閉鎖性軽度外傷のラットモデルとその検証

軽度外傷性脳損傷(mTBI)、または脳震盪は、最も一般的なタイプの損傷であり、さまざまな短期的および^{慢性的な症状}を引き起こす可能性があります1。これらの症状には、めまい、頭痛、うつ病、無快感症などがあり、mTBI²の影響を受けた個人に重大な苦痛をもたらします。ほとんどのmTBIは鈍器による外傷によって引き起こされるため³、そのような損傷を正確に模倣する動物モデルの開発が不可欠になります。これらのモデルは、損傷とその根底にあるメカニズムをよりよく理解するために不可欠であり、人間の研究と比較して変動性と異質性が低減された制御された環境を提供します。

外傷性脳損傷(TBI)については、流体衝撃損傷(FPI)⁴、制御皮質衝撃(CCI)⁵、重量低下損傷⁶、爆風外傷性脳損傷⁷など、数多くの確立されたげっ歯類モデルが開発されています。ただし、これらのモデルは、主に中等度から重度の TBI シナリオの再現に重点を置いています。対照的に、mTBIをシミュレートするために特別に設計された実験モデルは、比較的注目されておらず、未調査のままです⁸。したがって、mTBIを正確に表す安定した再現性のある動物モデルを確立することが非常に重要です。このようなモデルは、mTBIに関連する神経生物学的および行動的影響の理解を大幅に強化します。

mTBIラットの機能的欠損は、麻酔効果が切れた後のカジュアルな観察では、正常ラットと比較することはできません。したがって、特定のテストを実施する必要があります。ヒトでは、患者を評価するために幅広い臨床評価が用いられている^9,10,11。同様に、ラットモデルで成功するモデルを確立するには、迅速な評価ツールを使用してその妥当性を判断する必要があります。

本研究では、ヒトの状態に近似したmTBIの解析を可能にする閉鎖頭型mTBIラットモデルを提示します。モデルとその検証手順の詳細な説明により、mTBIの研究に利用される実験的アプローチを包括的に理解できます。

動物実験は、中南大学動物管理委員会によって承認されました。すべての研究は、実験動物の福祉と倫理の原則に沿って実施されました。

1.動物の給餌と麻酔の手順

1. 280〜320 gのSprague-Dawleyオスラットをグループ化し、12時間/ 12時間の明暗サイクルで維持し、自由に餌 と水にアクセスできます。ラットが6日間順応した後、研究を実施します。
2. ラットが足または尾のつまみに反応しなくなるまで、誘導ボックス内の0.6 L / minの気流で3%イソフルランでラットを麻酔します。.流量を30秒間維持します。
   注:鎮痛剤は、神経行動学的評価におけるラットの反応を妨げるため、使用されませんでした。

2. 術前設定

1. 硬度35D(スポンジの重量35kg/m3)で、長さと幅は同じで厚さは12cmのスポンジを、トップカバーのないアクリルボックス(15 cm x 22 cm x 43 cm)に入れます。
2. 錫箔(厚さ20μm)を切り取り、粘着テープでアクリル箱に貼り付けると、ネズミの体重を支えることができる破壊可能な表面を形成します。さらに、ラットの頭を配置するための指定された場所となる約10cmのカットラインをマークします。
3. アイロンスタンドを使用して、PVCチューブを所定の位置にしっかりと固定します。直径18ミリメートルで重さ550グラムの穴あき重りを準備します。ポリ塩化ビニルまたはPVCチューブ内の1メートルの高さで釣り糸に重りを取り付けます。そして、スズ箔の3センチ上のガイドチューブの位置を調整します。
4. ヘルメットと枕を用意します。直径10mm、厚さ3mmのステンレス製の円盤を使ってヘルメットを作ります。くさび形のスポンジ枕を用意して、ネズミの頭の下に置き、重力方向に対して垂直になるようにします。
   注:衝撃装置の概略図を 図1に示します。ヘルメットは、衝撃の場所を特定し、外力の分散を強化する目的を果たします。枕は、均一で安定した損傷を保証するために利用されています。

3. mTBI誘導

1. 麻酔をかけたラットを胸の錫箔の上にすばやく置きます。
   注:mTBI誘導には2人のオペレーターが必要であり、1人は準備用、もう1人は検証用です。
2. 準備:枕をネズミの下に置き、ネズミの頭がホイル紙と平行になるようにします。ヘルメットをネズミの耳に合わせ、所定の位置に固定します。
3. 確認:塩ビパイプがヘルメットの真上に配置されていることを確認します。両方のオペレーターが正しい設定を確認したら、次の手順に進みます。
4. 頭の回転の誘導:重りを解放し、落下させてラットの頭にぶつからせ、スポンジへの落下と180°の回転を誘発します。
5. ネズミを清潔なケージに仰向けに置きます。

4.偽の誘導

1. ラットは、以前のmTBI誘導の説明と同じ方法で扱いますが、頭部に衝撃を与えないでください。

5.検証手順:急性神経行動学的評価

注: 以下の評価は、神経学的重症度スコア⁹ と Flierl et ^al.10 によるプロトコルに基づいて修正されました。これらの評価はすべて、ラットが正立反射を回復してから10分後に実施されました。

1. 意識喪失時間:ラットが麻酔されてから正動反射が回復するまでの時間を記録します。
   注:直立反射は、ネズミを仰向けにしたときにひっくり返るプロセスです。矯正反射の喪失は人道的なエンドポイントと見なされるべきであり、動物は施設のガイドラインに従って安楽死させる必要があります。
2. 最初のシーク行動時間:ラットが麻酔されてから、初めてシーク行動を示すまでの時間を記録します。
   注:行動を求めることは、環境への関心の表れであり、生理学的反応です。
3. 脱出する能力
   1. 出口(長さ12.5 cm、幅9 cm)のある円形の装置(直径0.5 m、高さ0.3 m)の真ん中にラットを置きます。
   2. ネズミが円から出るのにかかる時間を記録します。
      注意: ラットが180秒以内に円から出ない場合は、時間を180秒として記録します。
4. ビームバランス能力試験
   1. それに応じて、3 cm、2 cm、および1.5 cm幅のビームにラットを1分間置きます。
   2. ネズミがビーム上で安定した姿勢でバランスを保っている場合は、0としてスコアを付けます。
   3. ネズミがビームの側面をつかんだら、1のスコアを与えます。ネズミが梁を抱きしめ、片方の手足が梁から落ちた場合、2としてスコアを付けます。
   4. ネズミがビームを抱きしめ、2本の手足がビームから落ちるかスピンした場合(>60秒)、3とスコアを付けます。
   5. ネズミが梁の上でバランスをとろうとして落ちた場合(40秒>)、4と評価します。
   6. ネズミがビームの上でバランスをとろうとして落ちた場合(>20秒)、5とスコアを付けます。
   7. ネズミがバランスをとろうとしたり、梁にぶら下がったりせず、20秒以内に落ちた場合は、6とスコアを付けます。
      注:ビームバランステストは、事前試験を必要としません。

6.検証手順:神経行動評価

注:行動実験の前に、ラットはストレスと新規性の混乱を最小限に抑えるために、3日間連続して毎日2分間処理されました。すべての行動実験は、実験開始前に動物を試験環境に60分間置いて行った。

1. 運動協調能力(ビーム課題)
   1. 実験装置
      1. ネズミを平均台の一端(長さ1.5 m、床から75 cm)に置きます。もう一方の端にエスケープボックス(斜めの寝具ホームケージ)を置きます。
      2. 試験中に転倒した場合のネズミの怪我の潜在的なリスクを軽減するために、ビームの下にフォームパッドを配置します。
      3. ビデオカメラの電源を入れます。
      4. 受傷後または偽治療後の特定の時点(例:1日目、3日目、7日目)に検査日をスケジュールします。
   2. 研修期間(2日間)
      1. 4cm幅の梁を3回連続して横切るようにラットを訓練し、続いて2cm幅の梁を2回試します。
      2. トレーニング中は、ネズミが干渉することなく簡単に横切れるようになるまで、梁を横切ってネズミを優しく誘導します。
   3. 平均台の実験
      1. 幅2cmのビームにラットを置き、5回連続で試行します。
      2. ラットの鼻がスタートラインとフィニッシュラインを横切ったときの各試行の開始と終了をそれぞれ記録します。
      3. 実験終了時にラットをケージに戻します。
   4. ベースラインテスト
      1. 怪我や治療の前に平均台の実験を行ってください。
      2. これらの 5 回の連続した試行から平均値を計算して、各ラットのベースラインを確立します。
   5. データ解析
      1. ビームを横切る時間と後足のスリップの総数を、実験条件を知らされていない研究者によるビデオ分析を使用して分析します。
2. 不安(オープンフィールドテスト)
   1. 実験装置
      1. オープンフィールドアリーナを準備し、清潔で以前の臭いの手がかりがないことを確認します。アリーナを中央の内側ゾーン(33 cm x 33 cm)、中央ゾーン(66 cm x 66 cm)、外側ゾーンの3つのゾーンに分割します。
   2. テストフェーズ
      1. オープンフィールドアリーナの中央にネズミを配置し、タイマーを開始します。ネズミがアリーナを5分間自由に探索できるようにします。5分後、ラットを慎重に静かにホームケージに戻します。
   3. データ収集
      1. 5分間の探索期間中にネズミが移動した合計距離を測定します。ラットが中央の内側、中央、外側のゾーンで過ごす時間を決定します。
   4. データ解析
      1. 総移動距離を、全体的な探索行動と自発運動能力の尺度として使用します。不安様反応の指標として、中央の内側ゾーンで費やされた時間を計算します。
3. 学習能力と記憶能力(モリス水迷路テスト)
   1. 水迷路装置が適切な状態にあることを確認してください。水を黒く染め、4つの基本方向にキューを配置します。プラットフォームを水面から2.5cm下に配置します。
   2. ネズミの行動を記録・観察するモニタリングシステムを設置する。
   3. トレイルの日
      1. ネズミを水の迷路にすばやく入れます。ネズミが2分以内にプラットフォームにたどり着けない場合は、木の棒を使ってそっと誘導します。
      2. ネズミがプラットフォームに20秒間立っている間、迷路の環境に慣れさせてから、ネズミを取り除きます。ネズミがプラットフォームに着いたら、20秒間そのままにしてから、ネズミを取り除きます。
   4. 毎日の繰り返し
      1. トレーニング日の手順を繰り返し、ラットをさまざまな象限から水中に入れます。手順6.3.3を繰り返します。トレーニングを5日間連続で継続します。
   5. プローブテスト日:6^日目 に、プラットフォームを取り外し、ラットを同じ象限に2分間置きます。
   6. 観察と記録:モニタリングシステムを利用して、試験日やプローブ試験日のラットの行動を監視します。
   7. 掃除:水迷路からネズミを取り除いた後、タオルを使って完全に乾かします。

この研究で使用された装置は、KaneモデルとRichelle Mychasiukの小児モデル11,12の修正版でした。この研究では、SDラットを偽群とmTBI群に割り当てました。このモデルの再現性を実証するために、このモデルの3つの独立した複製と急性神経行動学的評価を行い、各実験には8〜12匹のラットが参加しました。本研究では、30匹以上のmTBIラットを使用し、そのうち2匹が麻酔による死亡を経験しました。しかし、実験中に脳損傷で死亡したラットはいませんでした。これらの実験の結果を図2に示します。さらに、急性期および亜急性期に神経行動学的評価を実施しました(図3、図4、および図5)。

急性神経行動学的評価結果

これらの評価はすべて、麻酔/衝撃後、それぞれ 0 分 (意識喪失の時間と最初のシーク行動時間) または 10 分 (円の出口とビームのバランス) の後に行われました。

図2Aに示すように、mTBIラットは意識不明からの回復に有意に多くの時間を費やし、これは以前の研究で得られた結果と一致しています12,13。正常な生理学的活動と見なされたラットの探索行動は、mTBI群内で回復期間において統計的に有意な増加を示しました(図2B)。この知見は、mTBIラットが歩行能力、嗅覚能力、触覚プローブ能力、および環境スキャン能力を取り戻すのに、より長い期間を必要としたことを示唆している。

サークルの既存のテストは、以前は配置テストや固有受容感覚テストなどの審査官の主観的な観察に依存していた神経学的重症度スコアの元の感覚テストに取って代わりました。mTBIラットは、偽ラットと比較して、円から出るのに有意に長い時間を費やしました(図2C)。円の出口時間について二元配置分散分析を用いた統計解析では、傷害の有意な主効果(F [1, 36] = 21.29, p < 0.0001)が示され、mTBI群と偽群の差が示された。しかし、異なる試験では有意な効果は認められなかった(F [2, 36] = 0.1396, p = 0.87)。

ビームバランス検定の結果は、二元配置分散分析を使用して分析され、続いてグループ平均間の差についてボンフェローニの多重比較が行われました(図2D)。すべてのワイドビーム課題において、傷害の全体的な影響が有意であり(3 cm: F = 13.89, p < 0.001; 2 cm: F = 42.7, p < 0.001; 1.5 cm: F = 27.25, p < 0.001)、衝突後10分後にmTBIラットは偽ラットと比較して平衡障害を示した。3つの独立した反復実験によると、幅2cmと1.5cmの平均台は、幅3cmの平均台よりも偽物群とmTBI群の識別が良好でした。

神経行動評価結果

運動協調能力は、麻酔前/損傷の1日後と麻酔/損傷の1日後、3日後、7日後にビームタスクを使用して評価されました(図3)。後肢のスリップの総数(図3A)は、反復測定された双方向分散分析によって分析され、Bonferroniの多重比較により、mTBIラットは偽ラットと比較して、損傷後1日目に後肢のスリップが有意に多いことがわかりました(図3A;p < 0.01)。しかし、2日間の回復後、後部ミスに変化は見られず、7日後にはスリップの総数が偽のレベルに戻りました。注目すべきは、6匹のmTBIラットすべてで、衝撃後の後肢のスリップがベースラインパフォーマンスよりも多かったことです。偽ラットの後肢の滑りがわずかに増加したのは、平均台の練習不足と関連している可能性がある。受傷後1日目と3日目に、mTBIラットは150cmビームを横断する時間が長くなった(39.8秒±3.79秒対28.68秒±0.82秒、37.06秒±4.06秒対29.28秒±3.42秒)が、mTBIラットと偽ラットの間には、すべての時点でビームを横断するのに要する時間に差はなかった(図3B)。

偽群とmTBI群の間で移動距離に有意差は認められなかった(図4A)。不安様行動は、オープンフィールドテスト中にセンターゾーンで費やされた時間を測定することによって評価されました。受傷後3日および7日後の両方で、mTBIラットは偽ラットと比較してセンターゾーンで過ごす時間の有意な減少を示しました。この発見は、mTBIラットが衝撃後7日以内により高いレベルの不安様行動を示したことを示しています(図4B、C)。

モリス水迷路学習日の結果、mTBIラットは偽ラットよりも隠れたプラットフォームを見つけるのにより多くの時間を要することが明らかになり、mTBIグループの空間学習と記憶が損なわれていることが明らかになりました(図5)。その後、プローブ試験中、mTBIラットは、除去されたプラットフォームの検索に費やす時間が短くなることで証明されるように、空間記憶の保持に欠損を示しました。特に、偽群とmTBI群の間で遊泳速度に有意差は観察されず、オープンフィールドテストで実施された移動距離分析で観察された一貫した結果を支持しています。これらの結果は、その影響が自発的な自発運動機能に認識可能な影響を及ぼさなかったことを示唆している。

図1:ラットにおけるmTBIの衝撃装置。 (A)ラットの頭部の相対位置における枕とヘルメットの上面図と側面図。赤い点線はヘルメットの位置を示しています。(b)ラットステージの上方に配置され、スポンジを回収する落下錘用の垂直ガイドチューブを示すアセンブリ全体の画像。(C)頭部衝突後のラットの180°回転とその後の加速・回転を撮影した衝撃映像の静止画。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:偽mTBIラットを3回独立して繰り返した後の急性神経行動学的評価結果。 (A)mTBIを受けたラットの麻酔中止後の意識喪失の時間は、偽ラットと比較して有意に増加しました。有意なグループ効果(P < 0.0001、二元配置分散分析)はあったが、有意な時間効果(P = 0.6226)またはグループx時間(P = 0.5803)の交互作用はなかった。(B)mTBIラットは麻酔後最初の探索行動を示した。(C)偽ラットは、60cmの円から逃げるのに費やす時間が短かった(*p < 0.01、**p < 0.001、対応のないt検定)。(D)幅3cm、2cm、1.5cm幅のビームバランススコアでの性能。各グループに対するボンフェローニの多重比較の結果を図に示します。平均±平均の標準誤差として表されるデータ。N = 8〜12匹のラットを実験ごとに使用しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:1日目、3日目、7日目の衝突前と衝突後のビームタスクのパフォーマンス。 (A)mTBIラットは、損傷後1日目に後肢の滑りが多かった(*p < 0.001、反復測定された2因子ANOVA)。(B)偽ラットの平均トラバース時間はmTBIラットよりも短い。平均±平均の標準誤差(N = 6/グループ)として表されるデータ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:受傷前1日目と受傷後1日目、3日目、7日目、14日目のオープンフィールドテストの成績。 (A)偽ラットとmTBIラットの移動距離に差はなかった。(B)mTBIラットは、3日目と7日目に偽ラットよりもセンターで過ごした時間が短く(*p < 0.01、**p < 0.001、反復測定された2元配置分散分析)、受傷前1日目と受傷後1日目および14日目に明らかな差はありませんでした。(C)mTBI後の1日目、3日目、7日目、および14日目のmTBIラットのトラックマップ。平均±平均の標準誤差として表されるデータ(N = 6-10 /グループ)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:モリス水迷路での性能。 (A)偽ラットとmTBIラットの遊泳能力試験では速度に差はなかった。(B) 試用日における参照メモリタスクの隠れたプラットフォームへのレイテンシ。(C)ラットは、5日間の試行後の2分間のプローブテスト試行で、より多くプラットフォームを通過しました。偽(5.14 ± 0.65)対mTBI(3.56 ± 0.6)、(*p < 0.01、対応のないt検定)。平均±平均の標準誤差(N = 9/グループ)として表されるデータ。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者は、開示すべき金銭的利害関係を有していません。