我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10 マウスにおけるこれらの細胞の網膜下送達のための詳細なプロトコルについて記述する。
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方法論記事
rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ヒト多能性幹細胞を用いた視細胞の再生は、進行期の遺伝性網膜疾患と老化性網膜疾患の両方を治療するための有望な治療法です。ヒト組換え網膜特異的ラミニンアイソフォームマトリックスは、ヒト胚性幹細胞(hESC)の視細胞前駆細胞への分化をサポートできることを示しました。さらに、これらの細胞の網膜下注射も、 rd10 げっ歯類およびウサギモデルで部分的な回復を示しています。網膜下注射は、標的空間に近いため、眼の視細胞および網膜色素上皮(RPE)層に医薬品化合物を送達するために使用されている確立された方法であることが知られています。また、網膜疾患を治療するために、アデノ随伴ウイルスベクターを網膜下腔に送達するためにも使用されています。マウスモデルにおける医薬品化合物および細胞の網膜下送達は、マウス眼球のサイズに制約があるため、困難である。このプロトコルは遺伝の網膜色素変性症の突然変異体、 rd10 マウスのこれらのセルの注入そして網膜の下配達技術のためのhESC得られた光受容体の祖先のセルの準備のための詳しいプロシージャを記述する。このアプローチにより、標的領域、特に視細胞変性につながる疾患が発生する網膜の外側の核層への細胞治療が可能になります。
概要
遺伝性の網膜疾患や加齢黄斑変性症は、視細胞の喪失や最終的には失明につながります。網膜光受容体は、光伝達(すなわち、光をニューロン信号に変換すること)に関与する特殊な細胞で構成される網膜の外側セグメント層です。桿体および錐体視細胞は、網膜色素層(RPE)1に隣接しています。細胞の損失を補うための光受容体細胞補充療法は、新しく発展している治療アプローチです。損傷した視細胞を修復するために、胚性幹細胞(ESC)2,3,4、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来RPE細胞、網膜前駆細胞(RPC)4,5,6,7,8を使用しました。網膜下腔、網膜とRPEの間の閉鎖空間は、その近傍のために損傷した視細胞、RPE、およびミューラー細胞を置き換えるためにこれらの細胞を沈着させる魅力的な場所です9,10,11。
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プロトコル
in vivo実験は、SingHealthの動物管理および使用委員会(IACUC)および眼科および眼科研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って行われました。仔犬は、シクロスポリン(260 g / L)を含む飲料水を与えることにより、P17(移植前)からP30(移植後)までの免疫抑制を行いました。
1. 凍結保存後の32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製
- 37°Cのウォーターバスで予熱した光受容体分化培地(PRDM)。
- 液体窒素から32日目のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞を含むクライオバイアルを回収します。ドライアイスの上に保管してください。
- クライオバイアルを37°Cのウォーターバスで3〜5分間解凍します。32日目の細胞を1 mLのPRDMに再懸濁し、130 x g で4分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を 1 mL の PRDM に再懸濁します。
- 細胞計数のために10 μLの混合物を取り除きます。メーカーの指示に従って、0.2%トリパンブルーを使用して細胞を混合します。細胞混合物を細胞計数チャンバースライドにピペットで移します....
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結果
10 μL のガラスシリンジはメーカーの指示に従って組み立て(図 1)、細胞懸濁液/培地の送達に使用した鈍い針を 図 1B に示します。網膜下注射のさまざまなアプローチを 図2に示します。このプロトコルでは、pars planaアプローチについて説明します(図2C)。ガラス注射器に取り付けられた鈍い針は、硬化切開の傷口から挿入され、世界中の網膜下腔にアクセスしました。 図3Aに示すように、注射を行う際に、針の軌跡、網膜の貫通、および細胞の送達を顕微鏡下で直接モニターした。細胞/培地の送達が成功したことは、注入部位のブレブを観察することで確認されました(図3B)。成功したブレブは、水風船に似た薄い白っぽい色として識別できます。送達の失敗は、注射部位の硝子体腔への細胞/培地の漏出とブレブ.......
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ディスカッション
網膜下注射は、RPEおよび網膜疾患を治療するための細胞懸濁移植に使用されています23,25,26,27,28,31,40。このアプローチは、細胞移植や遺伝子治療のアプローチだけでなく、網膜疾患の新規治療化合物を評価するためにも、げっ歯類の研究において非常に重要です。現在、細胞またはAAVを網膜下腔に送達するために、3つの主要な経路、すなわち経角膜経路、経硬化経路、および扁平筋経路が使用されています。
経角膜アプローチでは、注射針が角膜、瞳孔、そして最後に網膜を通過して細胞を網膜下腔に送り込み、成功したブレブを形成します。経.......
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開示事項
Hwee Goon Tayは、Alder Therapeutics ABの共同設立者です。他の著者は、競合する利害関係がないと宣言しています。
謝辞
凍結保存後32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製に技術支援を提供してくれたWei Sheng Tan氏、Luanne Chiang Xue Yen氏、Xinyi Lee氏、Yingying Chung氏に感謝します。この研究の一部は、National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017)およびNational Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)からH.G.T.への助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.3% トブラマイシン | ノバルティス | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% フェニレフリン塩酸塩 | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G 使い捨て針 | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm 長さ 鈍い針 | Hamilton | 7803-05 | |
| 自動セルカウンター | NanoEnTek | モデル:イブ | |
| ビタミンAを含まないB27 | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| ブプレノルフィン | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| 32日目 hESC由来の光受容体前駆細胞 | DUKE-NUS Medical School | ヒト胚性幹細胞を32日間分化させます。参考文献36のプロトコルを参照してください。 | |
| ガーゼ | ウィナー インダストリーズ(株) | 1SNW475-4 | |
| グラスゴーミニマムエッセンシャルミディアム | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| ヒト脳由来神経栄養因子 (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santéアニマル | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 & マイクロ;g36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| マイクロリットルガラスシリンジ (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル)]-S-フェニルグリシン t-ブチルエステル (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| >N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| >NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| 手術用顕微鏡 | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | iOCT機能内蔵 |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | メディア組成36を参照してください。基礎中、10 & マイクロ;M DAPT、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL CNTF、0.5 & マイクロ;Mレチノイン酸、2%B27および1%N2。基礎培地:1x GMEM、1 mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mM B-メルカプトエタノール、1x非必須アミノ酸(NEAA)。 | |
| ピルビン酸 | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| >Rd10マウス | ジャクソン研究所 | B6。CXB1-Pde6brd10/Jマウス | 性別:雄/雌、年齢:P20(注射)、体重:3-6 g |
| レチノイン酸 | トクリス バイオサイエンス | 0695/50 | 0.5 & マイクロ;M36 |
| 丸型カバースリップ (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 & micro;M36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
参考文献
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
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