遺伝子コードセンサーを用いた ex vivoショウジョウバエ 幼虫脳におけるモノカルボン酸塩およびその他の関連代謝産物の可視化

サマリー

ここでは、 ex-vivoショウジョウバエ の幼虫の脳調製において、遺伝的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー伝達ベースのセンサーを使用して、グリア細胞およびニューロンにおけるモノカルボン酸塩、グルコース、およびATPの輸送を視覚化するプロトコルを提示します。

要約

電気的活動による脳の高いエネルギー要件は、脳の最も際立った特徴の1つです。これらの要件は、グルコースおよび乳酸モノカルボン酸塩およびピルビン酸塩などのその代謝産物からのATPの産生によって満たされる。このプロセスがどのように規制されているのか、特にショウジョウバエでは、誰が主要なプレーヤーなのかはまだ不明です。

遺伝的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー移動ベースのセンサーを使用して、 ex-vivoショウジョウバエ 幼虫の脳調製物におけるグリア細胞およびニューロンにおけるモノカルボン酸塩およびグルコースの輸送を測定するための簡単な方法を提示します。このプロトコルでは、センサーの1つを発現している幼虫の脳を解剖し、ガラスのカバースリップに接着する方法を説明しています。

本稿では、幼虫の脳において、グリア細胞において同定されたモノカルボン酸トランスポーターをノックダウンすることにより、乳酸輸送を測定した実験全体の結果を提示する。さらに、神経細胞の活動を急速に増加させ、活動脳の代謝物の変化を追跡する方法を実証します。すべての必要な情報を提供する記載の方法は、他の ショウジョウバエ の生体組織を分析するために使用することができる。

概要

脳は、神経細胞の電気信号の生成と伝達、およびシナプス伝達によって引き起こされるニューロンのイオン勾配を回復するためのコストが高いため、高いエネルギー要件を持っています^1,2。この高いエネルギー需要は、グルコースの連続的な酸化によって満たされ、^ATP3を生成すると長い間考えられてきました。血液脳関門の特定のトランスポーターは、血液中のグルコースを脳に伝達します。一定のグリセミックレベルは、脳がグルコース⁴の安定した供給を受けることを保証します。興味深いことに、乳酸やピルビン酸などのグルコース代謝に由来する分子が、脳細胞のエネルギー産生に重要な役割を果たしていることを示唆する実験的証拠が増えています^5,6。しかし、これらの分子がエネルギー生産にとってどれほど重要であるか、そして脳内のどの細胞がそれらを生成または使用するかについては、まだいくつかの議論があります^7,8。この課題に必要な高い時間的・空間的分解能を備えた適切な分子ツールの欠如は、この論争を完全に解決することを妨げている重要な問題です....

プロトコル

1.ハエのひずみ維持と幼虫の同期

1. これらの実験を行うには、酵母10%、グルコース8%、小麦粉5%、寒天1.1%、プロピオン酸0.6%、メチルパラベン1.5%からなる標準的な ショウジョウバエ の餌で25°Cで飼育したハエ培養物を使用します。
2. このプロトコルに従うには、次の行を使用します: w¹¹¹⁸ (実験的制御バックグラウンド)、OK6-GAL4(運動ニューロン用ドライバー)、レポ-GAL4(すべてのグリア細胞用ドライバー)、CG-GAL4(脂肪体用ドライバー)、UAS-Pyronic(ピルビン酸センサー)、UAS-FLII¹²Pglu700μδ6(グルコースセンサー)、UAS-Laconic(乳酸センサー)、UAS-GCaMP6f(カルシウムセンサー)、UAS-AT1.03NL(ATPセンサー)およびUAS-Chk RNAi GD1829。センサーまたはRNAiを発現するすべての系統は、 w¹¹¹⁸ 遺伝的背景にあります。
3. 同期した3番目の星内放浪幼虫を得るには、300匹のハエ(生後3〜5日、雄100匹、処女雌200匹)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1%アガロースで覆われた60mmのシャーレを含む産卵室に入れます。プラークの中央に液体/クリーミーな酵母(直径1.5cm)を一滴垂らし、ハエが卵を産むように促します....

結果

この手順により、最大1時間、モノカルボン酸およびグルコースセンサーの蛍光の細胞内変化を簡単に測定できます。 図4に示すように、グリア細胞と運動ニューロンの両方のラコニックセンサーは、パルスの開始時に1mMの乳酸に同様の速度で応答しますが、運動ニューロンは、以前に実証されたように、5分間のパルス中にベースラインよりも高い増加に達します¹⁷。この乳酸濃度が選ばれたのは、第3齢幼虫の血リンパ液に見られるレベルに匹敵するからです。同様に、VNC発現グルコースセンサーが5mMのグルコース(私たちらによって血リンパで測定された値と同様の値)に曝露されたとき¹⁹、センサーのシグナルはグリア細胞とニューロンで同様の速度で増加しました。しかし、グルコースパルスの間、ニューロンの信号はグリア細胞よりも増加します。これは、同様のFRETセンサー発現調製物の以前の観察と一致している¹⁶。

この調製物は、 .......

ディスカッション

ショウ ジョウバエ モデルを脳代謝の研究に用いるのは比較的新しいことであり²⁶、哺乳類の代謝と予想以上に多くの特徴を共有することが示されており、これは主に初代ニューロン培養または脳スライスで in vitro で研究されてきた。 ショウジョウバエ は、一連の遺伝的ツールと遺伝的にコード化されたセンサーのおかげで、研究者が誘発された活動や感覚刺激に反応して引き起こされる代謝変化をリアルタイムで視覚化できるため、 in vivo 実験に優れています。

ここに記述されているプロトコルは休息し、活動的なニューロンの新陳代謝の変更の時転倒のビデオを作るのにFRETの顕微鏡検査に基づいて遺伝的にコードされた蛍光代謝センサーの使用を可能にするex-vivo準備のショウジョウバエVNCのglial細胞そしてニューロンのmonocarboxylateそしてブドウ糖の輸送を測定する方法を示す。このプロトコルは、発光分割システムを備えた落射蛍光顕微鏡.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	シグマ	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCDカメラ ORCA-R2	浜松
セルRソフトウェア	オリンパス	-
CG-GAL4	ブルーミントン ショウジョウバエストックセンター	7011	ファットボディドライバー
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11252-30
DV2 発光分割システム	フォトメトリクス	-
ガラス カバースリップ (直径 25 mm )	マリエンフェルド	111650	ドイツ
グルコース	シグマ	G8270
GraphPad プリズム	GraphPad ソフトウェア	バージョン 8,0,2
HEPES	シグマ	H3375
ImageJ ソフトウェア	国立衛生研究所	バージョン 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 水浸対物レンズ	オリンパス	-
メチルパラベン	Σ	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Σ	S7653
OK6-GAL4	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター		運動ニューロンドライバー
ピクロトキシン	シグマ	P1675S	注意-飲み込むと致命的
ポリ-L-リジン	Σ	P4707
プロピオン酸	シグマ	P1386
レポ-GAL4	ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター	7415	グリア細胞ドライバー (すべて)
乳酸ナトリウム		Σ 71718
ピルビン酸ナトリウム	Σ	P2256
スピニングディスク蛍光顕微鏡 BX61WI	オリンパス	・
スクロース Σ		S0389
トレハロー	ス US バイオロジカル	T8270
UAS-AT1.03NL	京都ショウジョウバエストックセンター	117012	ATPセンサー
UAS-Chk RNAi GD1829	ウィーン ショウジョウバエリソースセンター	v37139	Chk RNAiライン
UAS-FLII12Pglu700md6	ブルーミントンショウジョウバエストック	センター93452	グルコース
センサーUAS-GCaMP6f	ブルーミントンショウジョウバエストック	センター42747
センサーUAS-Laconic	Sierralta Lab	-	乳酸
センサーUAS-Pyronic	Pierre Yves Placais / Thomas
UMPlanFl 20x / 0.5水浸対物レンズ	オリンパス

カルシウム Preat-CNRS-Paris -