閉鎖性軽度外傷のラットモデルとその検証

サマリー

本稿では、急性期および亜急性期の行動症状に関して、ヒトmTBIと顕著な類似性を示す閉鎖頭軽度外傷性脳損傷(mTBI)ラットモデルとその検証について紹介する。

要約

動物モデルは、軽度外傷性脳損傷(mTBI)の理解を深め、臨床研究を導くために重要です。有意義な洞察を得るためには、安定した再現性のある動物モデルの開発が不可欠です。本研究では、Sprague-Dawleyラットを用いたクローズドヘッドmTBIモデルと代表的な検証法について詳細に記述し、モデリング効果を検証した。このモデルでは、550gの重りを100cmの高さから破壊可能な表面のラットの頭に直接落下させ、その後180度回転させます。損傷を評価するために、ラットは損傷後10分後に、意識喪失時間、最初のシーク行動時間、脱出能力、およびビームバランス能力テストを含む一連の神経行動学的評価を受けました。受傷後の急性期および亜急性期には、運動協調能力(ビーム課題)、不安(オープンフィールドテスト)、学習能力と記憶能力(モリスウォーターメイズテスト)を評価するための行動テストが実施されました。クローズドヘッドmTBIモデルは、死亡率を最小限に抑え、実際の状況を再現した一貫した損傷反応を示しました。この検証手法は、モデル開発を効果的に検証し、モデルの安定性と一貫性を確保しました。

概要

軽度外傷性脳損傷(mTBI)、または脳震盪は、最も一般的なタイプの損傷であり、さまざまな短期的および^{慢性的な症状}を引き起こす可能性があります1。これらの症状には、めまい、頭痛、うつ病、無快感症などがあり、mTBI²の影響を受けた個人に重大な苦痛をもたらします。ほとんどのmTBIは鈍器による外傷によって引き起こされるため³、そのような損傷を正確に模倣する動物モデルの開発が不可欠になります。これらのモデルは、損傷とその根底にあるメカニズムをよりよく理解するために不可欠であり、人間の研究と比較して変動性と異質性が低減された制御された環境を提供します。

外傷性脳損傷(TBI)については、流体衝撃損傷(FPI)⁴、制御皮質衝撃(CCI)⁵、重量低下損傷⁶、爆風外傷性脳損傷⁷など、数多くの確立されたげっ歯類モデルが開発されています。ただし、これらのモデルは、主に中等度から重度の TBI シナリオの再現に重点を置いています。対照的に、mTBIをシミュレートするために特別に設計された実験モデルは、比較的注目されておらず、未調査のままです⁸。したがって、mTBIを正確に表す安定した再現性のある動物モデルを確立することが非常に重要です。このようなモデルは、mTBIに関連する神経生物学的および行動的影響の理解を大幅に強化します。

mTBIラットの機能的欠損は、麻酔効果が切れた後のカジュアルな観察では、正常ラットと比較することはできません。したがって、特定のテストを実施する必要があります。ヒトでは、患者を評価するために幅広い臨床評価が用いられている^9,10,11。同様に、ラットモデルで成功するモデルを確立するには、迅速な評価ツールを使用してその妥当性を判断する必要があります。

本研究では、ヒトの状態に近似したmTBIの解析を可能にする閉鎖頭型mTBIラットモデルを提示します。モデルとその検証手順の詳細な説明により、mTBIの研究に利用される実験的アプローチを包括的に理解できます。

プロトコル

動物実験は、中南大学動物管理委員会によって承認されました。すべての研究は、実験動物の福祉と倫理の原則に沿って実施されました。

1.動物の給餌と麻酔の手順

1. 280〜320 gのSprague-Dawleyオスラットをグループ化し、12時間/ 12時間の明暗サイクルで維持し、自由に餌 と水にアクセスできます。ラットが6日間順応した後、研究を実施します。
2. ラットが足または尾のつまみに反応しなくなるまで、誘導ボックス内の0.6 L / minの気流で3%イソフルランでラットを麻酔します。.流量を30秒間維持します。
   注:鎮痛剤は、神経行動学的評価におけるラットの反応を妨げるため、使用されませんでした。

2. 術前設定

1. 硬度35D(スポンジの重量35kg/m3)で、長さと幅は同じで厚さは12cmのスポンジを、トップカバーのないアクリルボックス(15 cm x 22 cm x 43 cm)に入れます。
2. 錫箔(厚さ20μm)を切り取り、粘着テープでアクリル箱に貼り付けると、ネズミの体重を支えることができる破壊可能な表面を形成します。さらに、ラットの頭を配置するための指定された場所となる約10cmのカットラインをマークします。
3. アイロンスタンドを使用して、PVCチューブを所定の位置にしっかりと固定します。直径18ミリメートルで重さ550グラムの穴あき重りを準備します。ポリ塩化ビニルまたはPVCチューブ内の1メートルの高さで釣り糸に重りを取り付けます。そして、スズ箔の3センチ上のガイドチューブの位置を調整します。
4. ヘルメットと枕を用意します。直径10mm、厚さ3mmのステンレス製の円盤を使ってヘルメットを作ります。くさび形のスポンジ枕を用意して、ネズミの頭の下に置き、重力方向に対して垂直になるようにします。
   注:衝撃装置の概略図を 図1に示します。ヘルメットは、衝撃の場所を特定し、外力の分散を強化する目的を果たします。枕は、均一で安定した損傷を保証するために利用されています。

3. mTBI誘導

1. 麻酔をかけたラットを胸の錫箔の上にすばやく置きます。
   注:mTBI誘導には2人のオペレーターが必要であり、1人は準備用、もう1人は検証用です。
2. 準備:枕をネズミの下に置き、ネズミの頭がホイル紙と平行になるようにします。ヘルメットをネズミの耳に合わせ、所定の位置に固定します。
3. 確認:塩ビパイプがヘルメットの真上に配置されていることを確認します。両方のオペレーターが正しい設定を確認したら、次の手順に進みます。
4. 頭の回転の誘導:重りを解放し、落下させてラットの頭にぶつからせ、スポンジへの落下と180°の回転を誘発します。
5. ネズミを清潔なケージに仰向けに置きます。

4.偽の誘導

1. ラットは、以前のmTBI誘導の説明と同じ方法で扱いますが、頭部に衝撃を与えないでください。

5.検証手順:急性神経行動学的評価

注: 以下の評価は、神経学的重症度スコア⁹ と Flierl et ^al.10 によるプロトコルに基づいて修正されました。これらの評価はすべて、ラットが正立反射を回復してから10分後に実施されました。

1. 意識喪失時間:ラットが麻酔されてから正動反射が回復するまでの時間を記録します。
   注:直立反射は、ネズミを仰向けにしたときにひっくり返るプロセスです。矯正反射の喪失は人道的なエンドポイントと見なされるべきであり、動物は施設のガイドラインに従って安楽死させる必要があります。
2. 最初のシーク行動時間:ラットが麻酔されてから、初めてシーク行動を示すまでの時間を記録します。
   注:行動を求めることは、環境への関心の表れであり、生理学的反応です。
3. 脱出する能力
   1. 出口(長さ12.5 cm、幅9 cm)のある円形の装置(直径0.5 m、高さ0.3 m)の真ん中にラットを置きます。
   2. ネズミが円から出るのにかかる時間を記録します。
      注意: ラットが180秒以内に円から出ない場合は、時間を180秒として記録します。
4. ビームバランス能力試験
   1. それに応じて、3 cm、2 cm、および1.5 cm幅のビームにラットを1分間置きます。
   2. ネズミがビーム上で安定した姿勢でバランスを保っている場合は、0としてスコアを付けます。
   3. ネズミがビームの側面をつかんだら、1のスコアを与えます。ネズミが梁を抱きしめ、片方の手足が梁から落ちた場合、2としてスコアを付けます。
   4. ネズミがビームを抱きしめ、2本の手足がビームから落ちるかスピンした場合(>60秒)、3とスコアを付けます。
   5. ネズミが梁の上でバランスをとろうとして落ちた場合(40秒>)、4と評価します。
   6. ネズミがビームの上でバランスをとろうとして落ちた場合(>20秒)、5とスコアを付けます。
   7. ネズミがバランスをとろうとしたり、梁にぶら下がったりせず、20秒以内に落ちた場合は、6とスコアを付けます。
      注:ビームバランステストは、事前試験を必要としません。

6.検証手順:神経行動評価

注:行動実験の前に、ラットはストレスと新規性の混乱を最小限に抑えるために、3日間連続して毎日2分間処理されました。すべての行動実験は、実験開始前に動物を試験環境に60分間置いて行った。

1. 運動協調能力(ビーム課題)
   1. 実験装置
      1. ネズミを平均台の一端(長さ1.5 m、床から75 cm)に置きます。もう一方の端にエスケープボックス(斜めの寝具ホームケージ)を置きます。
      2. 試験中に転倒した場合のネズミの怪我の潜在的なリスクを軽減するために、ビームの下にフォームパッドを配置します。
      3. ビデオカメラの電源を入れます。
      4. 受傷後または偽治療後の特定の時点(例:1日目、3日目、7日目)に検査日をスケジュールします。
   2. 研修期間(2日間)
      1. 4cm幅の梁を3回連続して横切るようにラットを訓練し、続いて2cm幅の梁を2回試します。
      2. トレーニング中は、ネズミが干渉することなく簡単に横切れるようになるまで、梁を横切ってネズミを優しく誘導します。
   3. 平均台の実験
      1. 幅2cmのビームにラットを置き、5回連続で試行します。
      2. ラットの鼻がスタートラインとフィニッシュラインを横切ったときの各試行の開始と終了をそれぞれ記録します。
      3. 実験終了時にラットをケージに戻します。
   4. ベースラインテスト
      1. 怪我や治療の前に平均台の実験を行ってください。
      2. これらの 5 回の連続した試行から平均値を計算して、各ラットのベースラインを確立します。
   5. データ解析
      1. ビームを横切る時間と後足のスリップの総数を、実験条件を知らされていない研究者によるビデオ分析を使用して分析します。
2. 不安(オープンフィールドテスト)
   1. 実験装置
      1. オープンフィールドアリーナを準備し、清潔で以前の臭いの手がかりがないことを確認します。アリーナを中央の内側ゾーン(33 cm x 33 cm)、中央ゾーン(66 cm x 66 cm)、外側ゾーンの3つのゾーンに分割します。
   2. テストフェーズ
      1. オープンフィールドアリーナの中央にネズミを配置し、タイマーを開始します。ネズミがアリーナを5分間自由に探索できるようにします。5分後、ラットを慎重に静かにホームケージに戻します。
   3. データ収集
      1. 5分間の探索期間中にネズミが移動した合計距離を測定します。ラットが中央の内側、中央、外側のゾーンで過ごす時間を決定します。
   4. データ解析
      1. 総移動距離を、全体的な探索行動と自発運動能力の尺度として使用します。不安様反応の指標として、中央の内側ゾーンで費やされた時間を計算します。
3. 学習能力と記憶能力(モリス水迷路テスト)
   1. 水迷路装置が適切な状態にあることを確認してください。水を黒く染め、4つの基本方向にキューを配置します。プラットフォームを水面から2.5cm下に配置します。
   2. ネズミの行動を記録・観察するモニタリングシステムを設置する。
   3. トレイルの日
      1. ネズミを水の迷路にすばやく入れます。ネズミが2分以内にプラットフォームにたどり着けない場合は、木の棒を使ってそっと誘導します。
      2. ネズミがプラットフォームに20秒間立っている間、迷路の環境に慣れさせてから、ネズミを取り除きます。ネズミがプラットフォームに着いたら、20秒間そのままにしてから、ネズミを取り除きます。
   4. 毎日の繰り返し
      1. トレーニング日の手順を繰り返し、ラットをさまざまな象限から水中に入れます。手順6.3.3を繰り返します。トレーニングを5日間連続で継続します。
   5. プローブテスト日:6^日目 に、プラットフォームを取り外し、ラットを同じ象限に2分間置きます。
   6. 観察と記録:モニタリングシステムを利用して、試験日やプローブ試験日のラットの行動を監視します。
   7. 掃除:水迷路からネズミを取り除いた後、タオルを使って完全に乾かします。

結果

この研究で使用された装置は、KaneモデルとRichelle Mychasiukの小児モデル^11,12の修正版でした。この研究では、SDラットを偽群とmTBI群に割り当てました。このモデルの再現性を実証するために、このモデルの3つの独立した複製と急性神経行動学的評価を行い、各実験には8〜12匹のラットが参加しました。本研究では、30匹以上のmTBIラットを使用し、そのうち2匹が麻酔による死亡を経験しました。しかし、実験中に脳損傷で死亡したラットはいませんでした。これらの実験の結果を図2に示します。さらに、急性期および亜急性期に神経行動学的評価を実施しました(図3、図4、および図5)。

ディスカッション

このモデルは、頭皮の切開や頭蓋骨の開口部を必要とせずに閉じた頭部のmTBIをうまくシミュレートし、人間の症例で観察された衝撃シナリオをより正確に表現します。頭皮の切開を避けることで、実際の状況に合わない可能性のある炎症反応を防ぐことができます。Richelle Mychasiukの小児モデル¹²と比較して、この研究で使用されたモデルは、体重が280〜320gの成体ラット用に特別に調整されており、成人に対するmTBIの影響に関する貴重な洞察を得ることができます。さらに、枕やヘルメットなどの主要部品を組み込むことで、より均一な衝撃力の伝達が容易になり、オペレーターが衝撃のターゲット領域を正確に特定するのに役立ちます。

ここで強調しておきたいのは、ラットの衝撃手技は麻酔維持なしで行われたため、衝撃開始前に麻酔の深さを確認したことです。麻酔導入ボックスを軽く振って麻酔時間を30秒延長し、適切な麻酔レベルを確保することで、ラットが反応しないことを確認しました。衝撃プロセス全体を1分以内に完了することをお勧めします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクリルボックス	社内	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
麻酔器	RWD Life Science Co.	R540マウス&ラット動物麻酔器
ヘルメット	社内	N/A	直径10mm、厚さ3mmのステンレス製ディスク
モリス水迷路	RWD Life Science Co.		直径150cm、高さ50cm、プラットフォーム直径35cm
フィールド	RWDライフサイエンス株式会社	63007	幅100 cm、高さ40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
穴あきウェイト	社内	N/A	重量550g、直径18mm
枕	社内	N/A	ネズミの頭の下に置くくさび形スポンジ

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