機械的に単離された間質血管画分(SVF)とフィブリンハイドロゲルの組み合わせは、組織工学や創傷治癒目的など、さまざまな適応症で生存脂肪由来の間質細胞の容易で効率的なキャリアを提供します。ここでは、トランスレーショナルリサーチおよび臨床応用のための機械的SVF(mSVF)-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製について紹介します。
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方法論記事
機械的に単離されたStromal Vascular画分およびFibrinのヒドロゲルの組合せ:処理のプロトコール
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
脂肪由来間質細胞(ASC)の再生能は、再生研究やトランスレーショナル研究において大きな注目を集めています。これまで、脂肪組織からこれらの細胞を抽出するには、多段階の酵素ベースのプロセスが必要であり、その結果、ACSと他の細胞からなる不均一な細胞ミックスが得られ、これらは総称して間質血管画分(SVF)と呼ばれます。最近導入されたメカニカルSVF(mSVF)分離プロトコルは、時間がかかりにくく、規制上の懸念を回避します。 私たちは最近、乳化と遠心分離の組み合わせに基づいて間質細胞に富むmSVFを生成するプロトコルを提案しました。mSVFの創傷治療アプリケーションにおける現在の課題の1つは、機械的な操作や乾燥から保護する足場がないことです。フィブリンハイドロゲルは、過去に創傷治癒を目的とした細胞導入の有用な補助剤であることが示されています。本書の研究では、トランスレーショナルリサーチと臨床応用のための新しいアプローチとして、mSVF-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製ステップを概説します。
概要
ここ数年で、再生形成外科は形成外科の新たな柱として浮上してきました1。再生形成外科は、患者から採取した可溶性因子、細胞、組織を移植することで、損傷した組織を修復し、低侵襲で組織の修復を促進することを目的としています2。脂肪由来幹細胞(ASC)は、複数の間葉系に分化する能力があることから注目されており、再生医療研究の有望な候補となっています3。そのサイトカインプロファイルは、血管新生作用、免疫抑制作用、および抗酸化作用を示します4。
従来、ASCはコラゲナーゼを用いた酵素的アプローチを用いて脂肪組織から単離され、その結果、間質血管画分(SVF)が得られ、その後、これを培養してASCを取得しました。これらのラボベースの技術は、コストと時間がかかり、さらに重要なことに、厳しい規制制限を受けるため、臨床翻訳が複雑になります5,6,7。対照的に、機械的に分離された間質血管画分(mSVF)プロトコルは、規....
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プロトコル
この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべての成人ドナーは、収集した組織サンプルのさらなる使用を許可するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。このプロトコルは、当機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っています。
1.脂肪組織の採取
- 以前の出版物26,27に記載されている従来の脂肪採取技術で標準的な脂肪吸引を行うことにより、脂肪組織を採取します。通常のリンガー乳酸とエピネフリンを1:200,000の比率で構成したチューメセントソリューションを使用してください。
- 4mmの吸引カニューレを使用して、負圧と振動下で滅菌バッグに脂肪吸引を行います。採取した脂肪をすぐに実験室に移します。
2. mSVFアイソレーション
- 細胞培養フードで次の手順(セクション 2 および 3)を実行し、無菌作業領域を確保します。生物学的安全性レベル2を確保するために、通常の白衣と手袋を着用してください。
- 培地の準備:500 mLの高グルコースDulbecco's Modifie....
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結果
レサズリンアッセイ
まず、mSVF細胞の in vitro 細胞生存率を調べました。この目的のために、0日目、3日目、7日目にレサズリン細胞生存率アッセイを実施しました。合計4つのサンプルのうち、0日目、3日目、7日目の細胞生存率を 図1に示します。0 日目の値はベースラインとして機能し、100% に設定されました。3日目には、ポジティブコントロール(mSVF)は78.92%(±5.33%)とわずかに減少しましたが、mSVF-フィブリンハイドロゲルの組み合わせは96.48%(±1.89%)にとどまりました。7日目にも同様の傾向が見られ、mSVFは77.46%(±3.90%)を測定し、mSVFとフィブリンハイドロゲルの組み合わせは109.02%(±8.92%)で一定にとどまりました。対応のないt検定で3日目と7日目に得られた両方の値をウェルチ補正と比較したところ、統計的に有意な差は認められませんでした(p ≥ 0.05)。
組織学
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ディスカッション
SVFの機械的単離は、従来の酵素アプローチに代わるエレガントな選択肢を提供し、臨床応用のための幅広いアクセスを提供します29。実際、mSVFは、本稿で提案されているように、瘢痕の軟部組織治療または美容処置の補助としてすでに臨床使用されています30。ここで紹介するプロトコールは、生存可能なmSVF細胞を効率的に局所導入するための簡単な方法を提供します。mSVF細胞のみのポジティブコントロールでは、7日後に吸収値が減少する傾向が示されましたが、mSVF-フィブリンハイドロゲルの組み合わせでは安定した値が測定されました。統計的に有意ではないが、観察された傾向は依然として重要な知見である。また、組織学データでは、7日間の培養期間にわたって染色された細胞の数が一定であることが示され、提示されたアプローチの細胞適合性が実証されました。フィブリンハイドロゲルの分解は最小限であり、3日目と7日目の合計サイズは1日目と比較して変化しませんでした。 In vitroでは、トラネ.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
Bong-Sung Kimは、ドイツ研究財団(KI 1973/2-1)およびノバルティス医学生物学研究財団(#22A046)の支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 12-ウェルプレート | Sarstedt | 83.3921 | |
| 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) | Biochemica | A1001.0010 | |
| 50 mL-Falcon | Falcon | 352070 | |
| 吸収性タオル、2パック | ハリヤード | 89701 | |
| アラマーブルー 25 mL | Invitrogen | DAL1025 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-500G | |
| Biotek Cytation 5 | Agilent | Cell Imagingマルチモードマイクロプレートリーダー | |
| CaCl<サブ>2 | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Cryostat Microtome | |||
| DMEM with 4,5 g/L glucose, with L-Glutamine, with sodium pyruvate | VWR | 392-0416 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich | E4250 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S181H-500 | |
| フィブリノーゲンの人間の血漿100 mg | Sigma-Aldrich | 341576-100MG | |
| のホルマリン | のフィッシャー科学 | SF100-4 | |
| ホルマリン4% | Formafix | 1308069 | |
| FSC 22-Einbettmedium、blau | Biosystems | 3801481S | |
| のヘマトキシリン及びエオシン溶液 | Sigma-Aldrich | H3136 / HT110132 | |
| Lactated Ringer's 溶液 1000 mL | B Braun | R5410-01 | |
| メルセデス カニューレ 4mm | MicroAire | PAL-R404LL | |
| NaCl 0.9% | Bbraun | 570160 | |
| OCT 埋め込みマトリックス 125 mL | CellPath | KMA-0100-00A | |
| パラホルムアルデヒド | フィッシャー サイエンティフィ | 10342243 | |
| PBS 1% | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| PenStrep | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Petridish 150mm | Sarstedt | 83.1803 | |
| Phalloidin-iFluor 488 試薬 | Abcam | ab176753 | |
| 滅菌シリンジ 20 mL ルアー | HENKE-JECT | 5200-000V0 | |
| 滅菌シリンジ 30 mL ルアーロック | BD | 10521 | |
| ヒト血漿 | 由来トロンビンSigma-Aldrich | T6884-100UN | |
| トラネキサム酸 | オルファ スイス | 6837093 | |
| チューリップフィルター 1.2 | レンシオン サージカル | ATLLLL | |
| チューリップフィルター 1.4 | レンシオン サージカル | ATLLLL |
参考文献
- Daar, A. S., Greenwood, H. L. A proposed definition of regenerative medicine. J Tissue Eng Regen Med. 1 (3), 179-184 (2007).
- Machens, H. G., Mailänder, P. Regenerative medicine and plastic surgery. Chirurg. 76 (5), 474-480 (2005).
- Zuk, P. A., et al.
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再版と許可
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