Method Article

脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル

DOI:

10.3791/65857

⸱

August 11th, 2023

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1Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Institute for Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC)

In This Article

Summary

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このプロトコルは中間の大脳の動脈のintraluminal閉塞によってマウスの一時的な焦点の大脳の虚血のモデルを記述する。さらに、磁気共鳴画像法と行動テストを使用した結果評価の例が示されています。

Abstract

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脳卒中は、世界的に死亡または慢性障害の主な原因となっています。それにもかかわらず、既存の最適な治療法は、虚血性脳卒中の急性期の再灌流療法に限定されています。脳卒中の生理病理学に関する洞察を得て、革新的な治療法を開発するために、脳卒中の in vivo げっ歯類モデルが基本的な役割を果たします。遺伝子改変動物が利用できるようになったことで、特にマウスが脳卒中の実験モデルとして利用されるようになった。

脳卒中患者では、中大脳動脈(MCA)の閉塞がよく見られます。その結果、最も一般的な実験モデルには、頭蓋切除術を必要としない低侵襲技術であるMCAの管腔内閉塞が含まれます。この手順では、モノフィラメントを外頸動脈(ECA)に挿入し、MCAの分岐点に達するまで内頸動脈(ICA)を通って進めます。45分間の動脈閉塞後、モノフィラメントを除去して再灌流を行います。プロセス全体を通して、脳血流がモニターされ、閉塞中の減少と再灌流後のその後の回復が確認されます。神経学的および組織の結果は、行動テストと磁気共鳴画像法(MRI)研究を使用して評価されます。

Introduction

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WHOによると、脳卒中は世界中で年間約1,500万人が罹患する壊滅的な病気です。患者の約3分の1がこの症状に屈し、別の3分の1が永久的な障害を経験します。脳卒中は、神経細胞や末梢免疫細胞、血管系、全身反応など、さまざまな種類の細胞が関与する複雑な病態です1。脳卒中によって引き起こされる反応の複雑なネットワークは、システムレベルでは、現在のところin vitro モデルを使用して再現することはできません。したがって、実験動物モデルは、病気のメカニズムを掘り下げ、新しい治療法を開発およびテストするために不可欠です。現在、早期組織再灌流は、組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)による血栓溶解または血管内血栓摘出術のいずれかによる唯一の承認された介入です1。

中大脳動脈(MCA)の閉塞は脳卒中患者によく見られます。その結果、一過性MCA閉塞(tMCAo)のげっ歯類モデルが最初にラットで開発されました2,3,4。現在、遺伝子改変マウスは、実験的な脳卒中モデルで最も一般的に使用されている動物です。本研究では、マウスにおける管腔内tMCAoの低侵襲モデルについて述べる。アプローチは、頭....

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Protocol

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動物実験は、カタルーニャ州とスペインの法律(Real Decreto 53/2013)と欧州指令に従い、バルセロナ大学の倫理委員会(Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA)とカタルーニャ州議会の地方規制機関の承認を得て実施されました。研究はARRIVEガイドラインに準拠して報告されています。この手順は、年齢制限なしで、8週齢から開始する成体マウスで実施するように設計されています。ここでは、10〜12週齢のC57BL/6マウスで開発された外科的処置の例を提供します。マウスの系統による解剖学的違いを考慮する必要があります。

1.動物の調製

  1. 外科的処置を開始する前に、必要なすべての材料と道具を集めて滅菌します。必要なすべての手術材料で手術台をセットアップします( 材料表に記載されています)。
  2. 酸素と亜酸化窒素の混合物(30%/70%)中のイソフルラン吸入を使用して動物を麻酔します。
  3. 鎮痛を提供し、痛みや不快感を和らげるために、0.05 mg / kg BWの投与量でブプレノルフィン( 材料表を参照)を皮下投与します。.
    注:鎮痛は必須ですが、異なるプロトコルが受け入れられます。痛みや不快感の兆候も、MCAo後の最初の数日間はコントロールする必要があります(ステップ4を参照)....

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Results

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tMCAo手順の結果を評価するには、さまざまなアプローチがあります。ここでは、 in vivo ニューロイメージング法(MRI)と行動検査が利用されています。

マウスは脳内に虚血性病変を発症し、主に線条体や背外側皮質など、閉塞に対して同側のMCAによって供給される領域に影響を及ぼします。病変の範囲を決定するには、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)組織染色、組織学的染色(ヘマトキシリン/エオシン、酢酸チオニン)、およびMRIなどの in vivo 神経画像モダリティなど、いくつかの方法があります。MRIは、その非侵襲的な性質と、同じ組織を他の研究に使用でき、各マウスの病変の包括的な評価を提供する能力のために、ここで選択されました。さらに、MRIは同じ動物で繰り返し測定できるため、結果の再現性が向上し、多くの場合、研究に必要な動物の数を減らすことができます。

イソフルランを使用した同じ麻酔プロトコル(導入5%、維持1.5%)がMRIセッションで使用されました。病変体積の評価.......

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Discussion

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管腔内tMCAo手順は、基礎研究における再灌流を伴う限局性脳虚血の最も一般的に使用されるモデルです。現在、マウスは遺伝子組み換え株が入手可能なため、好ましい動物モデルです。しかし、遺伝子組み換えマウスとその遺伝的背景が脳の血管新生に影響を与える可能性があることを認識することが不可欠です。異なる動脈領域間の側副循環と吻合の存在は、実験手順の結果に大きな影響を与える可能性があります11。

この手順を実行するときは、特定の重要なポイントを考慮する必要があります。損傷はMCAの領域外で発生する可能性があり、海馬、視床、視床下部などの領域に影響を及ぼし、通常は後部連絡動脈の閉塞が原因です。さらに、ごく一部のマウスは、一見成功した外科的処置にもかかわらず、明らかな梗塞を示さないことがあります。

いくつかの変数は、手順中に監視する必要があります。脳病変の発症は、脳血流(CBF)低下の重症度とこの減少の持続時間に直接依存します5,12

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Disclosures

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著者は利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgements

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この研究は、 Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI)、 Gobierno de España/10.13039/501100011033および「欧州地域開発基金(ERDF)」が資金提供する助成金PID2020-113202RB-I00によって支援されています。ヨーロッパを作る方法」。NCCとMARには、MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033および「European Social Fund (ESF) Investing in your future」によって資金提供された博士課程前のフェローシップ(それぞれPRE2021-099481とPRE2018-085737)がありました。技術サポートをしてくれたFrancisca Ruiz-Jaén氏とLeonardo Márquez-Kisinousky氏に感謝します。我々は、Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer(IDIBAPS)のMRI画像施設の支援に感謝する。カタルーニャ州政府のカタルーニャ研究センター(CERCA)プログラムは、IDIBAPSをサポートしています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6/0縫合 アラゴ血管結紮糸
6/0縫合糸 湾曲針付きアラゴ皮膚縫合糸
9mg/mL 生理食塩水フレゼニウス・カビCN616003 EC水分補給
用 麻酔システムSurgiVet
鈍器リトラクター、1mm幅ファインサイエンスツール18200-09
ブプレノーファインブプレックス用鉗
子を適用する痛みFine Science ToolsS&T CAF4
デュモン ミニ鉗子ファイン サイエンスツール M3S 11200-10
鉗子ファイン サイエンス ツール91106-12
グルーロックタイトLDFプローブを頭蓋骨に貼り付ける
グリップ強度計IITC ライフサイエンス#2200
イソフルランB-ブラウンCN571105.8
LDF PerimedPeriflux System 5000
LDF プローブホルダーPerimedPH 07-4
医療用テープ
MRI 磁石Bruker BioSpin, Ettlingen, GermanyBioSpec 70/30 horizontal animal scanner 
縫合カッター付きニードルホルダーファインサイエンスツール12002-14
ナイロンフィラメントドッコル701912PK5RE
加熱パッド
サージカルハサミファインサイエンスツール91401-12
小型血管焼灼器キットファインサイエンスツール18000-00
ステレオマイクロスコープと冷光ライカM60
縫合糸結束鉗子ファインサイエンスツール18025-10
サーモスタット、直腸プローブ、マウスパッドレティカ サイエンス インスツルメンツLE 13206
バンナス スプリングはさみ (4mm 刃先)ファイン サイエンス ツール15019-10
血管クランプファイン サイエンス ツール00396-01
の緩和クランプ付きリカバリーケージ

References

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  1. Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
  2. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M.

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