方法論記事

遺伝子コードセンサーを用いた ex vivoショウジョウバエ 幼虫脳におけるモノカルボン酸塩およびその他の関連代謝産物の可視化

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DOI：

10.3791/65846

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2023年10月27日

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1Biomedical Neuroscience Institute, Universidad de Chile, 2Advanced Scientific Equipment Network (REDECA), Faculty of Medicine, Universidad de Chile, 3Department of Neuroscience, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

この記事について

サマリー

ここでは、 ex-vivoショウジョウバエ の幼虫の脳調製において、遺伝的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー伝達ベースのセンサーを使用して、グリア細胞およびニューロンにおけるモノカルボン酸塩、グルコース、およびATPの輸送を視覚化するプロトコルを提示します。

要約

電気的活動による脳の高いエネルギー要件は、脳の最も際立った特徴の1つです。これらの要件は、グルコースおよび乳酸モノカルボン酸塩およびピルビン酸塩などのその代謝産物からのATPの産生によって満たされる。このプロセスがどのように規制されているのか、特にショウジョウバエでは、誰が主要なプレーヤーなのかはまだ不明です。

遺伝的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー移動ベースのセンサーを使用して、 ex-vivoショウジョウバエ 幼虫の脳調製物におけるグリア細胞およびニューロンにおけるモノカルボン酸塩およびグルコースの輸送を測定するための簡単な方法を提示します。このプロトコルでは、センサーの1つを発現している幼虫の脳を解剖し、ガラスのカバースリップに接着する方法を説明しています。

本稿では、幼虫の脳において、グリア細胞において同定されたモノカルボン酸トランスポーターをノックダウンすることにより、乳酸輸送を測定した実験全体の結果を提示する。さらに、神経細胞の活動を急速に増加させ、活動脳の代謝物の変化を追跡する方法を実証します。すべての必要な情報を提供する記載の方法は、他の ショウジョウバエ の生体組織を分析するために使用することができる。

概要

脳は、神経細胞の電気信号の生成と伝達、およびシナプス伝達によって引き起こされるニューロンのイオン勾配を回復するためのコストが高いため、高いエネルギー要件を持っています1,2。この高いエネルギー需要は、グルコースの連続的な酸化によって満たされ、ATP3を生成すると長い間考えられてきました。血液脳関門の特定のトランスポーターは、血液中のグルコースを脳に伝達します。一定のグリセミックレベルは、脳がグルコース4の安定した供給を受けることを保証します。興味深いことに、乳酸やピルビン酸などのグルコース代謝に由来する分子が、脳細胞のエネルギー産生に重要な役割を果たしていることを示唆する実験的証拠が増えています5,6。しかし、これらの分子がエネルギー生産にとってどれほど重要であるか、そして脳内のどの細胞がそれらを生成または使用するかについては、まだいくつかの議論があります7,8。この課題に必要な高い時間的・空間的分解能を備えた適切な分子ツールの欠如は、この論争を完全に解決することを妨げている重要な問題です。

いくつかの人工蛍光代謝センサーの開発と応用により、代謝産物がどこでどのように生成され、使用されるか、および基礎および高ニューロン活動中に代謝フラックスがどのように発生するかについての理解が著しく向上しました9。ATeam(ATP)、FLII12Pglu700μδ6(グルコース)、ラコニック(乳酸)、ピロニック(ピルビン酸)などのフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡に基づく遺伝的にコードされた代謝センサーは、脳のエネルギー代謝の理解に貢献しています10,11,12,13。しかし、生きた動物や組織で実験を行うには高いコストと高度な機器が必要であるため、脊椎動物モデルの結果は、主に細胞培養(グリア細胞とニューロン)に限定されています。

ショウジョウバエモデルを用いてこれらのセンサーを発現させることで、主要な代謝的特徴が種を超えて保存されており、その機能にこのツールで簡単に対処できることが明らかになりました。さらに重要なことに、ショウジョウバエモデルは、グルコースと乳酸/ピルビン酸がハエの脳内でどのように輸送および代謝されるか、モノカルボン酸の消費と記憶形成の関連性、および神経活動と代謝流束の増加がどのように重なるかの驚くべき実証に光を当てました14,15,16,17.幼虫の脳に発現する遺伝的にコードされたFRETセンサーを用いて、モノカルボン酸、グルコース、ATPレベルを測定するために今回紹介した方法により、研究者はショウジョウバエの脳がエネルギーをどのように使用しているかについてさらに学ぶことができ、それを他の動物の脳に適用することができます。

本手法がグリア細胞や神経細胞の乳酸やグルコースの検出に有効であること、グリア細胞への乳酸の取り込みにモノカルボン酸トランスポーター(Chaski)が関与していることを明らかにしました。また、GABAA 受容体拮抗薬の浴中塗布によって容易に誘導できる、神経活動の増加中の代謝物の変化を研究するための簡単な方法も示します。最後に、この方法論を使用して、脂肪体などの他の代謝的に重要な組織におけるモノカルボン酸およびグルコース輸送を測定できることを示します。

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プロトコル

1.ハエのひずみ維持と幼虫の同期

  1. これらの実験を行うには、酵母10%、グルコース8%、小麦粉5%、寒天1.1%、プロピオン酸0.6%、メチルパラベン1.5%からなる標準的な ショウジョウバエ の餌で25°Cで飼育したハエ培養物を使用します。
  2. このプロトコルに従うには、次の行を使用します: w1118 (実験的制御バックグラウンド)、OK6-GAL4(運動ニューロン用ドライバー)、レポ-GAL4(すべてのグリア細胞用ドライバー)、CG-GAL4(脂肪体用ドライバー)、UAS-Pyronic(ピルビン酸センサー)、UAS-FLII12Pglu700μδ6(グルコースセンサー)、UAS-Laconic(乳酸センサー)、UAS-GCaMP6f(カルシウムセンサー)、UAS-AT1.03NL(ATPセンサー)およびUAS-Chk RNAi GD1829。センサーまたはRNAiを発現するすべての系統は、 w1118 遺伝的背景にあります。
  3. 同期した3番目の星内放浪幼虫を得るには、300匹のハエ(生後3〜5日、雄100匹、処女雌200匹)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1%アガロースで覆われた60mmのシャーレを含む産卵室に入れます。プラークの中央に液体/クリーミーな酵母(直径1.5cm)を一滴垂らし、ハエが卵を産むように促します(図1)。
  4. ハエを25°Cで3日間保管し、アガロースペトリ皿を新鮮なシャーレと溶かしたばかりの酵母と1日2回交換します。
  5. 4日目にハエが4時間卵を産むのを待ってから、ペトリ皿を交換します。このプラークを取り除きます。次に、3時間、ハエが新しく溶解した酵母を含む新しいアガロースプラークに卵を産むのを待ちます。これらの幼虫を実験に使用してください。
  6. 3時間後、卵を含むプラークを取り除き、25°Cのインキュベーターに24時間入れます。
  7. このプラークから50〜100匹の新しく孵化した幼虫を集め(幼虫の孵化から0時間後)、標準的な餌が入ったプラスチック製のバイアルに入れます。幼虫が適切に餌を食べられるように、食べ物が粉砕され、柔らかくなっていることを確認してください。幼虫は移してから96時間後に使用します。

2.ポリ-L-リジンでガラスカバースリップを作ります

  1. このステップは、幼虫の解剖の1時間前に実行してください。6ウェル細胞培養プレートに、25 mmのガラス製カバーガラスを置きます(使用するカバーの直径は、顕微鏡で利用可能な記録チャンバーによって異なります)。
  2. ポリ-L-リジンを各カバーガラスの中央に滴下(300 μL)し、室温で30分間置きます。
  3. 各カバーガラスを蒸留水で3回洗浄し、次にCa2+ を含まない生理食塩水(幼虫の解剖に使用したのと同じ溶液、ステップ3.2を参照)で2回洗浄します。記録チャンバーにカバーを取り付け、Ca2+フリーの生理食塩水で満たします。
    注:幼虫の脳はガラスカバーガラスに直接付着できますが、接着力は弱く、生理食塩水が連続的に流れるため、実験中に脳が移動したり移動したりすることがあります。ポリ-L-リジンステップを添加することで、洗浄の結果としての動きや脳喪失のリスクが軽減されます。

3.腹側神経索(VNC)と脂肪体(FB)を解剖します

  1. 目的の遺伝子交配(ステップ1.7から)から放浪する3番目の星齢の幼虫を集め、蒸留水で3回徹底的に洗浄します。
  2. 128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl2、5 mMトレハロース、5 mM HEPES、および35 mMスクロース(pH = 6.7、pHメーターで測定し、1 M NaOHおよびHCl 37% v/vで調整)からなる公称ゼロのCa2+氷冷生理食塩水750μLを含むガラス製解剖皿ウェルに幼虫を入れます。
    注:前述したように、モノカルボン酸塩の輸送は溶液のpHに大きく依存するため、pHを6.7に設定することが重要です。さらに、6.7は3番目の幼虫17,18の血リンパ液のpHに相当します。
  3. 幼虫を実体顕微鏡の下に置き、一対の鉗子で腹部の後ろを横方向に切り裂きます。
  4. 鉗子で顎を押しながら、幼虫を裏返しにします。
  5. 顎の隣にある腹側神経索(VNC)を観察します。想像上の椎間板と残りの脳尾部組織を慎重に取り除きます。
  6. 神経を切断することにより、中枢脳と視神経葉を持つVNCを残りの組織から分離します。VNCを移し、残りの神経から鉗子で拾い上げ、Ca2+フリーの記録溶液(ステップ3.2と同じ溶液)を含む記録チャンバーに入れます。VNCはすぐにカバーガラスに付着します。
  7. 残った神経からの干渉を避けるために、鉗子を使用してカバーガラスの下部に取り付けます(使用するドライバーラインによっては、神経も蛍光を発します)(図2)。
  8. 別の一連の実験でグルコースまたはモノカルボン酸の輸送を測定する脂肪体(FB)で実験を行うには、手順3.1〜3.4に従って組織を分離します。幼虫が裏返しになったら、FBが白い両側の平らな組織であることを観察します。
  9. FRETセンサーを発現する単離されたFB(適切なドライバーを使用して遺伝子交配から得られた)を、Ca2+を含まない記録溶液を含む記録チャンバーに入れます。
    注:FBは疎水性が高く(溶液の表面に浮く傾向がある)、鉗子による操作に対して非常に脆弱であるため、取り扱いには注意が必要です。この組織を乱暴に扱うと、後で細胞が死んでしまいます(センサーの蛍光が低下します)。
  10. VNC/FBを含む記録チャンバーを顕微鏡ステージに置きます。

4. 生細胞イメージング

  1. 組織発現センサーの画像を取得するには、発光分解システムとCCDカメラを組み合わせた正立蛍光顕微鏡を使用します。実験を開始する30分前に顕微鏡の照明システムをオンにします。
    注:ここでは、20倍/0.5の水浸対物レンズを備えたスピニングディスク蛍光顕微鏡を使用して、VNCとFBの両方を観察します。 図 2 は、40倍/0.8の水浸対物レンズの使用も示しています。
  2. GCaMP6fの蛍光を可視化するには、励起波長を488 nm、発光波長を540 nmに設定します。ラコニック/パイロニック/ATP/グルコースセンサの場合、励起波長を440 nm、発光波長を488 nm(mTFP、CFP)および540 nm(金星、YFP)に設定します。
  3. GCaMP6fでは2秒ごと、ラコニック/パイロニック/ATP/グルコースセンサーでは10-30秒ごとに512 x 512ピクセルサイズの画像を取得します。得られた画像の品質を観察して、光源への最適な露出を決定します。このプロトコルに従うには、画像がラコニックおよびパイロニックセンサーの場合は300ミリ秒、グルコースおよびATPセンサーの場合は100〜150ミリ秒の露光であることを確認してください。
    注意: 曝露は、共焦点顕微鏡または通常の蛍光顕微鏡の使用によって異なる場合があります。
  4. 記録チャンバーを顕微鏡のステージに取り付けたら、水浸対物レンズを慎重に配置し、実験中、対物レンズが水没したままであることを確認してください。室温は25°Cに保ちます。
  5. 記録チャンバーを灌流システムに接続し、128 mM NaCl、2 mM KCl、1.5 mM CaCl2、4 mM MgCl2、5 mMトレハロース、5 mM HEPES、および35 mMスクロース、pH 6.7(pHメーターで測定し、NaOHおよびHClで調整)を含む記録溶液に組織を浸し続けます。
  6. 重力を利用して組織内を通る記録溶液の3 mL/分の一定の流量を維持し、低フラックスの蠕動ポンプと組み合わせて、容量を一定に保ちながらチャンバーから液体を抽出します。必要な流量を得るには、溶液含有チューブ(50 mLプラスチックチューブ)を顕微鏡ステージの25cm上に配置します。
    注:この重力駆動の流れは、蠕動ポンプによって引き起こされる組織の動きを防ぐために使用され、後でより正確な画像分析を可能にします。
  7. 刺激の前に、記録溶液を5〜10分間流し続けて、センサーから安定した蛍光のベースラインを取得します。このベースラインを取得するために、必要に応じて期間を変更します。
  8. 流動溶液を刺激溶液と5分間交換して、VNC / FBを刺激します(生理食塩水に溶解した各実験で説明した濃度のグルコース、ピルビン酸、または乳酸で、各図を参照)。
    注:刺激の持続時間は、実験の必要性に応じて変化させることができる(例えば、以前に報告されたように、グルコースパルスを10分に増やしてニューロンのプラトーに達することができる16)。
  9. 刺激液中の浸透圧を維持するには、添加するモノカルボン酸またはグルコースの濃度に応じて、ショ糖濃度(ショウ ジョウバエ の脳で代謝されない炭水化物)を整流します。
  10. シンプルなバルブシステムを使用してソリューションを変更します。顕微鏡ステージを動かさないように注意してください。
  11. VNCを80μMのピクロトキシン(PTX、連続的に流れる)に曝露して、ニューロンの活動を刺激します。この手順により、Ca2+ 振動の頻度が増加し、代謝的に関連する分子(細胞内ATPなど)の変化を観察することが可能になります。
  12. 実験の最後に、チューブと記録チャンバーを含むフローシステム全体を生理食塩水で少なくとも10分間、蒸留水でさらに10分間完全に洗浄して、使用した溶液の痕跡を取り除きます。

5. 画像処理とデータ解析

  1. 取得した画像を処理するには、 図 3 に示す手順に進みます。
  2. 画像(Laconic)をImageJソフトウェアにインポートします。この画像にはサンプルの2つのビューがあり、左がmTFP信号、右が金星信号です。解析する細胞を含む領域を選択し、これらの画像(mTFPと金星)を新しいウィンドウで分離します。これらの画像にまったく同じ領域が含まれていることを確認します。
  3. レジストレーションプラグインを開き、剛体関数を用いた実験で通常観察される組織の小さなドリフトを補正します。これを両方の画像(mTFPと金星)で実行します。
  4. mTFPシグナル(488 nm)の対応する10個の細胞の細胞質で少なくとも10個の関心領域(ROI)を選択し、その選択をVenus(540 nm)画像に転送します。
  5. 分析対象の細胞の近くにあるが、識別可能なシグナルがないROIを2つまたは3つ選択します(常に分析対象のVNCまたは組織内、 図3を参照)。これらは背景のROIです。
  6. 両方のイメージで ROI を選択した状態で、関数 measure を使用して各信号の平均グレー値を取得します。データをデータシートに転送し、各信号の平均バックグラウンド値を減算します。
  7. 金星のmTFP蛍光比を決定します(ラコニックとパイロニックの場合)。この値は、ここで説明する他のFRETセンサー(比率は通常YFP/CFP)とは異なる方法で計算されますが、これは、それぞれの基板に結合すると、ラコニックとパイロニックの両方がFRET効率を低下させるためです。
  8. 記録された各値をベースラインで除算してデータを正規化します。別のデータシートで、刺激の前の2分間のmTFP/Venus比の平均値を使用してベースラインを計算します。
  9. FRETベースのセンサーを使用したグルコースとATPの測定では、YFP/CFP比を計算し、ステップ5.8の説明に従ってデータを正規化します。

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結果

この手順により、最大1時間、モノカルボン酸およびグルコースセンサーの蛍光の細胞内変化を簡単に測定できます。 図4に示すように、グリア細胞と運動ニューロンの両方のラコニックセンサーは、パルスの開始時に1mMの乳酸に同様の速度で応答しますが、運動ニューロンは、以前に実証されたように、5分間のパルス中にベースラインよりも高い増加に達します17。この乳酸濃度が選ばれたのは、第3齢幼虫の血リンパ液に見られるレベルに匹敵するからです。同様に、VNC発現グルコースセンサーが5mMのグルコース(私たちらによって血リンパで測定された値と同様の値)に曝露されたとき19、センサーのシグナルはグリア細胞とニューロンで同様の速度で増加しました。しかし、グルコースパルスの間、ニューロンの信号はグリア細胞よりも増加します。これは、同様のFRETセンサー発現調製物の以前の観察と一致している16。

この調製物は、 ...

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ディスカッション

ショウ ジョウバエ モデルを脳代謝の研究に用いるのは比較的新しいことであり26、哺乳類の代謝と予想以上に多くの特徴を共有することが示されており、これは主に初代ニューロン培養または脳スライスで in vitro で研究されてきた。 ショウジョウバエ は、一連の遺伝的ツールと遺伝的にコード化されたセンサーのおかげで、研究者が誘発された活動や感覚刺激に反応して引き起こされる代謝変化をリアルタイムで視覚化できるため、 in vivo 実験に優れています。

ここに記述されているプロトコルは休息し、活動的なニューロンの新陳代謝の変更の時転倒のビデオを作るのにFRETの顕微鏡検査に基づいて遺伝的にコードされた蛍光代謝センサーの使用を可能にするex-vivo準備のショウジョウバエVNCのglial細胞そしてニューロンのmonocarboxylateそしてブドウ糖の輸送を測定する方法を示す。このプロトコルは、発光分割システムを備えた落射蛍光顕微鏡...

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開示事項

著者は、競合または金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

Sierralta Labのメンバーの皆様に感謝いたします。この研究は、FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGGへ) と FONDECYT Regular 1210586 (JSへ) の支援を受けました。UAS-FLII12Pglu700μδ6 (グルコースセンサー) は、CNRS-ParisのPierre-Yves Plaçais氏とThomas Preat氏のご厚意により寄贈されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースシグマA9539
CaCl2SigmaC3881
CCDカメラ ORCA-R2浜松
セルRソフトウェアオリンパス-
CG-GAL4ブルーミントン ショウジョウバエストックセンター7011ファットボディドライバー
デュモン #5 鉗子ファインサイエンスツール11252-30
DV2 発光分割システムフォトメトリクス-
ガラス カバースリップ (直径 25 mm )マリエンフェルド111650ドイツ
グルコースシグマG8270
GraphPad プリズムGraphPad ソフトウェアバージョン 8,0,2
HEPESシグマH3375
ImageJ ソフトウェア国立衛生研究所バージョン 1,53t
KClSigmaP9541
LUMPlanFl 40x/0.8 水浸対物レンズオリンパス-
メチルパラベンΣH5501
MgCl2SigmaM1028
NaClΣS7653
OK6-GAL4ブルーミントンショウジョウバエストックセンター運動ニューロンドライバー
ピクロトキシンシグマP1675S注意-飲み込むと致命的
ポリ-L-リジンΣP4707
プロピオン酸シグマP1386
レポ-GAL4ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター7415グリア細胞ドライバー (すべて)
乳酸ナトリウムΣ 71718
ピルビン酸ナトリウムΣP2256
スピニングディスク蛍光顕微鏡 BX61WIオリンパス・
スクロース ΣS0389
トレハロース US バイオロジカルT8270
UAS-AT1.03NL 京都ショウジョウバエストックセンター117012ATPセンサー
UAS-Chk RNAi GD1829ウィーン ショウジョウバエリソースセンターv37139Chk RNAiライン
UAS-FLII12Pglu700md6 ブルーミントンショウジョウバエストックセンター93452グルコース
センサーUAS-GCaMP6f ブルーミントンショウジョウバエストックセンター42747
センサーUAS-LaconicSierralta Lab-乳酸
センサーUAS-PyronicPierre Yves Placais / Thomas
UMPlanFl 20x / 0.5水浸対物レンズオリンパス
カルシウム Preat-CNRS-Paris -

参考文献

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