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方法論記事

機械的に単離されたStromal Vascular画分およびFibrinのヒドロゲルの組合せ:処理のプロトコール

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DOI:

10.3791/65860

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2023年11月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Triemli City Hospital Zurich, 2Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich, 3Institute for Human Tissue Restoration, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

機械的に単離された間質血管画分(SVF)とフィブリンハイドロゲルの組み合わせは、組織工学や創傷治癒目的など、さまざまな適応症で生存脂肪由来の間質細胞の容易で効率的なキャリアを提供します。ここでは、トランスレーショナルリサーチおよび臨床応用のための機械的SVF(mSVF)-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製について紹介します。

要約

脂肪由来間質細胞(ASC)の再生能は、再生研究やトランスレーショナル研究において大きな注目を集めています。これまで、脂肪組織からこれらの細胞を抽出するには、多段階の酵素ベースのプロセスが必要であり、その結果、ACSと他の細胞からなる不均一な細胞ミックスが得られ、これらは総称して間質血管画分(SVF)と呼ばれます。最近導入されたメカニカルSVF(mSVF)分離プロトコルは、時間がかかりにくく、規制上の懸念を回避します。 私たちは最近、乳化と遠心分離の組み合わせに基づいて間質細胞に富むmSVFを生成するプロトコルを提案しました。mSVFの創傷治療アプリケーションにおける現在の課題の1つは、機械的な操作や乾燥から保護する足場がないことです。フィブリンハイドロゲルは、過去に創傷治癒を目的とした細胞導入の有用な補助剤であることが示されています。本書の研究では、トランスレーショナルリサーチと臨床応用のための新しいアプローチとして、mSVF-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製ステップを概説します。

概要

ここ数年で、再生形成外科は形成外科の新たな柱として浮上してきました1。再生形成外科は、患者から採取した可溶性因子、細胞、組織を移植することで、損傷した組織を修復し、低侵襲で組織の修復を促進することを目的としています2。脂肪由来幹細胞(ASC)は、複数の間葉系に分化する能力があることから注目されており、再生医療研究の有望な候補となっています3。そのサイトカインプロファイルは、血管新生作用、免疫抑制作用、および抗酸化作用を示します4。

従来、ASCはコラゲナーゼを用いた酵素的アプローチを用いて脂肪組織から単離され、その結果、間質血管画分(SVF)が得られ、その後、これを培養してASCを取得しました。これらのラボベースの技術は、コストと時間がかかり、さらに重要なことに、厳しい規制制限を受けるため、臨床翻訳が複雑になります5,6,7。対照的に、機械的に分離された間質血管画分(mSVF)プロトコルは、規制問題を回避するだけでなく、汚染リスクを最小限に抑えるという臨床的利点を提供します8,9。

SVFを機械的に単離するための多数のプロトコルが記載されている10。これらの中で、Tonnardらによって発表されたシフトプロトコルは、再生外科医の間で最も注目を集めています11。脂肪吸引物として知られる標準的な脂肪吸引手順で収集された脂肪は、接続装置に取り付けられた2つのハンドヘルドシリンジ間で移動することができ、ナノファットと呼ばれる液体の形になります。これらのmSVF単離プロトコルの明らかな利点には、処理時間の短縮、全体の手順が適切に制御された環境で行われるため、汚染のリスクが最小限に抑えられること、および即時の臨床翻訳が可能であることが含まれます12。

前臨床および臨床上の証拠は、細胞生存率および創傷治癒特性を含むmSVFの特性が、標準的な酵素的単離法に匹敵することを示している12。ラットおよびマウスモデルにおける創傷治癒の促進におけるmSVFの可能性は、ChenらおよびSunらによるin vivo研究を通じて検証されました13,14。しかし、臨床現場での創傷治癒に関する利用可能なデータが不足しています。有望な結果は、研究グループが下肢の開放骨折に露出したインプラントによる傷を負った83歳の患者に自家脂肪移植を行ったときに報告されました15。さらに、Luらは、慢性創傷患者20人のコホートにおいて、mSVFと局所圧閉鎖療法との比較を行った16。その結果、mSVF治療は陰圧閉鎖療法と比較して創傷治癒率が高いことが明らかになりました16。言及された両方の研究は、mSVF単独またはゲルと組み合わせて標的創傷領域に注入した15,16。

実際のシナリオでは、レシピエント部位での吸収率が予測できないため、mSVFの臨床応用は限られています17,18。足場は、細胞の保持、血管新生、および周囲の組織19,20,21への統合を支援するため、この問題に対する救済を約束します。フィブリンハイドロゲルは、外科分野で一般的に使用されるFDA承認のツールであり、mSVF19の効果的なキャリアであることが示されています。フィブリンゲルは、細胞キャリアとして機能する上でいくつかの利点を提供する生体高分子材料である:それは優れた生体適合性を示し、細胞の付着を促進し、そして制御可能な方法で分解することができる22,24,25。さらに、それは最小限の炎症反応および異物反応を示し、創傷治癒の自然な過程22の間に容易に吸収される。私たちは、前述のmSVF細胞の多様な再生能力とフィブリンハイドロゲルとの有利な組み合わせにより、創傷治癒プロセスを強化するための革新的なアプローチを提供できると考えています。全体として、このアプローチにより、生存可能なmSVF細胞の効率的な局所送達が可能になります。ここでは、mSVFとフィブリンハイドロゲルを組み合わせた、創傷治癒目的への適用を目的としたプロトコールを紹介します。

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プロトコル

この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべての成人ドナーは、収集した組織サンプルのさらなる使用を許可するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。このプロトコルは、当機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1.脂肪組織の採取

  1. 以前の出版物26,27に記載されている従来の脂肪採取技術で標準的な脂肪吸引を行うことにより、脂肪組織を採取します。通常のリンガー乳酸とエピネフリンを1:200,000の比率で構成したチューメセントソリューションを使用してください。
  2. 4mmの吸引カニューレを使用して、負圧と振動下で滅菌バッグに脂肪吸引を行います。採取した脂肪をすぐに実験室に移します。

2. mSVFアイソレーション

  1. 細胞培養フードで次の手順(セクション 2 および 3)を実行し、無菌作業領域を確保します。生物学的安全性レベル2を確保するために、通常の白衣と手袋を着用してください。
  2. 培地の準備:500 mLの高グルコースDulbecco's Modified Eagles's Medium(DMEM)に50 mLのウシ胎児血清(FBS)、5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンを補給します。
  3. 脂肪吸引液を50mLの遠心チューブに移します。
  4. 脂肪吸引液を滅菌済みの20 mLルアーロックシリンジに移し、1.4 mmコネクタを取り付けます。シリンジ内に空気が入っていないことを確認してください。
  5. 2 つ目の 20 mL ルアーロックシリンジを 1.4 mm コネクタの反対側に取り付けます。
  6. 脂肪組織を一方のシリンジからもう一方のシリンジに合計30回押します。
  7. 乳化した脂肪を新鮮な50mLの遠心チューブに移します。
  8. 乳化した脂肪を500 x g で10分間遠心分離します。
  9. 遠心分離後、油性の最上層を廃棄します。次に、中央に精製されたmSV層を収集します。それを新しい50 mL遠心分離チューブに移し、水相を廃棄します。
  10. 遠心チューブに培地(ステップ2.2)を40 mLマークまで満たします。
  11. 遠心分離機にチューブを入れ、もう一度500 x gで5分間遠心分離します。
  12. 得られたmSVF層を回収し、新しい50 mL遠心チューブに移します。

3. mSVF-フィブリンハイドロゲルの作製

  1. 100 μL の mSVF と 10 μL のトロンビン (100 U/mL)、10 μL の CaCl2 (80 mM)、および 70 μL のトラネキサム酸 (100 mg/mL) を滅菌済みの 1.5 mL チューブに混合します。
  2. 新しいピペットチップを使用して、適用の直前に最後の成分として10 μLのフィブリノーゲン(100 mg/mL)を追加します。ヒドロゲル重合は約10〜30秒以内に観察されることに注意してください。
  3. 臨床応用のためには、この最後のステップを局所投与の直前、できればベッドサイドで行ってください。分析目的では、ピペッティングにより12ウェルプレートに移します。

4. 生存率アッセイと組織学

  1. ステップ3.3のmSVF-ヒドロゲル混合物200μLを12ウェルプレートの1ウェルにピペットで移します。
  2. mSVFコレクション(ステップ2.12.)の100μLを1つのウェルにピペットで注入し、ポジティブコントロールとして使用します。
  3. 200 μLのフィブリンハイドロゲルを1つのウェルのみにピペットで注入し、ネガティブコントロールとして使用します。
  4. 12ウェルプレートを通常のインキュベーターに37°C、5%CO2 で30分間置く。
  5. この時間の後、各ウェルに1 mLのレサズリン(アラマーブルー、10%濃度、培地で希釈)を加えます。
  6. 添加後、12ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートします。
  7. 24時間後、励起波長555 nmおよび発光波長596 nmのセルイメージングマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、最初の蛍光強度を測定します。
  8. 3日目と7日目に連続して蛍光強度測定を行います。
  9. 組織学的評価が必要な場合は、1日目、3日目、7日目に実験を中止し、フィブリンハイドロゲルを4%パラホルムアルデヒドに4°Cで24時間固定します。固定後、1%リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、4°Cで保存します。
  10. ハイドロゲルを最適な切断温度(OCT)コンパウンドに埋め込み、クライオスタットで厚さ10 μmの凍結ブロックを切片化します。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)溶液で切片を標準プロトコル28に従って染色します。

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結果

レサズリンアッセイ
まず、mSVF細胞の in vitro 細胞生存率を調べました。この目的のために、0日目、3日目、7日目にレサズリン細胞生存率アッセイを実施しました。合計4つのサンプルのうち、0日目、3日目、7日目の細胞生存率を 図1に示します。0 日目の値はベースラインとして機能し、100% に設定されました。3日目には、ポジティブコントロール(mSVF)は78.92%(±5.33%)とわずかに減少しましたが、mSVF-フィブリンハイドロゲルの組み合わせは96.48%(±1.89%)にとどまりました。7日目にも同様の傾向が見られ、mSVFは77.46%(±3.90%)を測定し、mSVFとフィブリンハイドロゲルの組み合わせは109.02%(±8.92%)で一定にとどまりました。対応のないt検定で3日目と7日目に得られた両方の値をウェルチ補正と比較したところ、統計的に有意な差は認められませんでした(p ≥ 0.05)。

組織学

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ディスカッション

SVFの機械的単離は、従来の酵素アプローチに代わるエレガントな選択肢を提供し、臨床応用のための幅広いアクセスを提供します29。実際、mSVFは、本稿で提案されているように、瘢痕の軟部組織治療または美容処置の補助としてすでに臨床使用されています30。ここで紹介するプロトコールは、生存可能なmSVF細胞を効率的に局所導入するための簡単な方法を提供します。mSVF細胞のみのポジティブコントロールでは、7日後に吸収値が減少する傾向が示されましたが、mSVF-フィブリンハイドロゲルの組み合わせでは安定した値が測定されました。統計的に有意ではないが、観察された傾向は依然として重要な知見である。また、組織学データでは、7日間の培養期間にわたって染色された細胞の数が一定であることが示され、提示されたアプローチの細胞適合性が実証されました。フィブリンハイドロゲルの分解は最小限であり、3日目と7日目の合計サイズは1日目と比較して変化しませんでした。 In vitroでは、トラネ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

Bong-Sung Kimは、ドイツ研究財団(KI 1973/2-1)およびノバルティス医学生物学研究財団(#22A046)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12-ウェルプレートSarstedt83.3921
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)BiochemicaA1001.0010
50 mL-FalconFalcon352070
吸収性タオル、2パックハリヤード89701
アラマーブルー 25 mLInvitrogenDAL1025
Albumin, Bovine (BSA)VWR0332-500G
Biotek Cytation 5 AgilentCell Imagingマルチモードマイクロプレートリーダー 
CaCl<サブ>2 Sigma-AldrichC5670-500G
Cryostat Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose, with L-Glutamine, with sodium pyruvateVWR392-0416
DPBSGibco14190-144
EpinephrinSigma-AldrichE4250
Fetal Bovine SerumBiowestS181H-500
フィブリノーゲンの人間の血漿100 mgSigma-Aldrich341576-100MG
のホルマリンのフィッシャー科学SF100-4
ホルマリン4%Formafix1308069
FSC 22-Einbettmedium、blauBiosystems3801481S
のヘマトキシリン及びエオシン溶液Sigma-AldrichH3136 / HT110132
Lactated Ringer's 溶液 1000 mLB BraunR5410-01
メルセデス カニューレ 4mmMicroAirePAL-R404LL
NaCl 0.9%Bbraun570160
OCT 埋め込みマトリックス 125 mLCellPathKMA-0100-00A
パラホルムアルデヒドフィッシャー サイエンティフィ10342243
PBS 1%Sigma-AldrichP4474
PenStrepSigma-AldrichP4333-100ML
Petridish 150mmSarstedt83.1803
Phalloidin-iFluor 488 試薬Abcamab176753
滅菌シリンジ 20 mL ルアーHENKE-JECT5200-000V0
滅菌シリンジ 30 mL ルアーロックBD10521
ヒト血漿由来トロンビンSigma-AldrichT6884-100UN
トラネキサム酸オルファ スイス6837093
チューリップフィルター 1.2レンシオン サージカルATLLLL
チューリップフィルター 1.4レンシオン サージカルATLLLL
のック

参考文献

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