方法論記事

腱の研究のための2光子顕微鏡

DOI：

10.3791/65853

⸱

2024年3月29日

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、多光子顕微鏡を使用した腱の準備、セットアップ、およびイメージングのプロセスについて概説します。さらに、コラーゲン線維のアライメントを分析するためのSHGの応用と、腱の3D表現の作成についても説明します。この方法論は、損傷および発生中の腱細胞とそのECMを特徴付ける上で非常に価値があることが証明されています。

要約

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二光子顕微鏡は、深部組織細胞を評価し、さまざまな生体システムにおける細胞外マトリックス(ECM)のアライメントを特徴付けるための強力なツールとして浮上しています。この手法は、非線形の光物質相互作用に依存して、コラーゲン繊維とその配向の可視化を容易にする第2高調波生成(SHG)拡散信号と、紫外線励起自家蛍光のイメージングのための近赤外励起信号の2つの異なる信号を検出します。

SHGイメージングは、原線維性コラーゲンIの非中心対称結晶構造により、コラーゲン繊維の視覚化に特に効果的であることが証明されています。腱は細胞数が限られているマトリックスに富む組織であるため、コラーゲン含有量が高いため、2光子顕微鏡による分析に理想的な候補となります。したがって、2光子顕微鏡は、腱のコラーゲン異常を分析および特徴付けるための貴重な手段を提供します。その応用は、腱の発達、損傷、治癒、老化の研究にまで及び、2光子顕微鏡ツールを用いて、さまざまな条件下での腱細胞とECMとの相互作用の包括的な特性評価を可能にします。このプロトコルは、腱生物学における二光子顕微鏡の使用を概説し、発生中および損傷後の腱細胞の効果的なイメージングと特性評価を達成するための適応方法論を提示します。この方法により、薄い顕微鏡切片を利用して、腱内のECMとこのマトリックスと相互作用する細胞の包括的な画像を作成できます。最も注目すべきは、この記事で、動物モデルで2光子顕微鏡を使用して3D画像を生成する手法を紹介していることです。

概要

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筋肉から骨1に力を適切に機能させ伝達するために、腱はコラーゲン繊維間の分子間結合と分子内結合に依存しています。コラーゲン線維の複雑な自己組織化、架橋、および整列により、腱組織2,3,4の生体力学的強度と柔軟性に寄与する高度に組織化されたマトリックスが確立されます。他のECMタンパク質も腱の線維ネットワークの安定性に寄与しているが5、腱の乾燥塊は約86%のコラーゲン6であり、コラーゲンIは全コラーゲン含有量の最大96%を占めている7,8。これにより、最終的にはコラーゲン構造が正常な腱の健康と機能の主要な出力になります。

腱に使用される臨床画像診断法には、MRIおよび/または超音波があります。超音波技術は、腱の束構造の画像を提供し、組織の線維構造の一部を明らかにしますが9、解像度は定量化には理想的ではありません。MRIは超音波画像よりも空間分解能が優れていますが、それでも制限があります。ただし、これらの方法は、組織を介した潜在的なイメージング深度にも制限があります。よりミクロなスケールでは、小角および広角の光散乱顕微鏡と共焦点顕微鏡を使用して、コラーゲン線維の構造と潜在的な異常を評価することができます。

対照的に、第2高調波発生(SHG)顕微鏡法は、コラーゲン線維の外殻を捕捉できるという点で、他のイメージング方法とは異なります。腱のコラーゲンI線維は、腱ECMを介して一軸平行に組織化されており、本質的に非中心対称です4,10。これらの特性は、多光子顕微鏡を用いたイメージングに活用することができ、共焦点イメージング11の最大2〜3倍の深さの鮮明な画像を生成することができる。これにより、腱のより高品質の光学切片を生成することもできます。目的のサンプルに光を投影すると、SHG信号が生成され、この光の散乱を捕捉できます。腱では、これによりコラーゲンの構造と配列の画像が生成されるため、腱鞘炎や損傷などの潜在的な形態学的および病理学的結果を評価できます。

コラーゲンは腱の乾燥塊の大部分を占め、腱の機能に寄与しているため6,12、コラーゲン構造の混乱は腱の生体力学的特性に影響を与える可能性があります。したがって、その構造を分析することで、怪我の影響と重症度をよりよく理解し、治癒効果の指標を作成するのに役立ちます。この論文では、多光子顕微鏡とSHG顕微鏡を使用して、発生と損傷がコラーゲンI線維の構造と整列にどのように影響するかを分析し、動物モデルで腱ECMの3D画像を生成する方法をレビューします。したがって、腱を画像化する私たちの方法は、研究者が発生中または損傷後の腱細胞とECMを特徴付けるのに役立つ可能性があります。

プロトコル

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すべての動物実験は、マサチューセッツ総合病院の動物実験委員会(IACUC)(プロトコル #2013N0000062)およびAAALACガイドラインに従って行われました。本研究では、Scx-GFPバックグラウンド、30日齢のヌルノックアウトまたはヘテロ接合性の雌マウスをBHLHE40ヌルノックアウトまたはヘテロ接合体の雌マウスに使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1. 組織の準備と固定

  1. 組織を準備するには、マウスをCO2 チャンバーで安楽死させ(施設で承認されたプロトコルに従って)、その後子宮頸部脱臼を行います。
  2. 組織サンプルに付着する可能性のある毛皮の量を減らすために、毛皮が飽和するまでマウスに70%EtOHをスプレーします。後肢の皮を剥ぎ、はさみを使用して、股関節を切って2つの後肢を取り除きます。
  3. 2つの後肢を20mLのシンチレーションバイアルに入れ、バイアルが満たされるように4%PFAに浸します。バイアルを4°Cに置き、一晩攪拌します。
  4. 後肢を1x PBSで室温(RT)で10分間攪拌しながら洗浄し、合計3回繰り返します。後肢を4°Cの0.5M EDTA(pH 8.0)に浸し、最大2週間攪拌し、2〜3日ごとに新しいEDTAと交換します。
  5. 後肢をRTで1x PBSで10分間攪拌しながら洗浄し、合計3回洗浄を繰り返します。
  6. 手足を新鮮な1x PBSに浸し、イメージングに使用するまで4°Cで保存します。

2. 腱の解剖とイメージングのための組織の準備

  1. 鉗子で足を保持しながら、スプリングハサミの刃の一端( 材料の表を参照)をアキレス腱の下にスライドさせ、筋腱接合部にできるだけ近づけて切断するようにします。
  2. 切断された腱の筋腱端を鉗子で保持し、スプリングハサミを使用して腱をできるだけ骨の近くで切り取ります。
    注:必要に応じて、鉗子を使用して、最初のカット中にアキレス腱を後肢の残りの部分から遠ざけます。組織を押しつぶしたり傷つけたりしないように、イメージング中のコラーゲンのアライメントに影響を与えますので、ご注意ください。
  3. 透過処理して核対比染色を行うには、解剖した腱を0.1% Draq5(ストック濃度、5 mM、 材料表を参照)を含むPBT(PBS中の1% Triton-X)に浸します。腱を2 mLの微量遠心チューブに入れ、1 uLのDraq5を1 mLのPBTに加えます。ロッカーの上でRTで一晩インキュベートします。Draq5は光に弱いため、微量遠心チューブをアルミホイルで覆い、サンプルを光から保護します。
  4. イメージングする前に、Draq5溶液を取り外し、dPBSに交換してください。サンプルを光から保護し続けるようにしてください。
    注意: Draq5 にはカテゴリー 3 の毒性があり、OSHA Hazard Communication Standard では危険と見なされています。接触を避け、ラベルの付いた廃棄物容器に廃棄してください。
  5. 内径6mmの生検パンチツールを使用して、ゲルフォームを切り取り( 材料の表を参照)、60 x 15 mmの小さなシャーレに入れます。ディッシュにddH2Oを加えて、ジェルフォームが膨張するのを待ちます。
  6. 解剖したアキレス腱をジェルフォームの上に置きます。ワッシャーに接着したカバースリップを使用して、カバースリップが組織に接触するまで、ワッシャーを腱の上に慎重に置きます。イメージング時の問題を避けるために、サンプルとカバーガラスの間に気泡がないことを確認してください。必要に応じて、ディッシュにddH2Oを追加して、サンプルとワッシャーをカバースリップで覆います。

3. 多光子顕微鏡によるイメージング

  1. FVMPE-RS多光子レーザー顕微鏡、水に浸すことができる25倍対物レンズ、HPDS-O IRパルスレーザー、およびIRパルスレーザー( 材料の表を参照)を使用して、EPI光路を使用してイメージングするサンプルと関心領域を特定します。サンプルが見つかったら、カメラをアキレス腱の筋腱または腱端にセットします。
  2. 光路を LSHに切り替え、Laser 2のIRレーザー設定を 840nmに調整し、アクティブに位置合わせします。HV強度を調整して、組織とSHG信号が20%を超えないようにします。ゲインを調整したり、オフセットを0にしたりしないでください。
  3. 次に、サンプル画像を取得するように z-stack パラメーターを構成します。1024 x 1024 のスキャン サイズを使用し、ステップ サイズを 0.4 ミクロンに設定します。Zスタックは、平均して約150スライスであり、外側のシースから始まり、SHG信号が明確でなくなるまで腱の中心に向かって移動し、矢状光学セクション13を生成する。
  4. レーザー出力を Bright Z モードに調整して、信号検出の標準化を可能にします。Zスタックの開始/停止パラメータを設定したら、レーザー強度をイメージング開始時に4から、イメージング終了時に6から設定します。これにより、スコープが組織のより深くまでイメージングするため、SHGシグナル伝達の一貫性を維持することができます。
  5. zスタックが生成されたら、ImageJ/FIJIでさらに処理して、横方向の光学セクションのムービーを作成します。これを行うには、ImageJ / FIJIソフトウェア14 を開き、[ Image]>[Stacks]>[Reslice]をクリックします。これにより、アキレス腱を横方向から見ることができ、腱細胞の星状形態とコラーゲンマトリックス内のそれらの配向を明らかにすることができます。

結果

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このプロトコールは、損傷後、発生中、または突然変異状態での腱細胞とその細胞外マトリックス(ECM)の特性評価に役立ちます。サンプルを慎重に解剖し、調製することで、組織を通じて矢状方向にzスタックビデオを生成することができます(ビデオ1 および ビデオ2)。ImageJ/FIJIを使用して画像を処理および再スライスすることにより、アキレス腱の横方向のビューが作成されます(ビデオ3 および ビデオ4)。これにより、テノサイトの星状形態が明らかになり、高密度のコラーゲンマトリックス内でのテノサイトのユニークな構造を観察することができます。

多光子顕微鏡法を利用し、線維性コラーゲンIの非中心対称結晶特性を活用することにより、腱細胞とそのマトリックスの両方を捉える高解像度の光学切片画像が生成されました。これらの光学セクションは、BHLHE40 +/-の両方のzスタックから分離されています。Scx-GFPおよびBHLHE40 -/-;Scx-GFPマウス(それぞれ図1A、B)。これらの切片は、2-Pイメージングによって作成された元の矢状zスタックと、ImageJ/FIJIを使用して生成された再スライスされたzスタックから取得されます。これに加えて、このイメージング法を使用して、2匹のマウス間のコラーゲン組織、細胞形態などの潜在的な違いを分析することもできます。

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図1:BHLHE40の光学セクション+/-;Scx-GFPおよびBHLHE40 -/-;Scx-GFPマウス腱。 Zスタックは多光子顕微鏡を使用して取得しました。(A)Zスタックから取得した光学セクションは、SHG信号とGFP+/Draq5+セルをBHLHE40+/-で示しています。Scx-GFP(P30、女性、14.68g)および(B)BHLHE40-/-;Scx-GFP(P30、女性、12.16g)。矢状断面にはSHG信号が含まれていますが、横断面には含まれていません。サンプルはDraq5で対比染色しました。SHGは、組織内のコラーゲンマトリックスを捕捉します。スケールバー = 10 μm. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:BHLHE40 +/-の矢状ビューのZスタックビデオ。Scx-GFPマウス腱。 Zスタックは、2光子顕微鏡を使用して取得しました。ビデオは、アキレス腱の矢状図を示しています。サンプルはDraq5で対比染色しました。SHGは、組織内のコラーゲンマトリックスを捕捉します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:BHLHE40の矢状ビューのZスタックビデオ-/-;Scx-GFPマウスアキレス腱。 Zスタックは、2光子顕微鏡を使用して取得しました。このビデオは、BHLHE40ヌルKOマウスのアキレス腱の矢状図を示しています。サンプルはDraq5で対比染色しました。SHGは、組織内のコラーゲンマトリックスを捕捉します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ3:BHLHE40 +/-の横方向のZスタックビデオ。Scx-GFPマウス腱。 Zスタックは、2光子顕微鏡を使用して取得しました。ビデオは、アキレス腱の横方向を示しています。サンプルはDraq5で対比染色しました。SHGは、組織内のコラーゲンマトリックスを捕捉します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ4:BHLHE40の横方向のビューのZスタックビデオ-/-;Scx-GFPマウスアキレス腱。 Zスタックは、2光子顕微鏡を使用して取得しました。このビデオは、BHLHE40ヌルKOマウスのアキレス腱の横方向図を示しています。サンプルはDraq5で対比染色しました。SHGは、組織内のコラーゲンマトリックスを捕捉します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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この記事では、腱ECMの非中心対称結晶特性を利用して、マウスのアキレス腱を調製、解剖、および画像化する方法を紹介します。組織調製における重要なステップには、対比染色のための透過処理と、イメージング中のペトリ皿への適切な組織配置の確保が含まれます。Hoechst 33258は、Draq5の代わりに1:100,000の希釈13で使用できますが、高い透過性、光安定性、および光退色が少ないため、Draq5が好まれます。カバーガラスと腱の間に気泡が入らないようにするには、組織を適切に配置することが重要です。これは、向きが正しくないと画像に影響を与える可能性があるためです。

他の顕微鏡法と比較して、第2高調波発生(SHG)顕微鏡法は、マトリックス10内のコラーゲン線維および腱細胞の捕捉を可能にする。このデータを対比染色と組み合わせることで、発生、損傷、または突然変異が腱の構造にどのように影響するかを分析できます。腱ECMの3D画像を生成することで、腱を通過する光学部分を観察することができます。多光子技術は優れた組織浸透性を提供しますが、アキレス腱全体を通るイメージングにはまだ限界があり、切片化などの追加の技術が必要です。しかし、この方法により、約150個の0.4ミクロンの光学切片を明瞭に作製することができ、切片化による組織の摂動を回避することができます。

要約すると、この方法は、多光子顕微鏡を使用して腱細胞とECMをイメージングすることにより、腱の発達、損傷、治癒、および老化の特性評価に関する貴重な洞察を提供します。組織全体の光学切片とzスタックビデオに多光子イメージングを利用することで、実験条件下での腱の形態の変化をよりよく理解できます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

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著者は、これらのプロトコルの開発とトラブルシューティングにおける支援と励ましについて、Jenna GallowayとGalloway Labのメンバーに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9262
2 mL 微量遠心チューブUSA Scientific1620-2700
20 mL シンチレーションバイアルSigma-AldrichZ190527-1PAK
4% パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 Sciences50-980-487PFAアンプオールを使用して4% PFA溶液を作成
6 mm Biopsy Punch ToolTed Pella Inc.15111-60
60 x 15 mm ペトリ皿
BHLHE40 Scx-GFP 背景のヌルノックアウトまたはヘテロ接合マウス ジャクソン研究所JAX ID #029732MGI ID #3717419
カバースリップフィッシャー12-544-FM20ワッシャー
dPBSGibco14190144
Draq5ABCAMab108410
ファインハサミ 21 mm カッティングエッジファインサイエンスツール14060-10
FVMPE-RS 多光子レーザー走査型顕微鏡Olympus
Gelfoam 滅菌スポンジ サイズ 50 ファイザー00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR パルスレーザーオリンパス
舞泰 HPDS-O IR パルスレーザーオリンパス
リン酸緩衝生理食塩水 (1x)InvitrogenAM962510x PBS を milli-Q 水で希釈して 1x 溶液を得る
ステンレス鋼 M20 平ワッシャー McMaster-Carr
Triton X-100MP Biomedicals807426Triton X-100 を dPBS で希釈して 1% 溶液を得る
Vannas スプリングはさみ 4 mm 刃先ファイン サイエンス ツール15018-10
XLPlan N 25X WMP レンズ

参考文献

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