩(pNPP)が加えられます。試料中のカロースの定量は、アルカリ性ホスファターゼがpNPP分子からリン酸基を切断し、その結果、黄色い化合物(p-ニトロフェノール)を形成する能力に依存しています。黄色の強度の検出は405nmの分光光度計を用いて行われ、その吸収度は試料中のカロース濃度に比例するアルカリリン酸活性と相関されました。反応は0.5 M NaOHを加えてpHを上げることで停止し、さらなるアルカリ性リン酸化作用を抑制しました。

対照的に、カラスを位置づけて定量化するための標準的な方法はエピフルオレッセンス顕微鏡法であり、これはアニリンブルーフルオロクロム53でカラースを染色する確立された方法です。簡単に言うと、この方法はアニリンブルー染料がβ-1,3-グルカン(カロース)に特異的に結合し、複合体を形成することに基づいています。この錯体中のアニリン青は、波長365〜375 nmの紫外線を用いて励起されます。アニリンブルー染料が励起されると、青色蛍光を放出し、それを捕捉して植物組織中のカロースの特異的な可視化を可能にします。アニリン青色染色されたカラス(カリス)の定量化は、植物組織から発せられる蛍光の量を定量化する一連のイメージング技術に従います。蛍光は植物組織内のカロースの量に比例します。エピフルオレッセンス顕微鏡は、生物ストレス下のカルロースの可視化および定量に用いられています。

別の研究では、放射性顕微鏡と免疫蛍光分光光度法49を用いてカロース沈着が決定されました。データにはいくつかの違いが観察されましたが、統計解析ではエピフルオレッセンス顕微鏡と免疫蛍光分光光度法のデータが大まかに一致していることが示され、両方法のカロースキャン検出に一貫性があることを示しました。両方法の結果は概ね一致していましたが、より信頼性の高い評価のためには、エピフルオレッセンス顕微鏡と免疫蛍光分光光度法を補完し合うことが望ましいです。ELISAベースの方法はコス特異的で感度が高く信頼性が高いものの、プロトコルの最適化やすべての濃度と吸収度に適合する最適適合標準曲線の取得に初期には時間がかかります。

カロース定量の方法の中には、手間のかかる17,32,55、時間のかかる26,56、そしてカルロース特異的ではなく、アニリンブルーがカロース30以外のβ-1,3-グルカンを染色するため、高価で高度なカルロース計数ソフトウェアが必要です 23,24,26 はかなりの技術力を必要とし、蛍光分光光度法に伴う高い背景・自己蛍光のため、カロース定量は困難かつ信頼性に欠ける26。ImageJソフトウェアのような自動画像解析ワークフローに基づくカロース定量化手法は、ImageJ用のTrainable Weka Segmentation(TWS)などの画像解析プラグインの適切な訓練を必要とし、これは非常に煩雑な57です。

免疫蛍光分光光度測定に基づくアッセイは、その特異性、感度、使いやすさ、再現性の高さから非常に好まれています。ただし、検出システムや感度は、特定のアッセイプロトコルや使用する機器によって異なる場合があります。

ここでは、免疫蛍光分光光度法に基づく新しいカロース定量法を記述します。ここで説明した方法は、異なる植物組織や種におけるカロースの定量化に適用可能で、コロースに対する特異性、高精度かつ再現性を兼ね備えています。この方法は、さまざまなカラス定量法に加えられたもので、植物の成長・発生過程やさまざまな刺激・処理に対するカロースレベルの変化を監視するために利用できます。さらに、96ウェルプレートの使用により主観的なサンプリングや解析が削減され、高スループットのカルロス定量に適しています。注目すべきは、新たに収穫された植物組織からカロースを容易に抽出できるものの、この新しいプロトコルに含まれる凍結乾燥を含むサンプル準備工程により、サンプルを非常に長期間(最大1年)保存でき、生鮮度の高い生物学的サンプルを遠隔の研究所間で常温で保管・輸送できることです。これにより、新鮮なサンプル採取のために実験全体を何度も準備することなく、カロース抽出を繰り返すことが可能になります。

高スループットのカルロース定量実験には免疫蛍光分光光度法が推奨され、一方でエピフルオレッセンス顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡は、植物組織内のカロースの定量および組織局在の両方に用いられます。植物組織内のカロースの正確で効率的かつ信頼性の高い時空間分布を確保するために、顕微鏡法、分光光度法、酵素活性ベースの方法など、さまざまなカロース定量法を同時に用いることが推奨されます。したがって、これによりカロースがさまざまな生理的およびストレス反応に果たす役割を正確かつ効率的に理解できるようになります。将来の研究では、エピ蛍光顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、蛍光分光光度法、免疫蛍光分光光度法、酵素活性ベースの方法など、カロース定量のための複数の方法を包括的かつ同時に評価する可能性があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究はビル&メリンダ・ゲイツ財団の資金提供を受け、助成金番号はINV 009894/OPP1134098です。資金提供者は研究の設計に関与していません。データの収集、分析、解釈においても、原稿の執筆において、結果を発表するかどうかの決定にも影響を与えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルミニウム箔 キム・フェイEAリミテッド、ナイロビ、ケニア
分析的バランス メトラー・トレドAG、グライフェンゼー、スイスML204/01
ビードビーター96BioSpec Products Inc.、アメリカ合衆国オクラホマ州バートルズビル1001ユーロ
吸い紙とnbsp;キム・フェイEAリミテッド、ナイロビ、ケニア
牛血清アルブミン(BSA) サーモフィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国B14
遠心分離機、5425Rエッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ5406000240
冷蔵庫と冷凍庫の複合型(4 & deg;Cとマイナス;20 & deg;C) ハイアル医療検査有限公司、中国青達HYCD-282
ジタノールミン PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン191287
デジタルシェーカー、MixMateエッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ5353000529
リン酸二ナトリウム(Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン141679
ELISAプレート、96ウェル、平らな底、透明、ポリスチレン、高結合サーステットAG&KG中隊、N&ウムル;ムブレヒト、ドイツ82.1581.200
iMarkマイクロプレートリーダー用フィルター、iMark 680、405nmラセック・インターナショナル・Pty. Ltd.、ケープタウン、南アフリカBRD1681011
フリーズドライヤー、VirTis—ベンチトップ」K”シリーズ;モデル:4KBTXLLabWrench、カナダ、アメリカ合衆国448053
塩酸(HCl)およびnbsp;PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン141020
等温線強制対流インキュベーター(IFA-54-8)エスコ・ライフサイエンス・グループ、シンガポール2100002
ラミナリン アルファ・エーサール、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国J66193
マイクロ遠心分離機チューブ 1.5 mL エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ022363204
マイクロ遠心分離機チューブ 2 mL ジェネシー・サイエンティフィック社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国24–283
マイクロピペット(30–300 & mu;L)、12チャンネル、2100シリーズ エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツEP-12-300R
マイクロピペットチップ epT.I.P.S. シングルエッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ022363204
マイクロピペット(0.5–1000 & mu;L)、リサーチ プラスエッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ3123000900
マイクロプレート吸光検出器、iMarkBio-Rad Laboratories, Inc.(カリフォルニア、アメリカ合衆国)1681135EDU
Microplate Manager 6 バージョン6ソフトウェア Bio-Rad Laboratories, Inc.(カリフォルニア、アメリカ合衆国)1689520
パラフィルムポール・マリエンフェルト有限会社 &KG中隊、ラウダ・クウンム;ニグスホーフェン、ドイツ740751
パラニトロフェニルリン酸塩(pNPP)メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ20-106
pHメーター、HI9126ハンナ・インストゥルメンツ、ロードアイランド州ウーンソケット、アメリカ合衆国02310048991
ポリビニルピロリドン(PVP) PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペインA2260
塩化カリウム(KCl)PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペインA2939
二水素リン酸カリウム(KH2PO4)およびnbsp;PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン141509
精密水浴、GP10サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、アメリカ合衆国コネチカット州ニューイントンTSGP10
一次抗体(1-3-β;-グルカン指向マウスIgG) バイオサプライ オーストラリア株式会社、メルボルン、オーストラリア400-2
試薬貯留層 サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国15075
アルカリホスファターゼ(抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ)およびnbspに結合した二次抗体;シグマ・ライフサイエンス、ニュージャージー州、アメリカ合衆国A5153
アジ化ナトリウム(NaN3) PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペインA1430
炭酸ナトリウム(Na2CO3)およびnbsp;PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン141648
塩化ナトリウム(NaCl) PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペインA2942
炭酸ナトリウム(NaHCO3)およびnbsp;PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン141638
水酸化ナトリウム(NaOH)PanReac AppliChem ITW試薬、QuíマイカSLU、バルセロナ、スペイン141687.1210
トゥイーン-20Biomatik Corporation(オンタリオ州、カナダ)A4031
超純度蒸留水サーモフィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国10-977-015

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