現在のプロトコルの目標は、成魚のゼブラフィッシュの社会的選好アッセイを確立して使用するために必要な手順を概説し、エタノール誘発性の社会的欠陥を特徴付けるために使用できることを実証することです。
この記事について
サマリー
要約
胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、すべてのアルコール誘発性先天性欠損症を表します。成長障害、頭蓋顔面、行動、認知の異常などの先天性欠損症は、FASDに関連しています。社会的困難は、FASDに関連する一般的な行動異常であり、しばしば深刻な健康問題を引き起こします。動物モデルは、エタノールによる社会的欠陥の原因となるメカニズムを理解するために重要です。ゼブラフィッシュは、外部受精した透明な卵を産む社会性脊椎動物です。これらの特性により、研究者はFASDの表現型を作成するための正確かつ簡単な手順と、FASDに関連する社会的欠陥をモデル化するために活用できる生来の行動を得ることができます。 したがって、ゼブラフィッシュはFASDの社会的欠陥を特徴付けるのに理想的です。現在のプロトコルの目標は、発達の初期にネガティブな環境の結果と、それが成人期の社会的行動に及ぼす影響を特徴付けるために使用できる簡単な行動アッセイをユーザーに提供することです。このプロトコルは、突然変異または催奇形物質が成人の社会的行動に及ぼす影響を特徴付けるために使用できます。ここで概説するプロトコルは、20分間のソーシャルアッセイ中に個々の魚の社会的行動を特徴付ける方法を示しています。さらに、現在のプロトコールを使用して得られたデータは、プロトコールが成体ゼブラフィッシュにおける胚性エタノール誘発性社会的欠陥の影響を特徴付けるために使用できるという証拠を提供します。
概要
出生前のアルコール曝露は、胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)と総称されるさまざまな先天性欠損症を引き起こす可能性があります1。社会的困難などの行動障害は、FASD 2,3 に関連する一般的な先天性欠損症です。残念ながら、社会的な困難はしばしば深刻なメンタルヘルスの問題4を引き起こし、FASD患者の生活の質に悪影響を与える可能性があります。したがって、エタノール誘発性の社会的欠陥の原因となるメカニズムを理解することが最も重要です。
ゼブラフィッシュは生物学的および行動的特性を備えているため、エタノールによる社会的欠陥の原因となるメカニズムの理解を深めるのに適しています。例えば、ゼブラフィッシュは透明な体外受精卵を大量に産みます。これらの生物学的特性により、研究者は正確で複製可能なFASD表現型5を簡単に作成できます。受精後24時間(hpf)で胚をエタノールに曝露するには、解剖顕微鏡を使用して透明な卵子を検査し、Kimmelら6などの以前に発表された研究に基づいて胚をステージングし、卵子を所望のエタノール濃度で所望の期間置くだけです。絨毛膜はアルコールに対する弱い障壁であるため7、エタノールは胚を容易に浴びます。曝露を止めるには、エタノール溶液から卵を取り除くだけです。ゼブラフィッシュは、FASD表現型を作成するためのシンプルでありながら正確な方法を研究者に提供するだけでなく、ヒト遺伝子の70%がゼブラフィッシュのオルソログを持っているため、研究者がヒトとの遺伝的比較を行うことも可能にし、ヒトの疾患関連遺伝子を理解するための貴重なツールとなります8。さらに、他の動物モデルとは異なり、ゼブラフィッシュは浅瀬10と呼ばれる社会集団9を形成する。群れの行動は、胚性エタノール曝露が社会的行動に及ぼす影響を特徴付けるために使用できる11。さらに、ゼブラフィッシュでは、コンピュータ制御の社会刺激12または生きた社会刺激13を使用することにより、社会的反応を誘発することができる。
これまでの研究は、成魚のゼブラフィッシュの社会的反応をグループ14で特徴づけてきたが、このアプローチの限界は、個々の魚の行動を神経伝達物質レベルの変化などの特定の尺度と相関させることができないことである11。以下のプロトコルにより、ユーザーは個々の成魚のゼブラフィッシュの社会的行動を特徴づけることができます。社会的行動は個々の魚について獲得されるため、プロトコルのユーザーは、各魚の獲得された行動プロファイルを従属的な結果と関連付けることができるようになりました。例えば、先行研究は、胚性エタノール曝露が社会刺激11に対するドーパミン作動性反応を損なうことを示した。ここに示されているデータは独立変数として胚性エタノール曝露を使用していますが、プロトコルのユーザーは、他の薬理学的治療または遺伝子変異が社会的行動に及ぼす影響を特徴付けることができます。さらに、プロトコールのユーザーは、胚治療が行動をどのように変化させるかを調べるだけでなく、成体のゼブラフィッシュの急性薬理学的治療が社会的行動にどのように影響するかを決定することもできます15。
プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、サウスダコタ大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. ゼブラフィッシュの飼育、飼育、および胚性エタノール曝露
- ゼブラフィッシュを飼育し、繁殖させる16.
- エタノール曝露
- エタノール曝露を行う適切な発達段階を選択してください。このプロトコルでは、胚を24hpfでエタノールに曝露した。
- 卵を1.0%エタノール容量/容量に2時間15時間入れます。EM1 mLあたり1個の卵の比率が良い方法です。具体的には、胚を50mLの胚培地(EM;EMレシピについてはWesterfield16 を参照)に入れ、500μLのEMを取り出し、500μLのエタノールと交換します。
- エタノール曝露後、記載17のように胚を育てる。魚が生後16週のときの社会的行動を分析します。
2. ランダム化とタンクのセットアップ
- オンラインランダムシーケンスジェネレータを使用して、すべての試行を行動アッセイの実施に 先験的に ランダム化します。刺激側と治療群がランダムに異なることを確認してください。
- 時間帯や試験日などの交絡因子を避けるために、行動アッセイを毎日同時に開始および終了し、すべての実験魚が試験されるまで連続して行動試験を実施します。
- このアッセイ(図1)では、37Lタンク(50cm x 25cm x 30cm、L x W x H)を使用し、1.4Lタンクを前述の17と同様にタンクの幅に沿って外側に配置する。
- 37 Lタンクの背面と底部を白い波形のプラスチックで裏打ちして、実験的な魚と背景の間のコントラストを高め、ビデオトラッキングを改善します。
- 1.4L水槽の外壁に波形プラスチックを配置して、実験魚の社会的刺激のコントラストを高めます。最後に、1.4 Lタンクと37 Lタンクの間に白い波形プラスチックを配置します。この不透明なバリアは、実験魚が慣れるときに社会的刺激を見るのを防ぐために使用されます。
- 37 Lタンクと1.4 Lタンクの半分の全長をキャプチャするのに十分な距離にカメラを配置し、成魚の実験魚を正確に追跡します。
注:どちら側が刺激を保持しているかを確認することで、研究者がトラッキングゾーンに正しくラベルを付け、バックアップとして冗長性を確保できます。 - 赤外線トラッキングが使用されていない場合は、37Lタンクを照らしてください。市販の水族館用フードライトは、15 W T8フルスペクトルランプと一緒に使用してください。
注意: 複数のアリーナが設置されている場合は、同じ水槽のフードと同一のランプを使用してください。
3. ソーシャルアッセイの実施
- まず、ビヘイビアアッセイに使用した37Lタンクに、ハウジングラックに使用した水と同じ水を入れます。水温がハウジングラックから2°C以内であることを確認してください。
- 一日の終わりに37Lタンクを空にします。各テスト日は新鮮な水で始めてください。37 Lタンクの水位と1.4 Lタンクの水位が同じであることを確認してください。部屋の温度で37Lタンクの水が28.5°C2°Cに保たれない場合は、28.5°Cの温水と交換してください。
- 次に、対象ゾーンを設定します。ゾーンを作成するには、選択したユーザーズマニュアル追跡ソフトウェアを参照してください。このプロトコルでは、上部と下部の37 Lタンクの長さに沿って、巻尺を使用して5 cm刻みをマークしました。試験タンクが50cmの場合、5cm刻みで10個のゾーンがそれぞれ5cmになります。
- 37 Lタンクに付けられたマークを参考にして、ソフトウェアを使用して、上部の5 cmポイントを下部の対応する5 cmポイントに接続することにより、ゾーンを構築します。さらに、底面と刺激に沿ってゾーンを作成します。関心のあるゾーンをカスタマイズします。
- このプロトコルのトラッキングソフトウェアを使用して、ゾーンからの距離とゾーンで費やされた時間を測定します。このプロトコルでは、12のゾーンが使用されました。
- ゾーン1から10で費やした時間と、刺激からの距離と下部までの距離をゾーン1として定量化し、刺激に最も近いゾーンとしてゾーン10を刺激から最も遠いゾーンとして定量化します。
- 次に、ソーシャル刺激に使用するオス2人とメス2人を選択します。ベストプラクティスは、実験魚と同じコホートのオスとメスを使用することです。それが不可能な場合は、実験魚の系統、年齢、サイズに一致する魚を探してみてください。
- 実験魚をハウジングタンクからテストアリーナ(37Lタンク)に移します。ハウジングタンクで魚を捕まえるために網を使用してください。魚が入ったネットを魚の水の入った容器に入れます。
注:このアプローチを使用すると、水槽間を移動する際の実験魚のストレスが軽減されます。 - 実験用の魚をテストアリーナの中央に置きます。
- ユーザーが選択したソフトウェア(ユーザーズマニュアルを参照)に基づいて検出設定が満足のいくものになったら、20分間の試用を開始します。最初の10分間は、37 Lタンクと1.4 Lタンクの間の不透明なバリアをそのままにしておきます。これにより、実験魚は、2匹の雄ゼブラフィッシュと2匹の雌ゼブラフィッシュからなる社会的刺激を見ることができず、魚が試験場13,17に順応することを可能にする。
- 10分後、タンクの後ろから不透明なバリアを引っ張って慎重に取り除きます。これにより、実験魚は社会的な刺激を見ることができます。
- 追跡ソフトウェアを使用して、ユーザーの好みとソフトウェアマニュアルに基づいて、実験魚11、12、17の行動を追跡および定量化します。現在のプロトコルでは、社会的刺激とタンクの底からの距離、およびすべてのゾーンで費やされた時間を定量化します。
- 従来のデータ分析ツールを使用してデータを分析します。
結果
図2は、Fernandesら17から修正されたもので、胚性エタノール曝露が刺激からの距離を調べることにより、浅瀬の反応を鈍らせることを示しています。図2のデータは、20分間の試行中の社会的刺激からの距離を表しています。Y軸はセンチメートル単位の距離を示し、X軸は20分間の試行を1分間隔で示しています。X軸に沿った黒いバーは、不透明な障壁が取り除かれ、社会的刺激がテストフィッシュに見える時間を表しています。すべてのグループで、最初は社会刺激が見えるようになると、社会刺激に向かって急速に減少しますが、これは9分と10分の間の距離の急激な減少によって決定できますが、制御された魚は社会的刺激に非常に近いままですが、アルコールは処理されません。これは、胚性エタノール曝露が成人の社会的行動に影響を与えることを示唆しています12,18。
図3 は、Fernandesら17 から修正され、刺激までの距離の測定から収集されたデータを使用して、胚性エタノール曝露が浅瀬の応答に及ぼす影響をさらに示しています。 図3 のデータは、社会刺激が見えるようになると、それまでの距離が縮まることを示しています。刺激までの距離の平均減少を計算するため。刺激期間中(刺激が見えるとき)の刺激までの平均距離は、慣れ(社会的刺激が見えないとき)の刺激までの平均距離から差し引かれたため、負の値が大きいほど社会的反応が強いことを表します。
図4は、ゾーンで費やされた時間と刺激までの距離を示しています。図4はFernandes et al.17から修正されています。図4Aは、刺激が見える間に魚が各ゾーン(X軸)で過ごす時間(Y軸)を示しています。すべてのグループの魚は、社会的刺激制御に最も近いゾーンを好むようですが、魚はアルコール処理された魚と比較して、ゾーン1でほぼ2倍の時間を過ごします(図4B)。図4Cは、胚性エタノール曝露が可動性を損なわなかったことを示している、なぜなら、ゾーン間でグループ間に差がなかったからである。最後に、図4Dは、社会的刺激がない場合、魚は社会的刺激に最も近いゾーンで時間を過ごさないことを示しています。したがって、結果は、制御魚が見えるときに社会的刺激に非常に接近し、非常に近くにとどまるのに対し、エタノール処理された魚はそうではないことを示しています。さらに、図2および図4Cに示すデータは、胚性エタノール曝露が魚類の社会的刺激を見る能力(図2)または動く能力(図4C)を損なわないことを示唆しており、したがって、胚性エタノール曝露が成体のゼブラフィッシュの社会的行動を損なうという強力な証拠を提供します。
図1:行動装置の概略図。 37 Lタンクを使用して、成魚のゼブラフィッシュ(ZT140と命名)の社会的行動を、胚性エタノール曝露の有無にかかわらず分析しました。この図は、Fernandes et al.17から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胚性エタノール曝露は、成体のゼブラフィッシュの社会的行動を鈍らせる。 成魚の実験魚と生きた浅瀬との平均距離を、20 分間の行動セッションの 1 分間隔でプロットしました。SEM±平均が示されています。制御(n = 12);1%エタノール(EtOH;n = 11)。X軸の上の10分から20分までの水平バーは、実験対象に生きた浅瀬が見えるタイムラインを示しています。アルコール濃度はグラフの上に表示されます。この図は、Fernandes et al.17から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アルコール処理された魚は、生きた浅瀬からかなり離れています。 バーは、生きた浅瀬が見える前と見える後の生きた浅瀬からの魚の距離の差を表します。負の値が大きいほど、同種に対する反応が強いことを示唆しています。SEM±平均が示されています。SEM±平均が示されています。制御(n = 12);1%エタノール(EtOH;n = 11)。この図は、Fernandes et al.17から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:胚性エタノール曝露は、生きた浅瀬が見える場合にのみ、ゾーン1で過ごす時間を変化させる。 (A)バーは、刺激提示中に10のゾーンすべてで過ごした時間を表す。(B)バーは、刺激の提示中にゾーン1で費やされた時間を表します。ゾーン1はライブショールに最も近いゾーンで、ゾーン10はライブショールから最も遠いゾーンです。魚がゾーンで魚を制御する時間の長さに大きな違いがあることに注意してください。(C)バーは、最初の10分間、すべてのゾーンで費やされた時間の平均パーセンテージを表し、(D)バーは、順応中にゾーン1で費やされた時間を表します。SEM±平均が示されています。サンプルサイズは次のとおりです:コントロール(n = 12);エタノール(EtOH;n = 11)。この図は、Fernandes et al.17から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
ゼブラフィッシュは、遺伝子、環境、行動に関わる研究において非常に魅力的な生物であり、多くの生物学的および行動的特徴を持っています5,19。このプロトコルは、エンドユーザーに社会的行動をアッセイするための比較的簡単なガイド、社会的行動を量る複数の方法を提供し、個々の魚の行動応答を胚性エタノール曝露、遺伝子変異、または他の薬理学的物質などの治療と関連付ける可能性を持っています。
成体のゼブラフィッシュの社会的行動をアッセイするには、選択した追跡ソフトウェアのユーザーズマニュアルと併せて、このプロトコルに注意深く従ってください。テストアリーナを構築するには、蓋と軽量の波形プラスチックを備えた37Lタンク、社会的刺激のための2つの小さなタンク、およびカメラが必要です。これらのアイテムのほとんどは、ペットショップや大型小売店で購入できます。一匹のゼブラフィッシュがゼブラフィッシュの群と共に提示されると、一匹のゼブラフィッシュの自然な行動は、群までの距離を縮める一方で、群19に近接して過ごす時間を増やすことであり、この行動は浅瀬応答19と呼ばれる。浅瀬反応は、2つの方法で特徴付けることができる社会的行動である:第一に、社会的刺激が見えるとき、社会的刺激と単一の魚12 との間の距離を測定し、第二に、それが見えるときに社会的刺激に最も近いゾーンで過ごした時間を測定する。ゼブラフィッシュが社会的刺激が見えるときに5cmのゾーンで過ごす時間を定量化する能力を持つことは、これらの魚が平均して約4cmの長さであることを考えると、社会的反応の強力な証拠を提供します。
50 cmの水槽を10、5 cmのエリアに分割すると、テスト魚がどのゾーンにいる確率も同じであるため、統計分析に役立ちます。一見すると、同じ結果に対して 2 つのメジャーを持つことは冗長に見えます。ただし、冗長性によって検証を行うことができます。さらに、慣れ中の距離と期間の測定を使用して、治療が視力または運動に影響を与えるかどうかを判断できます。このプロトコルは、市販の自動追跡ソフトウェア13,18を使用しましたが、他の追跡システムや訓練を受けた観察者による手動追跡にも適しています。
使用する追跡ソフトウェアに関係なく、追跡を最適化するために取るべき重要な手順があります。まず、記録されている魚と比較してコントラストが強い背景を選択します。野生型のゼブラフィッシュは、金色と青色の横縞を持っています20。また、黄色のキサントフォア、銀色または青色のイリドフォア、および黒いメラノフォア20のモザイクもあります。したがって、AB野生魚の行動を特徴づけるときは白い背景12,13,17を使用し、一方、色素が不足しているキャスパーゼブラフィッシュの社会的行動を特徴付けるときは黒い背景17を使用する。次に、実験魚を追跡するのに十分な照明があることを確認します。複数のトラッキングアリーナがある場合は、アリーナ間で照明が同一であることを確認してください。もう1つの重要なステップは、37Lタンクの水位が1.4Lタンクの水位と一致することを確認し、テストフィッシュが社会的刺激のないエリアで泳げないようにすることです。さらに、ビデオを録画するときは、1.4Lタンクがフレーム内にあることを確認してください。これにより、データの手動コーディングが必要な場合や、スティミュラス側の検証が必要な場合のバックアップが提供されます。
プロトコル内の典型的な問題は、被験者が正しく追跡されていないこと、慣れ期間が不十分であること、および複数のアリーナが設置されている場合に不透明な障壁を引く際の短いタイムラグです。被写体が正しく追跡されないようにするには、前述のように魚と背景の間に十分なコントラストがあり、ソフトウェアのガイドラインに従っていることを確認してください。さらに、ユーザーのソフトウェアが赤外線追跡を許可している場合、コントラストに関連する問題を軽減できます。10分は慣れ期間としては長いように思えるかもしれませんが、私たちの未発表の研究は、慣れ時間を短縮することがプロトコルに悪影響を与えることを示唆しています。最後に、37 Lタンクと1.4 Lタンクの間の不透明なバリアを手動で引っ張る場合、複数のアリーナが設定されている場合、複数の人がバリアを引っ張っていない限り、すべてのバリアを同時に引っ張ることはできません。あるいは、アッセイを1人だけ実施している場合は、どのアリーナのバリアを最初に引っ張るかを釣り合わせる必要があります。
プロトコルは単純明快ですが、追跡ソフトウェアのコストと、魚を個別に特性評価するために必要な余分な時間が潜在的な落とし穴です。このプロトコルは、市販のソフトウェアを使用して実験魚の行動を追跡し、観察者のバイアスを回避し、複数のアリーナを設定して複数の魚を記録することでスループットを向上させます。このプロトコルでは商用ソフトウェアが使用されていましたが、フリーソフトウェアを含む他の追跡ソフトウェアが利用可能です。このプロトコルをエンドユーザーの選択の追跡とともに使用すると、ソーシャルアッセイが再現されます。このプロトコルでは、個々の魚の行動が特徴付けられました。また、ゼブラフィッシュ14 のグループを調べることに焦点を当てたものもありますが、これは一度に1匹の魚を特徴づけることの潜在的な落とし穴に対処する1つの方法です。あるいは、前述のように、複数のテストアリーナを同時に使用することで、個々の魚に行動プロファイルを割り当てる能力を維持しながら、スループットを向上させることができます。個々の魚の行動プロファイルを相関させる能力を維持することは、研究者が治療グループ内のばらつきを探す機会を与えるため、重要です。胚性エタノール曝露は、代表的なデータにおいて独立変数として使用されたが、現在のプロトコルで概説されている技術の将来の適用は、単に社会的行動に対する胚性エタノール曝露の影響を特徴づけることに限定されない。例えば、遺伝子突然変異21 または他の薬理学的治療22 が社会的行動に及ぼす影響を決定することができる。 さらに、胚性エタノール曝露以外にも、将来の研究は、他の催奇形物質が社会的行動に及ぼす影響を特徴づけることができる。 したがって、現在のプロトコルは、遺伝子や環境が社会的行動にどのように影響するかを理解することに関心のある研究者にとって有用です。
開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究を支援するための資金は、国立衛生研究所(NIH)/国立アルコール乱用研究所(NIAAA)[R00AA027567]からY.F.に提供されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.4リットルZT140アクアニーリングタンクアク | アニーリング | ZT140 | 社会的刺激のためのタンク |
| Aqueon 20 インチ デラックス蛍光フルフード水槽ライト | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | 37-I タンク用ライト | |
| Aqueon 標準オープンガラスガラス水槽タンク、10 ガロン | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | 37 リットルタンク、ソーシャルアッセイ用 | |
| エタノール | フィッシャーサイエンティフィック | BP28184 | |
| Ethovision XTトラッキングシステム | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| R対応カラーBasler GigEカメラ | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| 白い波形プラスチック | https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385 | 37-Iタンクの背面と底面、および社会的刺激に使用されるタンクの背面を裏打ちするプラスチック |
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