ヒト膣からの初代線維芽細胞の組織プロセシングと単離

Summary

このプロトコルは、閉経前または閉経後のヒト膣組織から一次線維芽細胞を単離するための信頼性と効果的な技術を示しています。膣線維芽細胞単離の既存のプロトコルでは、老化組織からの細胞単離の課題は考慮されていません。膣組織は、骨盤臓器脱手術後の女性から採取されました。

Abstract

骨盤臓器脱は、女性の生活の質に深刻な影響を与える障害です。これは、筋肉や靭帯が弱くなり、骨盤内臓器が骨盤内で下がり、膣内に膨らみが生じるときに発生します。骨盤臓器脱を矯正する手術は、これまで主力の治療法でした。近年、脱出症患者の組織組成を細胞レベルで研究することへの関心が高まっています。

現在、ドナーまたは患者の年齢が細胞ベースの治療に及ぼす影響については、ほとんどコンセンサスが得られていません。膣線維芽細胞の分離に関する現在公開されているプロトコルは、閉経前の組織に集中しているか、ドナー組織の年齢についてコメントすることを怠っています。既存のプロトコルのほとんどは動物モデルを使用しています。人間の膣組織の一貫性は、ほとんどのプロトコルで使用される組織よりも密度が高いです。この研究では、ヒトの膣組織は主に高齢のドナーから採取され、これが既存のプロトコルの失敗の一因となった可能性があります。

この研究の目的は、ドナーの年齢や閉経状態に関係なく、ヒト膣線維芽細胞を確実に取得するための標準的なプロトコルを説明することです。結果は、骨盤臓器脱手術を受けた9人の別々のドナーからの組織を使用して再現されました。6人の患者が閉経後であり、最高齢のドナーは78歳でした。組織ドナーの年齢の中央値は59歳でした。

ここでは、酵素的および機械的解離と、単一ドナーからの複数の膣生検の細胞懸濁液プーリングの組み合わせを使用して、線維芽細胞が豊富な単一細胞懸濁液を生成するための信頼性の高い方法について説明します。ヒト膣原発性線維芽細胞の信頼性の高い単離は、骨盤臓器脱やマイクロバイオームと宿主の相互作用の研究に役立つ可能性があります。

Introduction

科学と研究におけるジェンダー格差は、現在進行中の問題です。主に女性の性別の人々に影響を与える障害に関する研究は資金不足です¹。骨盤臓器脱は、女性の性別と強く関連している障害です。これは、筋肉や靭帯が弱くなり、骨盤内臓器が骨盤内で下がり、膣内に膨らみができるときに発生します²。この病態生理学の文脈での細胞相互作用についてはほとんど知られていません^、また、組織レベルの要因が外科的介入の成功にどのように影響するか3。

細胞株ではなく初代細胞は、トランスレーショナル臨床研究において、より生理学的な関連性を提供する上で不可欠であると広く認識されています⁴。初代細胞は、目的の体組織から直接採取され、 より正確にはin vivo の生理機能を模倣することができます。ヒトの膣から初代線維芽細胞を単離することは、年齢や閉経状態などの主要なドナー特性を考慮して、骨盤臓器脱の生物学的メカニズムや疾患モデリングの研究に役立つ可能性があります。

骨盤臓器脱は、一般的に高齢者または閉経後の個人に影響を及ぼします。この疾患の研究における初代線維芽細胞の単離と増殖は、高齢のドナーによる細胞集団の減少とクローン形成能力のために困難である⁵。私たちの経験では、膣組織の解離に前述のプロトコルを使用しても、標準的な 1 cm² 組織生検から線維芽細胞を抽出できませんでした。

文献レビューを通じて、同様の研究がマウス⁶などの動物モデルとヒトモデル^7,8の2つのグループに細分されていることがわかりました。マウスのプロトコルに従うと、ヒト膣組織の組織処理にハサミを使用すると、機械的消化が不十分でした。マウス組織および他の組織部位⁹を用いたプロトコールの外挿は成功しなかった。

ヒトの膣サンプルを使用したほとんどの論文は、骨盤臓器脱の閉経前の個人の組織を利用していました^7,10。閉経前と閉経後の両方の個人からのサンプルの使用を報告した論文は数件あったが¹¹、高齢または閉経後のドナーから線維芽細胞を成功裏に分離するために使用されたプロトコルについて十分に詳細に説明していなかった。閉経後組織からの線維芽細胞を用いた単離と疾患モデリングは、骨盤臓器脱の細胞病態生理を理解するために不可欠である可能性があります。これは、この状態が閉経後の10年間で個人で最も有病率が高いためです¹²。

我々は、機械的解離と酵素的解離の組み合わせを用いて、ヒト膣組織から線維芽細胞が豊富な単一細胞懸濁液を単離および培養する方法について述べる。この記事では、閉経後または老化したヒト膣線維芽細胞を取得する方法に関する信頼性の高いプロトコルについて説明します。単離された細胞は、ビメンチン、F-アクチン、およびα-平滑筋アクチン(α-SMA)の発現を評価するための位相差顕微鏡および免疫蛍光法(IF)を用いた形態学的検査により、線維芽細胞であることが確認されました。

Protocol

膣組織は、骨盤臓器脱手術を受けた女性から採取しました。手術後に収集された膣組織は老廃物と見なされ、そうでなければ廃棄されます。この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施され、マサチューセッツ州ジェネラルブリガムの機関審査委員会によって承認されました。

1.患者からの膣組織採取

1. 病歴を取り、骨盤検査の結果を使用して骨盤臓器脱を診断する:クリニックで骨盤臓器脱定量化(POP-Q)測定値が得られ、骨盤臓器脱の証拠が示されました。
2. 次の選択基準を使用してください: 18 歳以上;症候性骨盤臓器脱の病歴;骨盤臓器脱の外科的矯正を選択します。
3. 以下を除外します:妊娠中の女性と組織の提供を拒否する患者。
4. 骨盤臓器脱手術の必要なステップとして、余分な膣組織をトリミングします。この膣上皮は、次の手術の後、全厚で切除されます:前部膣、後部膣、および膣柱状出血。
5. 通常の生理食塩水または無血清のDMEM/F12(Gibco)培地を入れた滅菌検体採取カップで組織をラボに輸送します。氷の上を保ってください。

2.組織の処理と消化

1. ティッシュの準備
   1. 膣上皮の全厚さを包含するように組織を測定して切断し、約1 cm²のセグメントを作成します。
   2. 生検サイズ^1cm2の正確な測定を保証します。
      注:組織生検のサイズを過大評価すると、組織の消化が損なわれる可能性があります。
   3. 単一のドナーからそれぞれ 1 cm² の 2 〜 3 回の膣生検を追加で準備し、生検を脇に置きます。
2. 機械的分解
   1. 膣生検を10cmの細胞培養シャーレに入れます。ピペット500-1,000μLの無血清培地に100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、2.5μg / mLのアムホテリシンBontoを補充して、組織が乾燥するのを防ぎます。
   2. 膣組織を両手で2つの滅菌メス(No.11またはNo.15)を使用して小さな断片に刻みます。
   3. ブレードの先端が組織の表面に対して垂直になっていることを確認します。2つのメスを使用して、組織表面に均等で安定した圧力をかけます。交互に引っ張る動作を実行して、組織を非常に小さな断片に切断します。
   4. サンプルが1〜2 mmのピースと均一な一貫性になるまで、2メス技術を使用してこのミンチ技術を繰り返します。
      注:この2メス技術による1cm² 生検を使用した機械的消化は、完了するまでに約15〜20分かかります。
   5. 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μg/mL アムホテリシン B を添加した 2-3 mL の無血清 DMEM/F12 培地をプレートに加え、ミンチ組織を懸濁します。組織片を含む溶液を上下にピペットで動かし、塊をバラバラにします。
3. 酵素消化
   1. 組織片を含む溶液を15mLのコニカルチューブに移します。無血清のDMEM/F12培地を、膣組織をミンチにした組織培養皿に加え、残っている組織片を回収します。組織片を含む溶液を円錐管に移します。無血清DMEM/F12培地を、総容量が10 mLになるまで追加します。
   2. 5 mgのリベラーゼを1 mLの滅菌水(5 mg / mL)に溶解します。.230 μLのアリコートを-20°Cで最大1ヶ月間、または-80°Cで6ヶ月間保存してください。
   3. 230 μLのリベラーゼ(ストック13 U/mL)をチューブに加え、最終濃度は0.3 U/mLです。
      注: Liberase のアクティビティはバッチによって異なる場合があります。使用直前にウォーターバスを使用して各アリコートを解凍します。凍結と解凍の繰り返しは避けてください。
   4. 同じドナーの2〜3回の追加膣生検について、手順2.1〜2.3を繰り返します。
      注:1回の生検からの組織片を含む各溶液を別々の円錐形のチューブに保管してください。たとえば、4本のチューブで4回の膣生検を行います。これは、遠心分離後の最適な細胞ペレット化に重要です。
   5. サンプルミキサーを使用して、チューブを37°Cで3時間インキュベートし、絶えず激しく攪拌します。
   6. サンプルミキサーを_CO2 インキュベーターに入れます。一定の攪拌を維持します。(サンプルミキサーの設定:25rpmの回転運動で5秒間、30°の逆方向(傾斜回転)で5秒間、2°の振動(ボルテックス)運動で3秒間)。
   7. インキュベーション中に、チューブを30分間隔でボルテックスします。
   8. サンプルを3,000 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、廃棄します。
   9. 10%ウシ胎児血清(FBS)および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μg/mLアムホテリシンBを含む1-2 mLのDMEM/F12培地にペレットを再懸濁し、リベラーゼ酵素を希釈します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、激しくピペットで動かします。

3. 細胞培養

1. 未消化組織片の除去
   1. 100 μmのセルストレーナーを滅菌済みの50 mLコニカルコンテナの上に置きます。
   2. 同じドナーの複数の組織生検から得られた細胞懸濁液をプールします。
   3. 組織/酵素懸濁液を濾し、5mLシリンジプランジャーで押し込みます。残りの組織片が完全に押し込まれているように見えるまで、この手順を繰り返します。
      注:ストレーナーを介して完全に機能していない膣組織の断片からの粘液がいくつかある可能性があります。粘液をセルストレーナーで捨てます。
2. 細胞培養プーリング
   1. 複数の膣生検(同じドナーから)からの細胞懸濁液をペトリ皿(60 mm x 15 mm)にプレートします。
   2. ペトリ皿を_CO2 インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
   3. 非接着性細胞の存在を位相差顕微鏡で観察し、確認します。
   4. 顕微鏡の焦点がプレートの底にあることを確認します。
      注:手前には多くの免疫細胞が存在する可能性があります。プレートの底に付着する線維芽細胞の数は少なくなります。
   5. 細胞培養培地を交換する前に18〜24時間待ってから、適切な細胞接着を確保してください。
   6. 80%のコンフルエントが発生するまで、3日ごとに培地を交換します。細胞が80〜90%のコンフルエントに達したら、より大きなフラスコに拡張するか、将来の使用のために細胞のアリコートを凍結します。

Results

膣組織は、骨盤臓器脱手術を受けた10人の独立したドナーから採取されました。記載されたプロトコルを用いて、細胞をヒト膣組織から単離した。細胞集団は、細長い、平らで、紡錘形の外観を特徴としていました。他の研究と同様に、ドナーの年齢が上がるにつれて、線維芽細胞の細胞倍加能力が有意に遅くなり、クローン形成能力が低下することが観察されました。これらの違いは、高齢者(75〜78歳)から単離された線維芽細胞と若年者(35〜47歳)から単離された線維芽細胞を比較すると顕著でした。中年のドナーからの細胞は、中程度のプロファイル(56〜61歳)を示しました。細胞増殖速度は、最初に、同じ既知の播種密度の位相差顕微鏡を用いた直接可視化によって推定されました。

図 1: プロトコルの図表。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図1は、解離および分離プロトコルの図表を示しています。これらのステップに続いて、このプロトコルは、細胞の継代培養を可能にするのに十分な細胞数で、10人中9人のドナーで一次線維芽細胞の単離の成功率90%をもたらしました。ドナーの年齢の中央値は59歳でした。

プロトコール(著者、年)	オリジナルプロトコルのドナー組織	寄付者数	ドナーの年齢(年)	得られた線維芽細胞	形態学
Ruiz-Zapata et al., 2013 (英語)	人間の膣	3	56-78	いいえ	該当なし
Khanら、2016	マウスの耳と尾	2	48-65	いいえ	該当なし
Waise et al., 2019 (英語)	ヒト組織	3	56-75	いいえ	該当なし
Nadalutti et al., 2020 (英語)	人間の包皮	1	65	いいえ	該当なし
現在の	人間の膣	10	35-79	はい	スピンドル形状

表1:ヒト膣線維芽細胞の単離を成功させるためのプロトコルの比較。異なる既存のプロトコルと私たちのプロトコルとの比較は、形態学的結果によって証明されています。

表1 は、この研究で膣線維芽細胞の分離を試みるために他のプロトコルを使用した結果を示しています。私たちは、膣粘膜および高齢の^ドナー5から一次線維芽細胞を分離するための標準的なプロトコルを開発しました。

表1にリストされているものを含む、いくつかの確立されたプロトコルをテストしましたが、私たちの研究では、これらのプロトコルを使用した細胞単離の成功は観察されませんでした。その制限について、以下の理由を提案します。

Ruiz et ^al.3 によって発表されたプロトコルには、筋膜をこすり落とし、組織を細かく切断することが含まれます。私たちの経験では、筋膜を区別することは難しく、掻き取ろうとすると細胞収量が大幅に減少する可能性があります。この方法は単純ですが、重要な詳細が不足しているため、一般化可能性が制限されます。さらに、このプロトコルの機械的消化は、閉経後の組織には不十分であるように思われ、閉経後の組織はより密度が高くなる傾向があります。

Khanら⁹ およびWaiseら¹³ によって発表されたプロトコルは、メス技術と比較して大きな多方向のせん断力を導入しない組織ミンチ用のはさみを採用しています。私たちの経験では、ハサミ法も効果的に機能しませんでした。

最後に、外植片法を使用したNadaluttiら¹⁴ のプロトコルは、私たちの手に線維芽細胞をうまくもたらしませんでした。この方法は、閉経後組織の性質上、線維芽細胞をうまく解離させるために、より積極的な機械的および酵素的処理が必要になる可能性があるため、効果が低下する可能性があります。

図2:0日目の懸濁細胞の位相コントラスト画像。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2は、私たちのプロトコルを使用した0日目の懸濁細胞を示しています。

図3:3つの1cm² 組織生検のプール細胞懸濁液からの100倍倍拡大での培養14日目の膣初代線維芽細胞の位相コントラスト画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3 は、1cm²の寸法の3つの組織生検のプール細胞懸濁液からの100倍の拡大で一次線維芽細胞を示しています。

線維芽細胞の同一性は、前述のように免疫蛍光法によってわずかな変更を加えて調査しました。初代膣細胞の細胞起源を確認するために、免疫蛍光染色による線維芽細胞起源の特異的バイオマーカーを使用しました。閉経前および閉経後の組織サンプル(図5)からのビメンチン(図4)、F-アクチン、およびα-SMAの陽性染色に基づいて、細胞を線維芽細胞として同定しました。線維芽細胞は、実験で使用するために、高い生存率(>90%)で増殖するまで培養されました。

図4:膣線維芽細胞のビメンチンの陽性染色。 単離された閉経前および閉経後の組織初代線維芽細胞をIF分析にかけ、画像を200倍の倍率で撮影しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:膣線維芽細胞のF-アクチンおよびα-SMAの陽性染色。 タンパク質発現の結果をIgGコントロールと比較した結果。画像は200倍の倍率で収集されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

これまでの多くの研究で、ヒトの膣から初代線維芽細胞を単離する方法が報告されている^3,7。いくつかの研究では、骨盤臓器脱のある閉経前の個人のヒト膣組織を使用した。閉経前および閉経後の個人からの組織の使用を報告した論文は^いくつかあるが^7,11、彼らは、高齢または閉経後のドナーから線維芽細胞を成功裏に分離するために使用されたプロトコルを十分に詳細に説明していなかった。膣壁は、性器脱のある閉経後の女性の方が閉経前の女性よりも厚く、この集団における隔離の困難さを増している理由を説明しているのかもしれない¹³。骨盤底障害は閉経後またはそれ以上の年齢層で最も一般的であるため、疾患のモデリングと調査には、閉経後のドナーからの隔離を成功させることが不可欠です。

私たちは、35〜78歳のドナーからヒト膣線維芽細胞を成功裏かつ一貫して採取および培養するためのプロトコルを確立しました。初代膣細胞の細胞起源は、免疫蛍光染色による線維芽細胞起源のバイオマーカーによって確認されました。

ここで紹介するヒト膣線維芽細胞単離法は、初代線維芽細胞の単離と培養を可能にします。我々の経験では、初代細胞の解離のための動物⁹およびヒト^3,14,16組織に対する以前に発表されたプロトコルの使用は、この研究¹⁴においてヒト膣サンプルから線維芽細胞を抽出することができなかった。

我々は、ヒト膣組織からの細胞解離の課題について、2つの考えられる理由を仮定した:(1)粘膜の真皮の厚さは高齢のドナーで大きく、高齢のドナーからの非粘膜組織のそれと比較すると^13,17細胞の解離をより困難にする、(2)線維芽細胞の密度は高齢者で著しく減少する可能性がある¹⁷。

これらの課題を考慮すると、このプロトコルには変更すべきではないいくつかの重要なステップがあります。最初の重要なステップは、非常に厳密な機械的消化の実施です。ここでは、2メスの技術を使用します。私たちの経験では、ハサミで置き換えて組織をミンチにしても、ヒトの膣組織から線維芽細胞を解離させるのに十分な小さな断片は得られません。

もう1つの重要なステップは、細胞懸濁液をプールし、単一のドナーから3〜4の全層生検(1 cm²)をプールすることです。これは、継続的な培養に十分な細胞を得るために必要です。いずれの場合も、骨盤臓器脱手術の必要な部分として余分な膣上皮をトリミングするため、1 cm² よりも大幅に多くの組織を採取しました。この研究では、同じドナーに由来する細胞懸濁液のみをプールし、さまざまなドナー間の細胞特性と増殖を調査し、区別しようとしました。

私たちのプロトコールには明確な利点があります:機械的および酵素的消化により、閉経後の組織の収量が向上しますが、閉経前のサンプルに悪影響を与えることはありません。

私たちは、私たちのプロトコルにいくつかの制限があることを認めています。ヒトの膣組織へのアクセスは、膣脱手術が行われていない状況では困難な場合があります。複数の組織生検サンプルの細胞懸濁液をプールする必要性も制限となる可能性があります。

結論として、ヒト膣線維芽細胞を取得するためのこのプロトコルは、骨盤底障害、特に閉経後の個人の将来の調査に役立つツールであり、女性の健康研究への重要な追加となります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アムホテリシン B	バイオテクネ	B23192
セルストレーナー (100 μm)	サーモフィッシャーサイエンティフィ	22363549
コニカル遠心チューブ(15 mL)	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-53A
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィ	11320033
フェザー ディスポーザブルメス No. 15	ソコレックス	FB.15
シ胎児血清	シグマ アルドリッチ	NC1983075
高透明度円錐形遠心チューブ (50 mL)	フィッシャーサイエンティフィック	14-432-22
HulaMixer サンプルミキサー	ThermoFisher Scientific	15920D
Human Fibronectin DuoSet ELISA	R&Dシステム	DY1918-05
ヒトプロコラーゲン I α 1 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY6220-05
リベラーゼ研究用グレード	Σ	Aldrich 05 401 119 001
ペニシリン/ストレプトマイシン (5000U/ml)	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15070063
シャーレ、ポリスチレン (100 mm x 20 mm)	ミリポア	Σ P5606
血清学的ピペット (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
滅菌シリンジ(5mL)	Fischer Scientific	14-955-458