脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル

WHOによると、脳卒中は世界中で年間約1,500万人が罹患する壊滅的な病気です。患者の約3分の1がこの症状に屈し、別の3分の1が永久的な障害を経験します。脳卒中は、神経細胞や末梢免疫細胞、血管系、全身反応など、さまざまな種類の細胞が関与する複雑な病態です¹。脳卒中によって引き起こされる反応の複雑なネットワークは、システムレベルでは、現在のところin vitro モデルを使用して再現することはできません。したがって、実験動物モデルは、病気のメカニズムを掘り下げ、新しい治療法を開発およびテストするために不可欠です。現在、早期組織再灌流は、組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)による血栓溶解または血管内血栓摘^{出術のいずれか}による唯一の承認された介入です1。

中大脳動脈(MCA)の閉塞は脳卒中患者によく見られます。その結果、一過性MCA閉塞(tMCAo)のげっ歯類モデルが最初にラットで開発されました^2,3,4。現在、遺伝子改変マウスは、実験的な脳卒中モデルで最も一般的に使用されている動物です。本研究では、マウスにおける管腔内tMCAoの低侵襲モデルについて述べる。アプローチは、頭蓋切除術なしで、頸部レベルで頸動脈を介して行われます。

閉塞期間の期間は、虚血性病変の範囲を決定する重要な要素です。10分間の短い閉塞でも、明らかな梗塞を伴わずに選択的神経細胞死を引き起こす可能性がありますが、通常30〜60分続く長い閉塞は、ある程度の脳梗塞を引き起こします。皮質に供給し、側副を持つMCAの近位枝および遠位枝とは異なり、線条体に血液を供給するレンチキュロ線条体動脈は側^{副動脈を欠い}ている5。その結果、tMCAo後の皮質よりも線条体の血流が大幅に減少します。したがって、30分以下の閉塞は一般的に線条体に影響を与えますが、皮質には影響を与えませんが、45分以降の長い閉塞は、線条体と背外側皮質を含むMCA領域全体に虚血性病変を生成することがよくあります。

マウスの健康を確保するために、手術前に鎮痛剤を投与し、手術中は麻酔を使用します。それにもかかわらず、麻酔はマウスの生理機能に人為的な変化をもたらす可能性があり、いくつかの結果測定に影響を与える可能性があります⁶。外科的介入は、経験豊富な担当者によって行われた場合、MCAoを誘発するために通常約15分続きます。その後、麻酔下の合計時間は閉塞期間によって異なります。麻酔を最小限に抑えることが重要な実験では、閉塞期間中に麻酔を中止し、MCAを閉塞するフィラメントを挿入および引き抜くための外科的ステップのみに制限する手順の代替ステップがあります。このアプローチは、麻酔の期間を短縮し、^{実験モデルに対する}潜在的な人工的影響を最小限に抑えます^7,8。したがって、一過性限局性虚血を誘発する方法は、MCAの管腔内閉塞によって提示されます:閉塞期間全体を通してマウスを麻酔するか、この期間中にマウスを覚醒させるかの2つのバリアント。いずれの場合も、虚血マウスに実施される介入と並行して偽手術を行うべきである。さらに、再灌流後のさまざまな時点で行動テストとMRIによって測定された結果評価に関するデータが提供されます。最後に、実験手順を実施する際に考慮すべき主な要因について説明します。

動物実験は、カタルーニャ州とスペインの法律(Real Decreto 53/2013)と欧州指令に従い、バルセロナ大学の倫理委員会(Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA)とカタルーニャ州議会の地方規制機関の承認を得て実施されました。研究はARRIVEガイドラインに準拠して報告されています。この手順は、年齢制限なしで、8週齢から開始する成体マウスで実施するように設計されています。ここでは、10〜12週齢のC57BL/6マウスで開発された外科的処置の例を提供します。マウスの系統による解剖学的違いを考慮する必要があります。

1.動物の調製

1. 外科的処置を開始する前に、必要なすべての材料と道具を集めて滅菌します。必要なすべての手術材料で手術台をセットアップします( 材料表に記載されています)。
2. 酸素と亜酸化窒素の混合物(30%/70%)中のイソフルラン吸入を使用して動物を麻酔します。
3. 鎮痛を提供し、痛みや不快感を和らげるために、0.05 mg / kg BWの投与量でブプレノルフィン( 材料表を参照)を皮下投与します。.
   注:鎮痛は必須ですが、異なるプロトコルが受け入れられます。痛みや不快感の兆候も、MCAo後の最初の数日間はコントロールする必要があります(ステップ4を参照)。必要に応じて是正措置を適用します。
4. 動物を5%イソフルランを含む麻酔導入ボックス( 材料表を参照)に、深い麻酔の状態(足穿刺の反射と眼反射の喪失)に達するまで入れます。
5. マウスを手術台に置き、フェイスマスクで送達されるイソフルランのレベルを1.5%に下げます。処置中の目の乾燥を避けるために獣医の軟膏を塗ります。
6. 体温を37〜0.5°Cに維持し±加熱パッドに接続された直腸プローブによって制御します( 材料表を参照)。
7. 首の腹側部分と頭(ふくらはぎ)を電気カミソリで剃ります。毛皮の破片を慎重に取り除き、ヨウ素ベースの消毒剤と70%アルコールで皮膚領域を円を描くように3回消毒します。
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2.レーザードップラーフローメトリー(LDF)による脳血流(CBF)評価

1. はさみで、矢状縫合糸の方向に、耳から目の間の領域まで、頭の皮膚を切開します。
2. 皮膚を引っ込め、頭蓋骨の右側にある骨膜を取り除きます。
3. 座標(ブレグマから横方向2.5mm)を見つけ、シアノアクリレートを使用してドップラーホルダー( 材料表を参照)を取り付けます。接着剤が乾いたら、ドップラープローブを接続し、正しい信号の読み出しを確認します。

3.一過性中大脳動脈閉塞症(tMCAo)

1. マウスを仰臥位にひっくり返し、医療用テープで手術台に固定します。
2. 首を正中線で切開します。リトラクター( 材料表を参照)を使用して皮膚と唾液腺を横方向に引き戻し、頸動脈領域を露出させます。
3. 総頸動脈(CCA)、ICA、ECAの血管解剖学的構造と、それらに由来するさまざまな動脈(上顎動脈、舌動脈、上甲状腺動脈、後頭動脈、翼口蓋)を特定します(図1A)。
4. 主動脈を隣接する結合組織から切り離して、処理できるようにします。
   注意: 神経、特にCCAと平行に走る迷走神経を傷つけないように特に注意してください。
5. 上顎/舌の分岐部でECAの周りに6-0シルク縫合糸( 材料表を参照)を巻き付けます。結び目をしっかりと固定して、循環を永久に中断します。
6. 最初の結び目とCCA分岐部の間の同じ動脈の周りに2番目の縫合糸を通し、この結び目を緩めたままにします。
7. CCAの周りに3本目の糸を置き、簡単にほどけるスリップノットを結びます。
   注:これは血管クリップでも実行できますが、スレッドを使用すると、動きと柔軟性が向上します。この段階では、LDF信号におけるCBFの最初の減少を観察することができる。
8. ICAからの血液循環を遮断する血管クリップ( 材料表を参照)を配置します。
9. ECAを、タイトな結び目がある領域の近くで小さく切開します。
10. 厚いコーティングが動脈内腔に完全に入るまでモノフィラメントを挿入します。
11. 2番目の結び目を締めてモノフィラメントを動脈内に保持し、血液によって加えられる圧力がモノフィラメントを押し出すのを防ぎます(図1B)。
12. ICAから血管クリップを取り外します。
13. ECAを最初の結び目より下にカットし、切り株を回転させてICAの方向に向けます(図1C)。
14. モノフィラメントをICA 経由で MCAが分岐するポイントまで進めます。
    注:閉塞は、LDF読み出しの血流の急激な低下に反映されます。CBFの低下が基礎値から70%を超える場合、閉塞が成功したと見なします。CBF測定システムが利用できない場合、閉塞点は前進抵抗によって注目され、成体マウスでは通常、CCAの分岐部から約11mmである。
    1. 閉塞期間中に麻酔を継続する場合は、マウスを監視し、45分間常に観察してください。
    2. 閉塞期間中にマウスが目覚めた場合は、首の皮膚を数針縫合します。LDFプローブを取り外さずに、マウスを温度制御されたボックスに入れ、麻酔から回復できるようにします。
       注:この期間中、マウスが自発的な旋回行動を示すのが一般的であり、咬合が成功したことを示しています。
    3. 40分後、ポイント1.4、1.5、および1.7に示されているのと同じ麻酔および消毒手順に従って、マウスに再度麻酔をかけます。手術台に戻し、首のステッチを外します。
15. 45分間の閉塞後、モノフィラメントを所定の位置に保持している結び目を緩めます。フィラメントをゆっくりと優しく引っ張り、組織の再開通が起こることを確認します。
16. フィラメントを引き出し、失血を防ぐために結び目を締めます。
17. CCAの結び目をほどきます。動脈壁の損傷がないことを確認してください。
18. リトラクターを取り外し、筋肉、腺、皮膚の位置を変えます。皮膚を縫合し(6-0)、消毒剤を塗布します。
19. ドップラープローブを外し、ホルダーを取り外します。頭の皮膚を縫合して消毒します。
20. 麻酔からの回復期間中は、マウスをヒーター付きのケージに入れたままにして温度を維持します。麻酔から完全に回復するまで、常に観察してください。回復後、マウスをケージに戻すことができます。
    注:社会的に豊かな住宅を強くお勧めします。ただし、攻撃性を防ぐため、手術したマウスと手術していないマウスを物理的に離さずに同じケージに入れないでください。

4.術後のケア

1. 地域の規制に従って確立された手順と規制に従って、定期的に動物を監督します。手術後の痛みを最小限に抑えるために、適切なスケジュールで鎮痛治療を行います。
   注:本研究では、手術後6時間および24時間で介入の開始時と同じ鎮痛薬(ブプレノルフィン0.05mg / kg BW)を適用しました。
2. 監督パラメータが安楽死を示している場合は、施設で承認されたプロトコルに従って安楽死を実行します。
3. 動物の体重を毎日監視します。手術後の最初の数日間は、動物に柔らかい餌を与えます。さらに、手術直後に生理食塩水(200μL)の皮下注射によってそれらを水分補給し、その後定期的にマウスが自力で水分補給しないことが観察された場合は、それらを水分補給します。動物が簡単にアクセスできる方法で餌と水を配置します。
4. in vivo試験が完了したら、マウスに麻酔をかけ、安楽死させ、脳組織を切除してさらに病理組織学的分析を行います(必要な場合)。

tMCAo手順の結果を評価するには、さまざまなアプローチがあります。ここでは、 in vivo ニューロイメージング法(MRI)と行動検査が利用されています。

マウスは脳内に虚血性病変を発症し、主に線条体や背外側皮質など、閉塞に対して同側のMCAによって供給される領域に影響を及ぼします。病変の範囲を決定するには、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)組織染色、組織学的染色(ヘマトキシリン/エオシン、酢酸チオニン)、およびMRIなどの in vivo 神経画像モダリティなど、いくつかの方法があります。MRIは、その非侵襲的な性質と、同じ組織を他の研究に使用でき、各マウスの病変の包括的な評価を提供する能力のために、ここで選択されました。さらに、MRIは同じ動物で繰り返し測定できるため、結果の再現性が向上し、多くの場合、研究に必要な動物の数を減らすことができます。

イソフルランを使用した同じ麻酔プロトコル(導入5%、維持1.5%)がMRIセッションで使用されました。病変体積の評価には、高速T2強調配列(T2w turbo RARE fast spin-echo)9 を用いて、動物が麻酔をかけられる時間を最小限にとどめました。この手順により、同じ動物における病変の経時的な変化を評価することができ、神経保護研究や薬効の試験などに適用する場合に非常に有用です。画像実験は、7T水平動物スキャナーで行われました。解剖学的配列の技術仕様(磁界強度によって異なる場合があります):T2_TurboRARE;22冠状切片;厚さ0.5mm;エコー時間(TE)= 33ミリ秒。繰り返し時間(TR)= 2336.39ミリ秒。フリップ角度、90°;視野 (FOV) = 20 mm x 20mm、マトリックス サイズは 256 x 256 です。 図2A は、再灌流後40分、6時間、24時間、および48時間で評価された、同じマウスにおける病変進展のMR画像の代表的な例を示しています。病変容積の進行は、完了するまでに数時間から約2日かかります。病変体積の定量化は、時間の経過に伴うこの変化を示しています(図2B)。

虚血性侮辱によって引き起こされる神経学的障害を評価するために、さまざまな神経学的尺度が説明されています。以前の論文で広く説明されているニューロスコアテストを使用することをお勧めします。例えば、Orsini et al. (2012)10 によって詳細に報告されているテストが推奨されます。

行動検査は、主に運動機能障害や感覚機能障害の違いを検出するために、多種多様に用意されています。この目的のために、握力試験とコーナー試験が使用されました。握力テストは、運動機能を評価するために使用されます。前肢の筋力は、デジタル力変換器に接続された握力計で測定されます( 材料表を参照)。マウスは両前足で水平バーをつかみ、尻尾をゆっくりと後方に引っ張ります。前足を離す前のグリップの最大強度が記録されます。1匹につき5回の試行を行い、最大値と最小値を除いた上で主値を算出する。コーナーテストは、感覚機能や運動機能の片側性異常を検出するために使用されます。この装置は、30°の角度で取り付けられた2枚のボード(30 cm × 20 cm × 1 cm)と端に小さな開口部があるコーナーで構成されています。マウスは角の半分を向いて配置されます。マウスが角の奥深くに入ると、振動の両側が一緒に刺激されます。次に、マウスは開いた端を向くように向き直ります。動物ごとに合計 10 回の試行が行われ、選択された側が記録されます。生理学的条件下では50%の左右旋回が予想されますが、右MCAoを持つマウスでは右旋回が予想されます。試行は、完全な回転が達成されたとき、またはマウスが頭を90度≥回転させたときに有効と見なされます。結果は、右(同側)ターンの割合として表示されます。

握力試験で測定したtMCAoの24時間後にマウスが示す筋力低下を示す代表的な結果(図3A)と、コーナーテストで刺激されたときに病変部と同側を向く傾向を示す代表的な結果(図3B)が提示されている。手術当日に行動検査を行うと、麻酔と術後期間が近いため、一部のパラメータが変化する可能性があるため、精度が低くなる可能性があります。

図1:頸部の血管樹の模式図(右側)。 (A)画像は、主動脈(総頸動脈-CCA、外頸動脈-ECA、内頸動脈-ICA)と異なる枝(翼口蓋動脈Pt;後頭動脈Occ;上甲状腺動脈St;上顎動脈と舌動脈Max/Lin)。(B)外科的処置の最初のステップでは、CCAを縫合糸で結紮し、ICA循環を血管クランプによって中断し、モノフィラメントをECA を介して 導入します。(C)モノフィラメントを閉塞ゾーンに押し込むためのECAの配向変更。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:代表的なMR画像。 (A)再灌流後の異なる時点での同じマウスのT2-w画像は、急性期における病変の進展を示しています。梗塞の影響を受ける領域は、最初の数時間で急速に増加し、その後はほとんど変化しません。(B)MCAo後の急性期における病変容積の進展。各バーは、病変容積のパーセンテージ(%)の平均±SDを表します。再灌流後の最初の24時間で病変容積が有意に増加します(*p = 0.0182; **p = 0.0088; 一元配置ANOVA/Kruskal-Wallis検定)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:tMCAo(n=16匹)のマウスの飼育前(基礎)と24時間後の行動試験。 (A)握力テストは、マウスあたりの最大(最大)強度を示しています。(B)コーナーテストは、右折の割合(%)を示します。グラフはグループごとのボックスとひげ(最小値から最大値)を示し、ポイントは個々のマウスに対応します(****p < 0.0001;Wilcoxon matched-pairs signed rank test)です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者は利益相反がないことを宣言します。