我々は、成体マウスの6つの筋肉から異なる長さとタイプの酵素的に解離した線維を得るためのプロトコルを記述する:そのうちの3つ(屈筋指筋ブレビス、長指伸筋、ヒラメ筋)と3つは初めて正常に解離した(長反母腓骨伸筋、長腓骨筋、指腓骨筋)。
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方法論記事
マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
マウスの筋肉を酵素解離させて得られた骨格筋線維は、生理学的実験に有用なモデルです。しかし、ほとんどの論文は指屈筋(FDB)の短線維を扱っており、線維の種類を扱う結果の範囲を制限し、利用可能な生物学的物質の量を制限し、細胞の生理学的現象と他の筋肉で得られた以前の生化学的および力学的知識との明確なつながりを妨げています。
この論文では、繊維の種類と長さの異なる6つの筋肉から無傷の繊維を得る方法について説明します。C57BL/6成体マウスを用いて、筋肉解剖と線維分離のプロトコルを示し、Ca2+ 一過性研究とその形態特性評価に対する線維の適合性を実証しました。筋肉の繊維タイプの組成も提示されます。解離すると、すべての筋肉は無傷になり、24時間以上活発に収縮する生きた線維が形成され、FDBは短(<1mm)、指腓骨筋(PDQA)および長腓骨筋(PL)は中間(1-3mm)を与え、長指伸筋(EDL)、長母趾伸筋(EHL)、およびヒラメ筋は長い(3-6mm)線維を放出した。
高速色素Mag-Fluo-4で記録したところ、PDQA、PL、およびEHLファイバーのCa2+ トランジェントは、IIX型およびIIB型ファイバーに対応することが知られている形態タイプII(MT-II)を連想させる高速で狭い速度論を示しました。これは、これらの筋肉がFDB(~80%)やヒラメ筋(~65%)と比較して、II型線維の90%以上を持っているという事実と一致しています。FDBを超えて、1〜6mmの長さの範囲にわたる繊維をレンダリングするいくつかの筋肉の解離を初めて実証しました。これらの線維は生存可能であり、高速のCa2+ トランジェントを与え、MT-IIが筋肉源に関係なくIIXおよびIIB高速線維に一般化できることを示しています。これらの結果により、成熟した骨格筋研究のためのモデルの利用可能性が高まります。
概要
哺乳類の成熟した骨格筋は多機能組織です。それは代謝を高度に調節し、熱産生の主な源であり、その動的特性はそれに呼吸、体節の移動、またはある点から別の点への変位に重要な役割を果たします1,2,3。骨格筋は、ミオパチー、ジストロフィー、サルコペニアなどの遺伝性および慢性疾患、および心血管代謝性疾患などの多くの非筋肉慢性疾患を含む多くの疾患の病態生理にも関連しています3,4,5,6,7,8。
健康と病気の文脈における成熟した骨格筋の構造的および機能的特性のex vivo研究は、主に2つの実験モデル、つまり全筋肉と孤立した繊維によって可能になりました。20世紀には、研究者は、運動単位、繊維の種類、および収縮と弛緩の力と動力学などの動的特性について学ぶために、さまざまな小さ....
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プロトコル
すべての手順は、コロンビア政府が発行した1989年の法律84および1993年の決議8430に従って、アンティオキア大学(UdeA)の動物実験倫理委員会(2016年6月21日の議事録104、および2021年4月15日の005)によって承認され、動物実験に準拠して実行および報告されました。 In Vivo Experiments (ARRIVE) ガイドラインの報告41.ここで紹介するすべての結果は、健康な7-13週齢、20-26g、C57BL/6雄マウスからのものです。図1は、この研究の一般的なデザインと手順の順序を示しています。すべての試薬、材料、および機器の詳細は、材料表に記載されています。
1.動物
- アクリル製の透明な長方形のケージにつき最大6匹のマウスを飼育し、木材由来の寝具を使用し、温度管理(21±〜2°C)と明暗(12:12時間)のサイクルで飼育します。
- 環境を豊かにすることなく、特定の病原体のない動物施設で動物に餌と水道水を自由に利用できるようにします。
2.解剖
- 溶液、....
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結果
けいれん中の筋質Ca2+ 濃度
解離した線維のセットにおける生理学的実験の実現可能性を実証し、励起収縮カップリング(ECC)と線維タイプに関する以前の知見を拡張するために、すべての筋肉の線維でCa2+トランジェントを取得しました。まず、FDB(n=5)およびEDL(n=7)は、形態タイプII(MT-II)として知られるCa2+速度論を示した。これらは高速でスパイク状の信号であり、RTは~1ミリ秒続きます。その減衰位相は、最初の成分(A1)が全振幅の30%より大きく、そのピーク[Ca2+]が15〜30μMの間である双指数関数を当てはめることができます33,47(図3B)。それらの結果は表1の第1列にプールされ(n =.......
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ディスカッション
成熟した骨格筋生物学の研究に利用できるモデルを補完するために、ここでは、短繊維、中線維、長線維を持つさまざまなマウスの筋肉の酵素解離の成功を実証します。これらの繊維は、骨格筋におけるCa2+ トランジェントのMT-II動態の一般化可能性の実証を可能にする。また、インタクト中の繊維の種類は、筋肉全体を分類した。FDBが生理学的実験に最も使用される筋肉であることから、解離後の細胞懸濁液中に存在する線維の種類を評価しました。
筋肉生物学研究のための短繊維、中繊維、長繊維のバッテリー
解剖技術、酵素処理の期間、使用する酵素の種類、および粉砕手順は、無傷の酵素解離繊維を得るためのプロトコル内の重要なステップです。解剖は、不必要なストレッチを避けながら、低酸素下での時間を短縮するために、できるだけ早く行う必要があります。後者の点は、ヒラメ筋に特に関連しており、腓腹筋-ヒラメ筋複合体を引き上げて除去してはならない。さらに、広範な酵素処理(~3時間)20,48
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開示事項
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
著者らは、動物と写真の助けをしてくれたUdeAのRobinson Ramírez教授と、技術サポートをしてくれたCarolina Palaciosに感謝の意を表します。KaikaのJohan Pinedaは、カラーカメラと蛍光カメラのセットアップを手伝ってくれました。クイーンズランド大学のShyuan Ngoさんが原稿の校正をしてくれました。この研究は、CODI-UdeA(2021年2月22日から2020-34909、2022年3月31日から2021-40170、SIU)およびコロンビアのメデジンにあるPlanning Office-UdeA(E01708-KおよびES03180101)からJCCに資金提供されました。資金提供者は、データの収集と分析、原稿の執筆または提出には参加しませんでした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Absolute ethanol | Sigma Aldrich | 32221 | |
| Aceton Merck | 179124 | ||
| Acrylamide | Gibco BRL | 15512-015 | |
| 過硫酸アンモニウム | Panreac | 141138.1610 | |
| 抗ミオシンI抗体 | Sigma Aldrich | M4276 | 一次抗体 |
| 抗ミオシンII抗体 | シグマ・アルドリッチ | M8421 | 一次抗体 |
| 抗ミオシンIIA抗体 | アメリカンタイプカルチャーコレクション | SC-71 | 一次抗体.HB-277ハイブリドーマ |
| から派生 抗ミオシンIIB抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | BF-F3-c | 一次抗体 |
| ビスアクリルアミド | AMRESCO | 0172 | |
| ウシ血清アルブミン | Thermo Scientific | B14 | |
| Bradford 試薬 | メルク | 1.10306.0500 | |
| ブロモフェノールブルー | カルロエルバ | 428658 | |
| 炭酸カルシウム | メルク | 102066 | |
| 二塩化カルシウム (CaCl2) | メルク | 2389 | |
| クロロホルム | シグマ アルドリッチ | 319988 | |
| コラゲナーゼ 2型 | ワージントン | CLS-2/LS004176 | |
| 領事マウント | サーモ サイエンティフィック | 9990440 | |
| クーマシー ブリリアント ブルー R 250 | メルク | 112553 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| ジチオスレイトール (DTT) | AMRESCO | 0281 | |
| エデチン酸 (EDTA | AMRESCO | 0322 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| グリセロール | パンレアック | ||
| グリシン | Panreac | 151340.1067 | |
| ヤギ血清 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| ヘマトキシリン | Thermo Scientific | 6765015 | |
| HEPES | AMRESCO | 0511 | |
| Hoechst 33258 | Sigma Aldrich | 861405 | |
| イミダゾール | AMRESCO | M136 | |
| イソペンタン | Sigma Aldrich | M32631 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Mag-Fluo-4, AM | Invitrogen | M14206 | DMSOでのみ調製。プルロン酸は必須ではなく、繊維の劣化を避けるために使用しないでください。 |
| メルカプトエタノール | Applichem | A11080100 | |
| メタノール | プロトキミカ | MP10043 | |
| マウス | 数個 | この原稿では、C57BL/6マウスのみを使用しました。しかし、いくつかの予備的な結果では、このプロトコルが同じ年齢と体重のスイスウェブスターマウスにうまく機能することが示されています。 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | |
| N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Promega | V3161 | |
| N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) | Tocris | 1870 | |
| Optimal cutting compound (OCT) | Thermo Scientific | 6769006 | |
| 二次抗体 | Thermo Scientific | A-11001 | ヤギ抗マウスIgG(H + L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 |
| Dodecil SufatePanreac | |||
| TRIS 0.5 M、pH 6.8 | AMRESCO | J832 | |
| トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン | AMRESCO | M151 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | M143 | |
| 材料 | |||
| 解剖室 | カスタムメイド | ||
| チャージスライド | エリー・サイエンティフィック | 5951PLUS | |
| 実験用浴室 | ワーナー・インスツルメンツ | RC-27NE2 | ナロー・バス・チャンバー 加熱されたプラットフォームでアンサンブル PH-6 |
| ファイン・フォーセプス | ワールド・プレシジョン・インス | 500338, 500230 | |
| ファインハサミ | ワールド・プレシジョン | バンナス・ハサミ 501778 | |
| ガラス パスツール・ピペット | いくつかの | ファイヤーポリッシュチップ | |
| キャップ付きガラスバイアル | 2-3mL | 手術 | |
| 用ハサミ | ワールド精密機器 | 501223-G | |
| Equipment | |||
| 遠心分離機 | Thermo Scientific | SL 8R | |
| 共焦点顕微鏡 | オリンパス | FV1000 | |
| クライオスタット | ライカ | CM1850 | |
| デジタルカメラ | Zeiss | Erc 5s と Axio 305 Axio | 305 は、Stemi 508 ステレオスコープと組み合わせて解剖中の写真を撮影するために使用され、Erc 5s または Axio 208 は、Axio Observer A1 顕微鏡と組み合わせて、単離されたファイバーと免疫蛍光アッセイの画像を撮影するために使用されました |
| Digitizer | Molecular Devices | 1550A Digidata | |
| Electrophoresis chamber | Bio Rad | 蛍光に結合されたミニプロティアンIV | |
| 倒立顕微鏡 | ツァイス | アクシオオブザーバーA1 | 蛍光のための適切な光源、フィルター、対物レンズに結合 |
| 光電子増倍管 | 堀場 | 製作所 R928 チューブ、浜松、D104光度計、堀場 | 製作所 蛍光顕微鏡の横ポートに結合 |
| スコープ | ツァイス | ステミ508 | |
| スティミュレーター | グラスインストゥルメント | S6 | |
| ウォーターバス | Memmert | WNE-22 | |
| Xilol | Sigma Aldrich | 808691 | |
| Software | |||
| 電気泳動分析用フリーソフト | University of Kentucky | GelBandFitter v1.7 | http://www.gelbandfitter.org |
| 画像解析と形態計測用のフリーソフト | National Institutes of Health | ImageJ v1.54 | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
| Ca2+ 信号取得・解析ライセンスソフトウェア | Molecular Devices | pCLAMP v10.05 | https://www.moleculardevices.com |
| 統計解析・グラフ化ライセンスソフトウェア | OriginLab | OriginPro 2019 | https://www.originlab.com/ |
参考文献
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
- Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
- G....
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