電動装置を用いた単一細胞解析のための組織の機械的解離

Summary

フローサイトメトリーなどのダウンストリーム解析用の単一細胞懸濁液を生成するために、組織の酵素的および半自動機械的解離を組み合わせるための一般的なプロトコルが提供されています。このプロトコル用に開発された低コストの機械装置の製造、組み立て、および操作に関する説明が含まれています。

Abstract

組織サンプルの分析のために単一細胞を単離して調製できることは、新しい生物医学的発見や研究にとって急速に重要になっています。シングルセル単離のための手動プロトコルは、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすいです。自動化された機械的プロトコルは、処理時間とサンプルのばらつきを減らすことができますが、リソースの少ない研究環境では簡単にアクセスできず、費用対効果も高くありません。ここで説明する装置は、学術研究室向けの低コストの代替品として市販の材料を使用した半自動組織解離用に設計されました。デバイス設計を製造、組み立て、および操作するための手順が提供されています。解離プロトコルは、複数のマウス組織にわたる手動調製と同等の細胞収量とサンプル生存率を持つ単一細胞懸濁液を確実に生成します。このプロトコルは、デバイスごとに最大12個の組織サンプルを同時に処理する機能を提供し、大きなサンプルサイズを必要とする研究をより管理しやすくします。付属のソフトウェアにより、さまざまな組織や実験の制約に対応するためにデバイスプロトコルをカスタマイズすることもできます。

Introduction

シングルセル解析は、フローサイトメトリー、異なる細胞タイプの同定、シングルセルシーケンシング^{、細胞間の}ゲノムやトランスクリプトーム変異の同定などのアプリケーションにおいて、新しい生物医学的発見に急速に重要になっています1。目的組織からこのような細胞単離を行うには、解剖した組織を細かく刻み、それらを微細なセルストレーナーに押し込んで、目的の細胞から結合組織をろ過する必要があります(図1A)。樹状細胞やマクロファージなどの接着細胞タイプ、または特に線維組織からの細胞を単離するには、追加の機械的または酵素的分離ステップ^{が必要です2,3,4}。このプロセスは通常、手作業で行われるため、細胞収量やサンプルの生存率を評価する際に、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすくなります。したがって、自動組織解離のためのカスタマイズ可能なオプションを導入することが重要です。このようなシステムを設計する試みはいくつか行われてきましたが、特に学術研究室やリソースの少ない環境では、主にこれらのデバイスのコストが法外な性質のために、既存のオプションに常に容易にアクセスできるとは限りません⁵。さらに、これらの機器は、研究グループ⁶の個々のニーズに合わせて常にカスタマイズできるとは限らない。

ここでは、消化酵素と機械的破壊の助けを借りて、組織全体または組織片の単一細胞懸濁液への消化を自動化するように組織解離装置が設計されました。この装置は、実験室で簡単に組み立てることができ、温度調節のために加熱室または冷却室に入れ、解離に必要な組織数に合わせてカスタマイズし、目的の解離プロトコルでプログラムすることができます。このデバイスを広く使用することで、細胞抽出プロトコルの再現性が大幅に向上し、手動解離に代わる時間節約が期待できます。

この設計により、自動化されたプロセスにより、最大12個の組織を同時に消化することができます。このデバイスは、並列に配線された12個の個別のモーターで構成され、モーターの回転/速度を制御するための調整可能な電圧ダイヤルを備えたAC/DCアダプターを介して標準の壁プラグから電力を供給されます。モーターは、Cチューブの上部にぴったりと収まる六角ボルトを回転させます。Cチューブは、モーターが固定されているトッププレートの両側にラッチするアクリルプレートに下向きの張力をかけることで所定の位置に保持されます(図1B)。モーターは並列に配線されているため、任意の電圧での速度はあまり変化しませんが、電圧が一定に保たれていても、負荷(デバイスに取り付けられたCチューブの数)が速度に影響を与えます。毎分回転数(rpm)を測定するために、ホール効果センサーとモーターシャフトの1つに固定磁石を使用してタコメーターが組み込まれています(補足図1)。モーターアレイを構築するためのCADファイルは、 補足コーディングファイル1で提供されています。また、モーターに供給される正/負の電荷を逆転させることで回転方向を反転させるプログラム可能なスイッチも含まれています。これらの機能はすべて、コード化されたソフトウェア(Arduino IDEソフトウェア、 材料表を参照)を使用して、Arduino Nano(補足コーディングファイル2)に統合されています。接続されたボタンとLCDパネル(補足図2)を使用して、保存されたプロトコルとカスタムプロトコルを作成および実行し、プロトコルの指定された時間に回転方向を自動的に反転させ、電圧を使用して速度を調整し(補足図3)、プログラムされたプロトコルを完了するための現在のモーター速度と残り時間を表示することができます(補足図4)。

本研究では、このデバイスによる機械的酵素的組織解離と手動酵素組織解離の両方を使用して単一細胞懸濁液を調製し、下流のアプリケーション用に回収された細胞に違いがある場合、その違いを決定しました。細胞調製物は、組織あたりの総細胞収量および細胞生存率に基づいて評価しました。フローサイトメトリーを使用して、表面マーカー発現の潜在的な違いを比較しました。データは、グラフ作成および統計解析ソフトウェアを使用して分析しました。対応のないウェルチの t検定 は、2つの反復実験を表す4匹のマウス>サンプルサイズnで、サンプルまたはグループのペアを比較するために使用されました。このデバイスの製造と組み立ての詳細な手順は、 補足ファイル1に記載されています。このプロトコルに必要な材料は、 材料表に記載されています。

Protocol

このプロトコルは、UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認されました。これらの研究には、7週齢から9週齢の雌のC57BL/6Jマウスの組織を使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。

1. 手動解離

注:この手順は、Maisel K. et ^al.7 から引用したものです。

1. 解剖した組織を除去し、5%ウシ胎児血清(FBS)を含む低温細胞培養培地に入れます。
2. 鋭利な解剖ハサミを使用して、破片が任意の寸法で1mm未満になるまで組織を切り刻みます。
3. みじん切りにした組織を15 mLのコニカルチューブに移し、5 mLの培地を加えます。
4. 単離する組織および細胞の種類に基づいて消化酵素を添加します。提示された実験では、コラゲナーゼ4(1 mg/mL)、コラゲナーゼD(1 mg/mL)、およびDNase(40 μg/mL)を使用します。
5. シェーカーまたはロッカーで37°Cで1時間インキュベートし、インキュベーション中は穏やかに撹拌します。サンプルを100回上下にピペットで移動させます。
6. EDTAを添加して、5 mMの濃度のサンプル量を実現します。サンプルを上下に100回ピペットしてから、サンプルを上下に100回激しくピペットします。
7. サンプルを70 μmのセルストレーナーに通し、50 mLまたは15 mLのチューブに集めます。
8. 収集した細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を除去し、細胞を1 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。室温で1分間インキュベートします。
9. 9 mLの冷たい1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加して、溶解緩衝液を中和します。
10. 回収した細胞を再び300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を除去し、細胞を目的のバッファーまたは培地に再懸濁します。

2. 半自動の機械的解離

1. 解剖した組織を5%ウシ胎児血清(FBS)を含む冷細胞培養培地に入れます。
   注:このプロトコルは固体ティッシュからのセル隔離のために意図されている。
2. 鋭利な解剖ハサミを使用して、組織の破片が任意の寸法で約5 mmになるまで組織を切り刻みます。みじん切りにした組織をCチューブに移し、培地1mLを加えます。
3. Cチューブをデバイスにロードします。チューブホルダープレート(補足図1A)をD字型のチューブ底部に取り付けます。
4. テンションアームをアクリルプレートにラッチして、チューブをモータープレートに固定します(補足図3)。
5. カスタムプログラムを設定します:進む、30秒。リバース、10秒;ループ、4回。
   1. 青いボタンを押して、メインメニューからカスタムモードを選択します。
   2. 最初のカスタムモードメニューで、画面上の値が30秒になるまで 赤い ボタンを押して、前方回転の持続時間を30秒に指定します。 青い ボタンを押してこの値を選択し、次のメニュー画面に進みます。
   3. 2番目のカスタムモードメニューで、画面上の値が10秒になるまで 赤い ボタンを押して、逆回転の持続時間を10秒に指定します。 青い ボタンを押してこの値を選択し、次のメニュー画面に進みます。
   4. 3番目のカスタムモードメニューで、画面上の値が2.5.2Xになるまで 赤い ボタンを押して、手順2.5.2-2.5.3で設定した選択を繰り返す回数を指定します。 青い ボタンを押してこの値を選択し、プログラムを開始します。
      注意: カスタムプログラムはデバイスメモリに保存されませんが、プリセットプログラムの1つとしてプログラムして、より高速な操作を行うことができます(デバイスのプログラミング手順は 補足ファイルに記載されています file 1)。
6. LCD画面の右下隅にある計算されたrpm値が200になるまで、電圧制御ダイヤル(補足図3)を調整して、カスタムプログラムを200rpmで実行します(補足図4)。
7. 単離する組織および細胞の種類に応じて、4 mL培地に消化酵素を添加します。
   注:提示された実験では、コラゲナーゼ4(1 mg/mL)、コラゲナーゼD(1 mg/mL)、およびDNase(40 μg/mL)を使用してください。
8. Cチューブをデバイスにロードし、手順2.3〜2.6を繰り返して、次のプログラムを200rpmで実行します。リバース、10秒;ループ、4回。
9. チューブを装填したままデバイスを37°Cのインキュベーターに45分間移します。
10. Cチューブをデバイスにロードし、手順2.3〜2.6を繰り返して、次のプログラムを50rpmで実行します。リバース、30秒。ループ、9回。
11. EDTAを添加して、サンプル中の濃度を5 mMにします。
12. Cチューブをデバイスにロードし、手順2.3〜2.6を繰り返して、次のプログラムを100rpmで実行します。リバース、10秒;ループ、2回。
13. サンプルを70 μmのセルストレーナーに押し込み、50 mLまたは15 mLのチューブに集めます。
14. 収集した細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を廃棄し、細胞を1 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。室温で1分間インキュベートします。
15. 溶解緩衝液を 9 mL の低温リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で中和します。
16. 回収した細胞を再び300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を廃棄し、細胞を目的のバッファーまたは培地に再懸濁します。

3. データ分析

1. グラフ作成および統計解析ソフトウェアを使用してデータを分析します( 材料表を参照)。
2. 対応のないウェルチの t 検定 を使用して、サンプル サイズ n > 4 匹のマウスで 2 つの反復実験を表すサンプルまたはグループのペアを比較します。
   注:差は、(p < 0.05)の場合に統計的に有意であると見なされました。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

Results

この半自動の機械的プロトコルは、細胞を手作業で処理した実験の結果を再現することができます。この装置を使用して手動解離によって調製した細胞懸濁液は、マウスの肺、腎臓、および心臓組織全体で同等の細胞収量とサンプル生存率を示します(図2A、B)。T細胞や樹状細胞などの免疫細胞の集団は、単離プロトコルの違いによって有意な影響を受けませんでした(図2C)。同様に、これらの免疫細胞集団における表面マーカー発現の解析では、単離されたT細胞の頻度が類似しており(図3A)、樹状細胞における抗原提示マーカーMHC-IIの平均蛍光強度(図3B)は、手動単離とデバイス単離で同等であることが示されています。

Discussion

このデバイスは、研究環境で簡単に組み立てられるように設計されており、その後のシングルセル解析のために組織全体からシングルセル懸濁液を提供します。これらの機能は、基本的なものですが、学術現場やその他の研究者のニーズを満たすのに十分です。このデバイスを使用する主な利点は、ばらつきを低減することにより、単一細胞懸濁液の調製を改善できる可能性があることです。さらに、12+サンプルを同時に処理できるため、サンプル間の一貫性を高めることができますが、手動解離プロトコルに必要な時間の増加の影響を受ける可能性があります。研究機関や産業界では、このようなデバイスやその他の市販のデバイスにより、より高速でカスタマイズ可能な組織処理が可能になります。しかし、商用機器は、ここで説明する機器の10倍以上のコストがかかるため、特にリソースの少ない^{研究環境では}、アクセスが制限されます^8,9。アカデミアの研究室では、この装置により、研修生(学部生および大学院生)は、in vivo分析のための組織の処理に必要な時間を短縮することで、より高度な研究を完了す...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼インチアクリルシート  12 "×24"	アクリルメガストア	N / A
½インチアクリルシート12 "×12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 Gステンレス鋼線(テンションアーム用)	Everbilt	1000847413
16 G電線(撚り線)	ベストコネクション	N / A
2 x 3 mmマグネット	SU-CRO0587	N/A
2チャンネル中継基板(モータへの電流の極性を逆にする)	AEDIKO	AE06233
37mm径DCモータ(12V、200rpm)×12	Greartisan	N/A	定格トルク:2.2 Kg.cm 減速比:1:22 定格電流:0.1 A D字型出力軸サイズ:6 x 14mm(0.24インチ x 0.55インチ)(D x L) ギアボックスサイズ: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) モーター サイズ: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) 取り付け穴サイズ: M3 (別売)
可変電圧コントローラー付きAC/C電源アダプター  (5アンペア、3-12ボルト)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A 精密降圧コンバータ降圧トランス	Walfront	1A	(Arduino Nano 電源アダプタ)
Arduino Nano  (ラヴィン)	LAFVIN	8541582500
ボタン	Awpeye	プッシュボタン
C57BL6/J マウス	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
両面フォームテープ	SANKA	N/A
両面プロトタイピング回路基板	deyue	N / A
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
はんだとはんだごて	LDK	1002P
電気テープ	3M	03429NA
FBS(ウシ胎児血清)	Gibco	16140089
gentleMACS Cチューブ	Miltenyi	130-093-237
グラフパッド プリズム	GraphPad, La Jolla, CA		グラフ作成および統計解析ソフトウェア
ホール効果センサー 寸法 : 0.79 x 0.79x 0.39 インチ	SunFounder	43237-2
六角カプラー 6 mm ボアモーター 真鍮 x 2 x 12	Uxcell	N/A
六角ボルト (M4-.70 X 12 六角頭キャップネジ) x 12	FAS	N/A
ジャンパー線 (Arduino Nano 用)	ELEGOO	EL-CP-004
LCDスクリーン	JANSANE	N/A
M3 六角ソケットヘッド キャップ ネジ x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3ステンレス鋼小ネジフラットヘッド六角ソケットキャップネジ(30 mm)x 36	まだ起きている	a52400001
クイックディスコネクト端子コネクタ	IEUYO	22010064
赤血球溶解バッファ(10x)	セルシグナリング	46232
端子アダプタシールドArduino Nano用拡張ボード  12 "x 24"	深セン Weiyapuhua	テクノロジー60-026-3