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Summary

この実験プロトコルは、主にシングルチャネル抗体のインキュベーション条件を最適化し、抗体とチャネルの設定を調整して、臨床起源の肺癌組織における自家蛍光およびチャネルクロストークの問題を解決することにより、マルチプレックス免疫組織化学(IHC)染色法を説明および最適化します。

Abstract

肺がんは、世界中の悪性腫瘍関連の罹患率と死亡率の主な原因であり、複雑な腫瘍微小環境は肺がん患者の主要な死因と見なされてきました。腫瘍微小環境の複雑さには、腫瘍組織における細胞間関係を理解するための効果的な方法が必要です。マルチプレックス免疫組織化学(mIHC)技術は、腫瘍組織におけるシグナル伝達経路の上流および下流におけるタンパク質の発現の関係を推測し、臨床診断および治療計画を策定するための重要なツールとなっています。mIHCは、チラミンシグナル増幅(TSA)技術に基づく多盲検免疫蛍光染色法であり、同じ組織切片サンプル上の複数の標的分子を同時に検出して、異なるタンパク質共発現および共局在分析を実現できます。この実験プロトコルでは、臨床起源の肺扁平上皮癌のパラフィン包埋組織切片をマルチプレックス免疫組織化学的染色に供した。実験プロトコルを最適化することにより、標識された標的細胞およびタンパク質のマルチプレックス免疫組織化学的染色が達成され、肺組織における自家蛍光およびチャネルクロストークの問題を解決しました。さらに、マルチプレックス免疫組織化学的染色は、シングルセルシーケンシング、プロテオミクス、組織空間シーケンシングなど、腫瘍関連のハイスループットシーケンシングの実験的バリデーションに広く使用されており、直感的で視覚的な病理学バリデーション結果を提供します。

Introduction

20年以上の歴史を持つチラミンシグナル増幅(TSA)は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を使用して標的抗原を高密度in situ標識するアッセイ技術の一種であり、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、in situハイブリダイゼーション(ISH)、免疫組織化学(IHC)、およびその他の生物学的抗原検出技術に広く適用されています。 検出信号¹の感度を大幅に向上させる。TSA技術に基づくオパール多色染色は最近開発され、いくつかの研究で広く使用されています^2,3,4,5。従来の免疫蛍光染色(IF)は、さまざまなモデル生物の細胞や組織におけるタンパク質の分布を検出および比較するための簡単なツールを研究者に提供します。これは、抗体/抗原特異的結合に基づいており、直接的および間接^{的なアプローチが含まれます}6。直接免疫染色では、目的の抗原に対する蛍光色素標識一次抗体を使用し、蛍光顕微鏡を使用した直接蛍光検出を可能にします。間接免疫染色法では、非標識一次抗体に対して蛍光色素標識二次抗体を添加します^6,7。

従来の単一標識免疫蛍光染色法では、組織中の抗原を1つ、2つ、場合によっては3つしか染色できないため、組織切片に含まれる豊富な情報をマイニングする上で大きな制限がありました。定量結果の解釈は、多くの場合、目視観察とImageJなどのイメージングソフトウェアによる正確な定量に依存します。抗体種の制限、弱い蛍光標識シグナル、蛍光色素の色の重複などの技術的な制限があります(表1)。オパールマルチプレックスIHC(mIHC)技術はTSA誘導に基づいており、一次抗体の起源に制限なく、同じ組織切片上の7〜9個以上の抗原のマルチプレックス染色および差次的標識が可能ですが、抗原に対する対応する抗体の高い特異性が必要です。染色手順は通常の免疫蛍光染色と似ていますが、2つの違いがあります:各ラウンドの染色では、1つの抗体のみを使用し、抗体溶出ステップが追加されます。非共有結合によって抗原に結合した抗体は、マイクロ波溶出によって除去することができるが、共有結合によって抗原の表面に結合したTSA蛍光シグナルは保持される。

色素で標識された活性化チラミン(T)分子は、標的抗原で高濃度であるため、蛍光シグナルを効率的に増幅できます。これにより、抗体の干渉なしに抗原を直接標識することができ、複数回の染色サイクル後に多色標識を達成することができます^8,9,10(図1)。この技術は、疾患の研究に信頼性が高く正確な画像を生成しますが、有用なマルチプレックス蛍光免疫組織化学(mfIHC)染色戦略の作成は、広範な最適化と設計が必要なため、時間と厳密さを伴う可能性があります。したがって、このマルチプレックスパネルプロトコルは、手動プロトコルよりも短い染色時間で自動化されたIHC染色装置で最適化されています。このアプローチは、ヒトホルマリン固定およびパラフィン包埋(FFPE)組織サンプルの免疫腫瘍学研究に、あらゆる研究者が直接適用し、適応させることができます¹¹。さらに、スライド調製、抗体最適化、およびマルチプレックス設計の方法は、in situでの正確な細胞間相互作用を表す堅牢な画像を取得し、手動解析の最適化期間を短縮するのに役立ちます¹²。

mfIHCには、主に画像取得とデータ解析が含まれます。画像取得に関しては、マルチカラー標識された複雑な染色サンプルを専門のスペクトルイメージング装置で検出して、さまざまな混合カラーシグナルを識別し、組織の自家蛍光による干渉なしに高いS/N比画像を取得する必要があります。現在の分光イメージング装置には、主に分光共焦点顕微鏡とマルチスペクトル組織イメージングシステムが含まれます。マルチスペクトル組織イメージングシステムは、組織切片の定量分析のために設計されたプロフェッショナルイメージングシステムであり、その最も重要な特徴は、生体組織サンプルの形態学的構造と光学マッピング情報の両方を提供する画像スペクトル情報の取得です^13,14。スペクトル画像内の任意のピクセルには完全なスペクトル曲線が含まれており、各色素(自家蛍光を含む)には対応する特性スペクトルがあるため、混合および重複するマルチラベルシグナルの完全な記録と正確な識別が可能になります。

データ解析の面では、多色標識試料は、組織試料の形態学的構造と構成細胞のために非常に複雑です。通常のソフトウェアでは、異なる組織タイプを自動的に識別することはできません。したがって、インテリジェントな定量的組織分析ソフトウェアは、特定の領域における抗原発現の定量分析に使用されます^{15、16、17、18}。

とりわけ、マルチスペクトルイメージングおよび定量的病理解析技術と融合した多盲検免疫蛍光染色は、多数の検出ターゲット、効果的な染色、および正確な分析という利点があるため、組織形態学的解析の精度を大幅に向上させ、細胞レベルの分解能でタンパク質間の空間的関係を明らかにし、組織切片サンプルからより豊富で信頼性の高い情報をマイニングするのに役立ちます¹⁹ (表1)。

Protocol

このプロトコルは、中国四川大学華西病院の倫理委員会のガイドラインによって承認されています。肺がん組織サンプルは、中国西部病院の肺がんセンターでの手術中に採取され、各患者からインフォームドコンセントが得られました。

1. 組織切片の準備

1. FFPE調製
   1. 臨床組織を中性ホルマリン溶液に72時間以上浸します。
   2. キシレンと段階的なアルコール溶液を使用して組織を脱水するプロセスを完了します²⁰。
   3. 手動パラフィン包埋と組織切片作成を切片の厚さ4 μmで行います。癒着顕微鏡のスライドを使用して、組織スライスが脱落しないようにします。
   4. スライドを65°Cのオーブンで2時間焼き、ティッシュとスライドが乾いていることを確認します。スライドボックスに常温で保管してください。
2. 組織切開前処理
   1. 組織スライドを65°Cのオーブンで5分間前処理し、次にキシレン溶液に2 x 15分間、無水エタノール溶液に2 x 15分間、90%エタノール溶液に10分間、85%エタノール溶液に10分間、80%エタノール溶液に10分間、および75%エタノール溶液に10分間、順次浸します。 続いて、スライドを滅菌水で3 x 1分間洗浄します。
      注:この実験手法は、複数の高温抗原修復プロセスにより組織がスライドから脱落するため、FFPE組織にのみ使用でき、凍結組織や新鮮組織には使用できません。

2. 一次抗体の最適化

注:従来のIHC実験は、主に抗体濃度や抗原修復条件など、個々の抗体のインキュベーション条件を決定するために使用されていました。抗体取扱説明書の条件をご参照ください。

1. 推奨濃度範囲および中間値よりわずかに高い抗体濃度を使用してください。
2. 抗原賦活化バッファールーチンPH6およびPH9を、タンパク質発現位置に応じて最適化します。核で発現するタンパク質にはPH9を使用し、その他のタンパク質にはルーチン(PH6またはPH9)を使用します。

3. mIHC染色法

注:オパールのmIHC染色は、利用可能なmIHC法の1つです。この実験的な5色プロトコルでは、各組織サンプルを4つの抗体で染色する必要があるため、4つの一次抗体インキュベーション、2次抗体インキュベーション、およびTSAシグナル増幅発色インキュベーション、および5つの抗原修復が必要です。最後に、4’6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色および抗蛍光破裂剤の封止を行います。

1. 主な試薬調製
   注:組織スライドのサイズに応じて、添加する試薬の量を決定します。組織切片を完全に覆うのに十分な容量を使用します(通常、スライドあたり50〜150μL)。実験に必要な作業溶液は、次のように準備されます。
   1. 洗浄バッファー作動溶液:20倍の洗浄バッファーを2回蒸留水で1:20に希釈し、室温で保存します。
   2. PH6 緩衝液使用溶液:100 x PH6 緩衝液を二重蒸留水で 1:100 に希釈します。使用前に準備し、室温で保存してください。
   3. PH9 緩衝液使用溶液:50 x PH9 緩衝液を二重蒸留水で 1:50 に希釈します。使用前に準備し、室温で保存してください。
   4. ポリマーHRP:このすぐに使用できる溶液は、ウサギ由来およびマウス由来の一次抗体専用に調製してください。
   5. 蛍光色素試作用溶液:各蛍光色素粉末(蛍光色素780を除く)を75 μLのDMSOで再溶解します。各手順の前に、蛍光色素を1倍増幅希釈液で1:100に希釈します。蛍光色素試料の未使用部分は廃棄してください。
   6. フルオロフォア780使用溶液:TSA-DIGを75 μLのDMSOで、フルオロフォア粉末780を300 μLの二重蒸留水で再溶解します。手順の前に、TSA-DIG を 1 倍増幅希釈液で 1:100 に希釈し、蛍光色素 780 を Ab 希釈液で 1:25 に希釈します。
   7. DAPIワーキング溶液:DAPI溶液を二重蒸留水またはPBSで1:50に希釈します。使用前に準備し、4°Cで48時間以内で保管してください。
      手記。このマルチラベル蛍光染色実験全体を通して、スライドは二重蒸留水と新たに調製した洗浄バッファーワーキング溶液のみで洗浄してください。組織切片は水道水と接触してはなりません。水道水中の汚染物質は組織切片に付着し、自家蛍光を引き起こす可能性があります。実験中はサンプルを光から遠ざけてください。
2. 抗原賦活化
   1. スライドを染色・修復ボックスに入れ、PH6またはPH9緩衝液で満たし、蓋をして、電子レンジで100%の電力で2 x 8分間加熱します。
      注意: スライスの乾燥の原因となる過度の蒸発を防ぐために、加熱プロセス中に修理ボックスに二重蒸留水を追加します。
   2. スライドを室温で冷ましてから、先に進みます(30〜60分)。
   3. スライドを2回蒸留水で3 x 2分間洗浄します。疎水性バリアペンを使用して、スライド上の組織切片を囲みます。
3. ブロッキング
   1. 組織切片を洗浄バッファーに浸し、ブロッキング溶液で覆い、加湿チャンバー内で室温で10分間インキュベートします。
4. 一次抗体のインキュベーション
   1. スライドからブロッキング溶液を取り除き、一次抗体ワーキング溶液で組織切片を覆います。スライドを加湿チャンバー内でインキュベーター内で37°Cで1時間、または冷蔵庫で4°Cで一晩インキュベートします。
      注意: スライドを乾かさないでください。
5. ポリマーHRPのご紹介
   1. スライドを洗浄バッファー作業溶液で3 x 2分間洗浄し、ポリマーHRPを組織切片に直接滴下し、室温で15分間インキュベートします。
      注:冷蔵庫で保管したスライドは、室温で約30分間保管してから洗浄し、一次抗体を除去してください。
6. チラミン信号増幅(TSA)生成
   1. スライドを洗浄バッファー作業溶液で3 x 2分間洗浄し、蛍光色素処理溶液を組織切片に直接滴下し、室温で10分間インキュベートします。スライドを洗浄バッファー作動液で3 x 2分間洗浄します。
7. 蛍光色素780の特別な手順
   注:蛍光色素 780 は弱く、実験全体のカラーマッチングスキームの最後に配置されるのが一般的です。Fluorophore 780 は通常、この実験プロトコルでは使用されませんが、その特異性から、その実験ステップがリストされています。
   1. TSA-DIGの紹介
      1. スライドを洗浄バッファー作業溶液で3 x 2分間洗浄し、TSA-Drg作業溶液を組織切片に滴下し、室温で10分間インキュベートします。
   2. マイクロ波処理
      1. スライドを洗浄バッファー作業溶液で3 x 2分間洗浄します。
      2. スライドを染色・補修ボックスに入れ、補修液を入れ、蓋をして、電子レンジで100%の電力で2×8分間加熱します。スライドを室温で冷ましてから、先に進みます(30〜60分)。
      3. スライドを2回蒸留水で3 x 2分間洗浄します。
   3. Fluorophore 780 シグナル生成
      1. 切片を洗浄バッファーに浸し、フルオロフォア780ワーキング溶液で覆い、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。
      2. スライドを洗浄バッファー作業溶液で3 x 2分間洗浄します。
         注意: このステップの後、マイクロ波処理を行わないでください。
   4. フルオロフォア780をワークフロー全体の最後のステップとして使用し、DAPIワーキングソリューションで核を直接染色します。
      注:蛍光色素 780 を使用しない場合は、手順 3.7 をスキップしてください。
8. マイクロ波処理
   注:このマイクロ波ステップでは、一次-二次HRP複合体を剥離し、抗原を再曝露して、次の一次抗体の導入を可能にします。
   1. スライドを染色・修復ボックスに入れ、PH6またはPH9緩衝液で満たし、蓋をして、電子レンジで100%の電力で2 x 8分間加熱します。
   2. スライドを室温で冷ましてから、先に進みます(30〜60分)。スライドを2回蒸留水で3 x 1分間洗浄します。
   3. スライドを洗浄バッファー作業溶液に2分間浸します。次の抗体インキュベーションを行います。
9. 次の抗体インキュベーション
   1. 手順3.2〜3.8を繰り返します(手順3.7を除く)。
10. 細胞核染色と組織シーリング
    1. 組織切片をDAPIワーキング溶液で覆い、加湿チャンバー内で室温で5分間スライドをインキュベートします。スライドを2回蒸留水で3 x 2分間洗浄します。
    2. スライドから水滴を取り除き、各スライドに10〜20μLの蛍光止め剤を加え、顕微鏡カバーガラスでスライドを密封します。
    3. 完成したスライドは、光から保護された4°Cで1か月以上保管してください。
       注意: 気泡にならないように注意してください。

4. ネガティブコントロールを設定する

1. ネガティブコントロールスライドは、一次抗体、二次抗体、TSA試薬、DAPIなどの試薬を添加せずに、組織含有スライドと同様に処理します。

5.ティッシュスライドのフルオートスキャン

注:スペクトルイメージングに使用される機器は、全自動マルチスペクトル組織定量分析装置であり、参照システムを使用して5色スライドのイメージングと分析の視覚化を実行できます( 材料表を参照)。このシステムは、マルチスペクトルイメージングを使用して、複数の蛍光色素と組織の自家蛍光を定量的に混合解除します。

1. 各蛍光チャンネルの露光時間とスキャンプログラムを手動で設定し、装置が組織スライドの完全自動露光とスキャンを完了したことを確認します。
   注意: スライド面は清潔で、水膜がない必要があります。シーラーの量に注意してください:多すぎるとカバーガラスが滑り、機器がエラーを報告します。

6. 蛍光の分析

1. ソフトウェアをダブルクリックし( 材料表を参照)、元のスキャンで取得したマルチカラー蛍光画像ファイルをソフトウェアにドラッグし、画像タイプを蛍光に設定します。
2. [明るさとコントラスト] ボタンをクリックし、パネル上のチャンネルを確認します。チャンネルの外側をクリックしてからクリックし、目的の蛍光チャンネルを選択します。「最小表示」と「最大表示」をドラッグして、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。
3. 解析後、保存するビューを決定し、[ スライドの概要の表示 ] と [ カーソル位置の表示 ] をクリックしてこれら 2 つのコンテンツを削除し、縮尺記号を保持して [ファイル] |スナップショットのエクスポート |現在のビューアコンテンツ を使用して、png ファイルを書き出します。
   注:すべての蛍光チャンネルとマージされた図は、将来の分析のためにエクスポートする必要があります。
4. 標的細胞陽性率のさらなる分析のために、細胞同定およびセグメンテーションソフトウェア²¹ を使用する( 材料表を参照のこと)。

Representative Results

Discussion

mIHCは、複数のタンパク質マーカーを単一組織切片の単一細胞レベルで定量的および空間的に分析するための科学研究の分野で不可欠な実験技術であり、元の組織のコンテキストにおける詳細な組織構造と細胞相互作用に焦点を当てることにより、疾患病態の研究に直感的で正確なデータを提供します。mIHC技術の普及には、最適化された効果的な実験プロトコルが必要です。実験で発生する可能性のある問題に対処するために、次の考慮事項と解決策を提示します。

まず、マルチカラー実験で抗原とフルオレセイン標識抗体をマッチングさせる原理に従って、弱発現抗原は強フルオレセイン標識抗体とマッチングし、強発現抗原は弱フルオレセイン標識抗体とマッチングします。単一抗体標識抗原のIHC実験結果と組み合わせて、標的タンパク質の発現強度を決定し、抗体とフルオレセインのマッチングを調整し、最終的にマルチカラー標識実験に必要な抗体とフルオレセインのマッチングスキームを決定します。抗体のタンパク質発現レベルが異なる隣接蛍光チャネルは、隣接する蛍光チャネルストリングの色の問題を解決できます。第2に、染色スライドのイメージングにはアコヤバイオサイエンスのイメージングシステムを用いて蛍光シグナルを検出するためのソフトウェア設定を行い、蛍光シグナルバランスを確認できるマルチスペクトル走査ソフトウェアPhenochart 1.0を用いて蛍光取得パラメータを設定した²²。露光時間は、単一の蛍光チャンネルでは100 ms以内とし、複数の蛍光チャンネルではより均質で200 ms以下にすることが推奨されます。蛍光パラメータは、IHCに最適化された抗体のインキュベーション条件に基づいて調整されます。

第3に、自家蛍光の問題は、マルチスペクトルイメージングの特徴的なスペクトル検出と組み合わせて、ブランクコントロールを設定することで分析できます。これにより、混合色シグナルを同定することができ、ホルマリン固定パラフィン包埋試料については、組織自家蛍光を除去することにより、画像のS/N比を約一桁改善することができる²³。第4に、組織の非特異的発色性に対処するには、組織特異性の低い抗体を、通常は一次抗体の前に添加するブロッキング溶液として動物非免疫血清とともに使用する必要があります。選択された血清種は、一般に、非特異的発色原性を低減することができる二次抗体種の供給源と同じである。第五に、実験的品質管理としてネガティブコントロールとポジティブコントロールを設定することが推奨されます。ポジティブコントロールは試薬の品質をチェックする役割があり、ネガティブコントロールは実験手順の品質を検証し、スライドをスキャンするときに自家蛍光を除去するという2つの機能を持っています。この組み合わせは、各実験の精度を確保するために使用できます。第六に、スライド洗浄ステップは実験全体を通して非常に重要です。プロトコルで調製した試薬を使用し、洗浄時間を使用して各ステップで試薬をスライドから洗い流し、次のステップでの標識との干渉を防ぐ必要があります。

単一の蛍光チャンネルの特異性が低く、非特異的陽性および蛍光クロストークが生じる場合、ユーザーは適切な抗体のIHC結果を確認し、陽性結果を確認してから、関連する蛍光色素の変更を検討する必要があります。単一の肯定的な蛍光結果が弱すぎたり強すぎたりする場合は、フィルムスキャンパラメータを10〜150 msの推奨蛍光色素露光時間にリセットすることが重要です。

タンパク質の標識プロセスでは複数の抗原熱修復が必要であり、破損を防ぐために組織を固定する必要があるため、この多重標識法は現在、パラフィン包埋組織サンプルに限定されています。新鮮な組織の凍結切片は、熱修復によって引き起こされる損傷に耐えられず、大量の組織が失われます。

要約すると、この多重抗原 in situ 標識法は、単一の抗体標識プロセス時間が3時間未満で、より時間がかかりません。マルチスペクトルイメージングシステムと専門的な病理解析ソフトウェアの利点を組み合わせて、個々のタンパク質の標識条件、実験グループ、蛍光チャンネルの設定に関してmIHC実験プロトコルを最適化します。

Materials

<strong>Reagents</strong>
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
<strong>Software</strong>
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.