このプロトコルは、閉経前または閉経後のヒト膣組織から一次線維芽細胞を単離するための信頼性と効果的な技術を示しています。膣線維芽細胞単離の既存のプロトコルでは、老化組織からの細胞単離の課題は考慮されていません。膣組織は、骨盤臓器脱手術後の女性から採取されました。
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この記事について
サマリー
要約
骨盤臓器脱は、女性の生活の質に深刻な影響を与える障害です。これは、筋肉や靭帯が弱くなり、骨盤内臓器が骨盤内で下がり、膣内に膨らみが生じるときに発生します。骨盤臓器脱を矯正する手術は、これまで主力の治療法でした。近年、脱出症患者の組織組成を細胞レベルで研究することへの関心が高まっています。
現在、ドナーまたは患者の年齢が細胞ベースの治療に及ぼす影響については、ほとんどコンセンサスが得られていません。膣線維芽細胞の分離に関する現在公開されているプロトコルは、閉経前の組織に集中しているか、ドナー組織の年齢についてコメントすることを怠っています。既存のプロトコルのほとんどは動物モデルを使用しています。人間の膣組織の一貫性は、ほとんどのプロトコルで使用される組織よりも密度が高いです。この研究では、ヒトの膣組織は主に高齢のドナーから採取され、これが既存のプロトコルの失敗の一因となった可能性があります。
この研究の目的は、ドナーの年齢や閉経状態に関係なく、ヒト膣線維芽細胞を確実に取得するための標準的なプロトコルを説明することです。結果は、骨盤臓器脱手術を受けた9人の別々のドナーからの組織を使用して再現されました。6人の患者が閉経後であり、最高齢のドナーは78歳でした。組織ドナーの年齢の中央値は59歳でした。
ここでは、酵素的および機械的解離と、単一ドナーからの複数の膣生検の細胞懸濁液プーリングの組み合わせを使用して、線維芽細胞が豊富な単一細胞懸濁液を生成するための信頼性の高い方法について説明します。ヒト膣原発性線維芽細胞の信頼性の高い単離は、骨盤臓器脱やマイクロバイオームと宿主の相互作用の研究に役立つ可能性があります。
概要
科学と研究におけるジェンダー格差は、現在進行中の問題です。主に女性の性別の人々に影響を与える障害に関する研究は資金不足です1。骨盤臓器脱は、女性の性別と強く関連している障害です。これは、筋肉や靭帯が弱くなり、骨盤内臓器が骨盤内で下がり、膣内に膨らみができるときに発生します2。この病態生理学の文脈での細胞相互作用についてはほとんど知られていません、また、組織レベルの要因が外科的介入の成功にどのように影響するか3。
細胞株ではなく初代細胞は、トランスレーショナル臨床研究において、より生理学的な関連性を提供する上で不可欠であると広く認識されています4。初代細胞は、目的の体組織から直接採取され、 より正確にはin vivo の生理機能を模倣することができます。ヒトの膣から初代線維芽細胞を単離することは、年齢や閉経状態などの主要なドナー特性を考慮して、骨盤臓器脱の生物学的メカニズムや疾患モデリングの研究に役立つ可能性があります。
骨盤臓器脱は、一般的に高齢者または閉経後の個人に影響を及ぼします。この疾患の研究における初代線維芽細胞の単離と増殖は、高齢のドナーによる細胞集団の減少とクローン形成能力のために困難である5。私たちの経験では、膣組織の解離に前述のプロトコルを使用しても、標準的な 1 cm2 組織生検から線維芽細胞を抽出できませんでした。
文献レビューを通じて、同様の研究がマウス6などの動物モデルとヒトモデル7,8の2つのグループに細分されていることがわかりました。マウスのプロトコルに従うと、ヒト膣組織の組織処理にハサミを使用すると、機械的消化が不十分でした。マウス組織および他の組織部位9を用いたプロトコールの外挿は成功しなかった。
ヒトの膣サンプルを使用したほとんどの論文は、骨盤臓器脱の閉経前の個人の組織を利用していました7,10。閉経前と閉経後の両方の個人からのサンプルの使用を報告した論文は数件あったが11、高齢または閉経後のドナーから線維芽細胞を成功裏に分離するために使用されたプロトコルについて十分に詳細に説明していなかった。閉経後組織からの線維芽細胞を用いた単離と疾患モデリングは、骨盤臓器脱の細胞病態生理を理解するために不可欠である可能性があります。これは、この状態が閉経後の10年間で個人で最も有病率が高いためです12。
我々は、機械的解離と酵素的解離の組み合わせを用いて、ヒト膣組織から線維芽細胞が豊富な単一細胞懸濁液を単離および培養する方法について述べる。この記事では、閉経後または老化したヒト膣線維芽細胞を取得する方法に関する信頼性の高いプロトコルについて説明します。単離された細胞は、ビメンチン、F-アクチン、およびα-平滑筋アクチン(α-SMA)の発現を評価するための位相差顕微鏡および免疫蛍光法(IF)を用いた形態学的検査により、線維芽細胞であることが確認されました。
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プロトコル
膣組織は、骨盤臓器脱手術を受けた女性から採取しました。手術後に収集された膣組織は老廃物と見なされ、そうでなければ廃棄されます。この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施され、マサチューセッツ州ジェネラルブリガムの機関審査委員会によって承認されました。
1.患者からの膣組織採取
- 病歴を取り、骨盤検査の結果を使用して骨盤臓器脱を診断する:クリニックで骨盤臓器脱定量化(POP-Q)測定値が得られ、骨盤臓器脱の証拠が示されました。
- 次の選択基準を使用してください: 18 歳以上;症候性骨盤臓器脱の病歴;骨盤臓器脱の外科的矯正を選択します。
- 以下を除外します:妊娠中の女性と組織の提供を拒否する患者。
- 骨盤臓器脱手術の必要なステップとして、余分な膣組織をトリミングします。この膣上皮は、次の手術の後、全厚で切除されます:前部膣、後部膣、および膣柱状出血。
- 通常の生理食塩水または無血清のDMEM/F12(Gibco)培地を入れた滅菌検体採取カップで組織をラボに輸送します。氷の上を保ってください。
2.組織の処理と消化
- ティッシュの準備
- 膣上皮の全厚さを包含するように組織を測定して切断し、約1 cm2のセグメントを作成します。
- 生検サイズ1cm2の正確な測定を保証します。
注:組織生検のサイズを過大評価すると、組織の消化が損なわれる可能性があります。 - 単一のドナーからそれぞれ 1 cm2 の 2 〜 3 回の膣生検を追加で準備し、生検を脇に置きます。
- 機械的分解
- 膣生検を10cmの細胞培養シャーレに入れます。ピペット500-1,000μLの無血清培地に100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、2.5μg / mLのアムホテリシンBontoを補充して、組織が乾燥するのを防ぎます。
- 膣組織を両手で2つの滅菌メス(No.11またはNo.15)を使用して小さな断片に刻みます。
- ブレードの先端が組織の表面に対して垂直になっていることを確認します。2つのメスを使用して、組織表面に均等で安定した圧力をかけます。交互に引っ張る動作を実行して、組織を非常に小さな断片に切断します。
- サンプルが1〜2 mmのピースと均一な一貫性になるまで、2メス技術を使用してこのミンチ技術を繰り返します。
注:この2メス技術による1cm2 生検を使用した機械的消化は、完了するまでに約15〜20分かかります。 - 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μg/mL アムホテリシン B を添加した 2-3 mL の無血清 DMEM/F12 培地をプレートに加え、ミンチ組織を懸濁します。組織片を含む溶液を上下にピペットで動かし、塊をバラバラにします。
- 酵素消化
- 組織片を含む溶液を15mLのコニカルチューブに移します。無血清のDMEM/F12培地を、膣組織をミンチにした組織培養皿に加え、残っている組織片を回収します。組織片を含む溶液を円錐管に移します。無血清DMEM/F12培地を、総容量が10 mLになるまで追加します。
- 5 mgのリベラーゼを1 mLの滅菌水(5 mg / mL)に溶解します。.230 μLのアリコートを-20°Cで最大1ヶ月間、または-80°Cで6ヶ月間保存してください。
- 230 μLのリベラーゼ(ストック13 U/mL)をチューブに加え、最終濃度は0.3 U/mLです。
注: Liberase のアクティビティはバッチによって異なる場合があります。使用直前にウォーターバスを使用して各アリコートを解凍します。凍結と解凍の繰り返しは避けてください。 - 同じドナーの2〜3回の追加膣生検について、手順2.1〜2.3を繰り返します。
注:1回の生検からの組織片を含む各溶液を別々の円錐形のチューブに保管してください。たとえば、4本のチューブで4回の膣生検を行います。これは、遠心分離後の最適な細胞ペレット化に重要です。 - サンプルミキサーを使用して、チューブを37°Cで3時間インキュベートし、絶えず激しく攪拌します。
- サンプルミキサーをCO2 インキュベーターに入れます。一定の攪拌を維持します。(サンプルミキサーの設定:25rpmの回転運動で5秒間、30°の逆方向(傾斜回転)で5秒間、2°の振動(ボルテックス)運動で3秒間)。
- インキュベーション中に、チューブを30分間隔でボルテックスします。
- サンプルを3,000 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、廃棄します。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μg/mLアムホテリシンBを含む1-2 mLのDMEM/F12培地にペレットを再懸濁し、リベラーゼ酵素を希釈します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、激しくピペットで動かします。
3. 細胞培養
- 未消化組織片の除去
- 100 μmのセルストレーナーを滅菌済みの50 mLコニカルコンテナの上に置きます。
- 同じドナーの複数の組織生検から得られた細胞懸濁液をプールします。
- 組織/酵素懸濁液を濾し、5mLシリンジプランジャーで押し込みます。残りの組織片が完全に押し込まれているように見えるまで、この手順を繰り返します。
注:ストレーナーを介して完全に機能していない膣組織の断片からの粘液がいくつかある可能性があります。粘液をセルストレーナーで捨てます。
- 細胞培養プーリング
- 複数の膣生検(同じドナーから)からの細胞懸濁液をペトリ皿(60 mm x 15 mm)にプレートします。
- ペトリ皿をCO2 インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
- 非接着性細胞の存在を位相差顕微鏡で観察し、確認します。
- 顕微鏡の焦点がプレートの底にあることを確認します。
注:手前には多くの免疫細胞が存在する可能性があります。プレートの底に付着する線維芽細胞の数は少なくなります。 - 細胞培養培地を交換する前に18〜24時間待ってから、適切な細胞接着を確保してください。
- 80%のコンフルエントが発生するまで、3日ごとに培地を交換します。細胞が80〜90%のコンフルエントに達したら、より大きなフラスコに拡張するか、将来の使用のために細胞のアリコートを凍結します。
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結果
膣組織は、骨盤臓器脱手術を受けた10人の独立したドナーから採取されました。記載されたプロトコルを用いて、細胞をヒト膣組織から単離した。細胞集団は、細長い、平らで、紡錘形の外観を特徴としていました。他の研究と同様に、ドナーの年齢が上がるにつれて、線維芽細胞の細胞倍加能力が有意に遅くなり、クローン形成能力が低下することが観察されました。これらの違いは、高齢者(75〜78歳)から単離された線維芽細胞と若年者(35〜47歳)から単離された線維芽細胞を比較すると顕著でした。中年のドナーからの細胞は、中程度のプロファイル(56〜61歳)を示しました。細胞増殖速度は、最初に、同じ既知の播種密度の位相差顕微鏡を用いた直接可視化によって推定されました。
図 1: プロトコル...
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ディスカッション
これまでの多くの研究で、ヒトの膣から初代線維芽細胞を単離する方法が報告されている3,7。いくつかの研究では、骨盤臓器脱のある閉経前の個人のヒト膣組織を使用した。閉経前および閉経後の個人からの組織の使用を報告した論文はいくつかあるが7,11、彼らは、高齢または閉経後のドナーから線維芽細胞を成功裏に分離するために使用されたプロトコルを十分に詳細に説明していなかった。膣壁は、性器脱のある閉経後の女性の方が閉経前の女性よりも厚く、この集団における隔離の困難さを増している理由を説明しているのかもしれない13。骨盤底障害は閉経後またはそれ以上の年齢層で最も一般的であるため、疾患のモデリングと調査には、閉経後のドナーからの隔離を成功させることが不可欠です。
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開示事項
開示すべき利益相反はありません。
謝辞
マサチューセッツ総合病院のヴィンセント生殖生物学センターのすべてのメンバーと、VIncent Memorial Hospital Foundationの寛大な支援に感謝の意を表したいと思います。Bo Rueda博士と彼の研究室には、貴重な提案と実験装置の貸し出しに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アムホテリシン B | バイオテクネ | B23192 | |
| セルストレーナー (100 μm) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 22363549 | |
| コニカル遠心チューブ(15 mL) | フィッシャーサイエンティフィック | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 11320033 | |
| フェザー ディスポーザブルメス No. 15 | ソコレックス | FB.15 | |
| シ胎児血清 | シグマ アルドリッチ | NC1983075 | |
| 高透明度円錐形遠心チューブ (50 mL) | フィッシャーサイエンティフィック | 14-432-22 | |
| HulaMixer サンプルミキサー | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Human Fibronectin DuoSet ELISA | R&Dシステム | DY1918-05 | |
| ヒトプロコラーゲン I α 1 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY6220-05 | |
| リベラーゼ研究用グレード | Σ | Aldrich 05 401 119 001 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン (5000U/ml) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 15070063 | |
| シャーレ、ポリスチレン (100 mm x 20 mm) | ミリポア | Σ P5606 | |
| 血清学的ピペット (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| 滅菌シリンジ(5mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
参考文献
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