成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

アストロサイトとミクログリアは、中枢神経系(CNS)で重要な役割を果たす汎用性の高いグリア細胞であり、神経機能の調節、中枢神経系の発達への寄与、血液脳関門の維持、その他の重要なプロセスへの参加などの役割を担っています^1,2,3,4.これらのグリア細胞は、ホメオスタシスの維持における役割に加えて、損傷や修復のメカニズムにおいても極めて重要な役割を果たしています。ミクログリアは、侮辱や傷害に続く貪食、炎症、および遊走能力でよく知られています^5,6,7。疾患におけるアストロサイトの応答も同様に多様であり、炎症、グリア瘢痕の形成、および血液脳関門の損傷への寄与を網羅しています^8,9。中枢神経系におけるミクログリアとアストロサイトの有害および修復的な役割についての理解は深まっていますが、それらの構造と機能の両方に固有の不均一性は、さまざまな状況でそれらを研究するための堅牢なツールを必要とします。

健康と疾患におけるミクログリアとアストロサイトの役割についてさらに洞察を得るには、 in vivo と in vitro での研究を組み合わせたアプローチが必要です。 in vivo 法では、中枢神経系内のグリア細胞とニューロン間の複雑なクロストークを活用し、 in vitro の方法論は、特定の刺激下での単一細胞の機能や応答を評価する際に有用であることが証明されています。それぞれの方法には独自の利点があります。 in vitro 研究は、隣接する細胞からの直接的または間接的なインプットなしに、これらの細胞タイプの特定の役割を理解するために不可欠です。さらに、不死化細胞株を用いた in vitro アッセイは、無期限に増殖する能力、費用対効果、メンテナンスの容易さなど、一定の利点をもたらします。ただし、初代細胞は細胞株と比較して、正常な生理学的応答をより厳密に模倣していることに注意することが重要です。この生理学的関連性は、機能アッセイやトランスクリプトーム解析において非常に重要です。

特に成体マウスの脊髄から初代細胞を得る際の課題の1つは、サンプルの量と生存率にあります。成人の脊髄は、脳よりも小さく、かなりの量のミエリンを含んでいるため、独特の困難があります。新生仔動物または成体マウスの脳からの純粋で生存可能なグリア細胞の分離を詳述するいくつかの公開プロトコルがありますが10,11,12,13、これらの方法論は、脊髄に特異的な疾患や損傷の研究には適していない可能性があります。このプロトコルでは、成体マウスの脊髄から純粋で生存可能なミクログリアとアストロサイトを効率的に分離するための包括的な手順を提供し、細胞培養およびトランスクリプトーム解析におけるダウンストリームアプリケーションを促進します。このプロトコルは、10週から5ヶ月の成体マウスからこれらの細胞を単離するために使用され、条件付きノックアウトマウス、薬物反応、発生研究、加齢モデルを含む研究など、さまざまな状況でその有用性を実証しています。

すべての動物飼育および実験手順は、ジョージワシントン大学医学部および健康科学部(米国ワシントンD.C.;IACUC#2021-004)です。この研究では、生後10週間から5ヶ月の雌雄のC57BL/6J野生型(WT)マウスを使用し、ジョージワシントン大学に収容された商業サプライヤー( 資料表を参照)から調達しました。プロトコルのワークフローの概要を 図1に示します。

1.脊髄の準備

1. アベルチン(滅菌水中で12.5 mg / mLの2,2,2-トリブロモエタノールおよび2.5%2-メチル-2-ブタノール)を使用して動物を麻酔します( 材料表を参照)。マウスのつま先と尾のつまみに対する反応がないことを確認します。
2. 冷たい1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で心臓灌流を行い、末梢血単核球を除去します。
   1. 動物を浅いトレイに置き、横方向に切開して胸膜腔を露出させます。蠕動ポンプ( 材料表を参照)に接続された23Gの灌流針を左心室に挿入し、ポンプを作動させます。.冷たいDPBSが心臓を流れたら、右心房に小さな切開を作ります。
      注:このステップでは、細胞の生存率を高めるために、より速い灌流速度が好ましい。血液は1分以内に洗い流す必要があります。肝臓のクリア化は、灌流が成功したことを示します。
3. 大きなハサミを使用して動物の首を切り落とし、脊柱¹⁴を取り除きます。Ca²⁺/Mg²⁺/0.2%グルコースを氷上のペトリ皿に入れた冷たい1x DPBSに浸し、組織をすすぎます。
4. 今から、すべてのステップが無菌環境で行われるようにしてください。油圧押し出し¹⁴ を使用して、脊髄全体を分離します。18 G の針と 10 mL のシリンジに、Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% グルコースを含む冷たい 1x DPBS を充填します。組織全体を沈めるのに十分な冷冷1x DPBSとCa²⁺/Mg²⁺/0.2%グルコースを含むアイスパックの上に置かれたペトリ皿に脊髄を移します。
5. 髄膜を層流フード内の顕微鏡で慎重に除去します。脊髄を保冷剤の上の空のシャーレに移し、No.10ブレード外科用メスを使用して、脊髄全体を2〜3mmのセクションに切断します。

2. 酵素細胞解離

1. メーカーのプロトコルに従って、市販の成人脳解離キットから酵素ミックス1と酵素ミックス2を追加します( 材料表を参照)。ディッシュ内で酵素を数回渦巻いて脊髄を均一にコーティングし、37°Cで30分間インキュベートします。5分ごとに皿を静かに渦巻きさせて、組織の凝集を防ぎ、試薬の均一な分布を促進します。
2. ディッシュをインキュベーターから取り出し、350 μL の 0.46 mg/mL DNAse I を最小必須培地(MEM)に添加します( 材料表を参照)。静かに渦を巻いて混ぜます。
3. 1 mLの冷DMEM/0.5%ウシ胎児血清(FBS)を加え、静かに渦巻いて混合します。ただちに内容物全体を5 mLチューブに移します。

3. 機械的細胞解離

1. P1000ピペットを使用して、組織を3回穏やかにトリチュレーションし、そのたびに組織片が引き出され、組織がさらに解離するようにします。次に、プラグを閉めた9インチのガラス製パスツールピペットを使用して、さらに5回静かにトリチュリングし、プロセス中に気泡が発生しないようにします。
2. 5 mLチューブを直立させ、組織を底に30秒間沈殿させます。組織が落ち着いたら、P1000ピペットを使用して上清を吸い上げ、30 μmフィルターを通して15 mLのコニカルチューブに入れます。
3. 残りの組織と同じ 5 mL チューブに、1 mL のコールド DMEM/0.5% FBS を加えます。パスツールピペットを使用して、3回静かにトリチュレーションします。
4. 組織を底部に30秒間沈殿させてから、上清を30 μmフィルターに通し、以前と同じ15 mLチューブに集めます。手順3.3と手順3.4をもう一度繰り返します。
5. ろ過した細胞懸濁液を300 x g で室温(RT)で10分間遠心分離します。得られた上清を真空吸引器で慎重に除去し、廃棄する。

4.ミエリン除去

1. Adult Brain Dissociation Kitに同梱されている破片除去溶液(DRS)を使用して、メーカーのプロトコルに従ってミエリンを除去します。破片を除去した後、5 mLのコールドDMEM/0.5% FBSを細胞ペレットに加え、チューブを3回静かに反転させます。細胞懸濁液を300 x g で室温(RT)で10分間遠心分離します。
   注:細胞を in vitro 研究に使用し、培養中に残す場合は、代わりに予熱したDMEM/0.5%FBSを使用する必要があります。
2. 上清を廃棄し、細胞ペレットを 1 mL の DPBS/0.5% FBS(RNA 研究の場合はコールド、 in vitro アッセイの場合はウォーム)に再懸濁します。細胞をカウントし、トリパンブルーを使用して生存率を評価します。
   注:複数の動物由来の細胞懸濁液を組み合わせて、細胞濃度を高めることができます。
3. DPBS/0.5% FBSを添加して、総容量5 mLまで細胞を洗浄します。懸濁液を室温で300 x g で10分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。

5. ミクログリアとアストロサイトの単離

1. メーカーのプロトコルに従って、抗CD11bまたは抗ACSA-2マイクロビーズで細胞を標識します( 材料表を参照)。
2. メーカーの指示に従って、MSカラムを使用してポジティブ選択でセルをソートします( 材料表を参照)。選別後、選別した細胞を300× g で10分間遠心分離し、上清を捨てます。

6. in vitro アッセイ用細胞のプレーティング

注:細胞を播種せず、すぐに RNA 分析に使用する場合は、ステップ 8 に進みます。

1. 細胞を1 mLのウォームDMEM/0.5%FBSに再懸濁します。細胞を数え、血球計算盤を使用してその生存率を評価します( 材料表を参照)。
2. 細胞濃度を50μLあたり75,000細胞に調整します。 50 μLの細胞懸濁液を、24ウェルプレート内の各ポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラス¹¹ に加えます。
3. 37°Cで2時間インキュベートし、細胞がカバーガラスに付着するようにします。
4. 450 μLの温かいDMEM/5% FBS/ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン連鎖球菌、 材料表を参照)を各ウェルに慎重に添加します。
5. 3日後、培地の半分を250 μLの温かいDMEM/5% FBS/Pen-Strepと交換します。メンテナンスのために、培地を4〜5日ごとに500μLの温かいDMEM/5%FBS/Pen-Strepと完全に交換してください。

7. 免疫組織化学

注:免疫組織化学分析は、培地を少なくとも1回交換した場合、少なくとも3日後に行うのが最善です。これにより、破片が除去され、細胞がカバーガラスに完全に付着します。

1. 培地を除去し、細胞を抗マウスモノクローナル抗体 O4(1:100)( 材料表参照)で、温DMEM/5% FBS/10%正常ヤギ血清(NGS)中で室温(RT)または37°Cで15分間標識します。
   注:セルにO4のラベルが付かない場合は、この手順をスキップして手順7.3に進みます。
2. カバーガラスを温かいDMEM/5% FBSに3回浸して、やさしくすすぎます。ヤギ抗マウス594 IgM(1:300)( 材料表参照)を温かいDMEM/5% FBS/10% NGSに添加し、室温で暗所で15分間インキュベートします。温かいDMEM/5% FBSで3回静かにすすいでください。
3. セルを冷たい5%酢酸/メタノールで4°Cで15分間固定します。 1x PBSで3回洗浄し、適切な抗体で標識します:抗ウサギGFAP(1:500)、抗マウスGFAP(1:500)、または抗ウサギIba1(1:500)を1% Triton-X100/10% NGSに1x DPBSで含みます( 材料表を参照)。室温で1時間インキュベートします。
   注意: カバーガラスがすでにO4で染色されている場合は、暗所に保管してください。
4. PBSで3回やさしくすすいでください。適切な二次抗体で標識します:抗マウス594 IgG(1:500)、抗ウサギ488 IgG(1:500)( 材料表を参照)。暗闇のRTで30分間インキュベートします。
5. PBSで3回やさしくすすいでください。室温でDAPI(1:1000)で1分間対比染色し、PBSで3回すすぎ、封入剤を添加し( 材料表を参照)、カバーガラスをスライドに取り付けます。

8. RNA抽出

注:理想的には、分析に十分な RNA を抽出するために、少なくとも 100,000 個の細胞が必要です。必要に応じて、2〜3個の脊髄の細胞を組み合わせることができます。

1. メーカーのプロトコルに従って、市販のRNA単離キットを使用してRNAを抽出します( 材料表を参照)。キットに付属のRW1洗浄バッファーを使用した各洗浄ステップで、細胞を洗浄バッファーにさらに2分間放置します。
2. メーカーの指示に従って、DNase Iを使用して残っているゲノムDNAを除去します( 材料表を参照)。DNaseと室温で15分間インキュベートした後、RW1バッファーで洗浄します。
3. RNAの収量を増やすには、溶出前にサンプルをRNAseフリー水で室温で10分間インキュベートします。バイオアナ^{ライザー15} ( 材料表を参照)を使用してRNAの完全性と量を評価します。

このプロトコルで概説されている方法は、成体マウス脊髄から純粋で生存可能なミクログリアおよびアストロサイトの単離を可能にし、 in vitro の機能的または組織学的アッセイやRNA分析など、さまざまなダウンストリームアプリケーションを促進します。

in vitro試験の単離が成功すると、数日間にわたって細胞が連続的に増殖します。成体細胞は、新生児動物から単離された細胞と比較して増殖速度が遅く、最初の数日間はいくつかの破片が存在する可能性があります。in vitro(DIV)で4日目までに、細胞は破片がほとんどなくなり、ほとんどの細胞がフラスコの底に付着します。アストロサイトはより長い突起を形成し始めますが、ミクログリアはより短い紡錘体を持つ楕円形を呈します(図2)。7 DIVまでに、アストロサイトは結合したコンフルエント層を形成し、ミクログリアはより少なく、より短いプロセスを示すはずです(図3)。

ACSA2ソート細胞をGFAPおよびO4で二重標識してアストロサイト培養におけるオリゴデンドロサイト汚染を評価し、CD11bソート細胞をIba1およびGFAPで二重標識してミクログリア培養におけるアストロサイト汚染を評価することで、純度を確認できます(表1)。

また、プロトコールが成功すれば、分解が最小限に抑えられ、十分な量で高品質のRNAが得られます(図4A)。単離された細胞から抽出されたRNAのエレクトロフェログラムは、顕著な18Sおよび28Sピークを示すはずです。細胞が過剰に解離したり、灌流と細胞選別に時間が長引いたりすると、RNAの分解につながる可能性があります(図4B)。酵素的および/または機械的解離が不十分であったり、ミエリンの除去が不十分であったりすると、細胞収量およびRNAが低下する可能性があります(図4C)。単離されたアストロサイトは、炎症マーカーを特定するために配列決定することができます。健康なアストロサイトと炎症活性化されたアストロサイト(例えば、実験的な自己免疫性脳脊髄炎動物のアストロサイト)を比較すると、健康なアストロサイトと炎症性アストロサイトの炎症経路の相対的な阻害が明らかになります(図4D)。

図1:脊髄調製、組織解離、細胞選別の概要。 この図は、組織の解離や細胞の選別など、脊髄の準備プロセスの概要を示しています。脊髄解剖後、組織は酵素的および機械的解離を受けます。ミエリンを除去し、細胞を抗ACSA2抗体または抗CD11b抗体で標識して、アストロサイトとミクログリアを標的とします。選別された細胞は、細胞培養やRNA解析に利用できます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2: in vitro での4日間のアストロサイトとミクログリアの位相差画像(4DIV)。 (A)は、ACSA2+ソート細胞の代表的な例を示しています。(B)CD11b+細胞は、楕円形の細胞体と短い突起を示す。スケールバー = 50 μm。この図は、Ahn, J. J. et al.16 からの引用です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:in vitro (8DIV)での8日間のアストロサイトとミクログリアの蛍光画像。 (A)GFAP(緑)およびO4(赤)で標識されたACSA2+細胞は、最小限のO4染色を示し、アストロサイトの結合したコンフルエント層を形成します。(B)Iba1(緑)およびGFAP(赤)で標識されたCD11b+細胞は、GFAPの存在が最小限であることを示しています。スケールバー = 50 μm。この図は、Ahn, J. J. et al.16 からの引用です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:RNAサンプルの代表的なエレクトロフェログラム。 (A)細胞単離に成功した後、高収量で高品質のRNAが期待されます。(B)低収量、低品質のRNA、または(C)低収量で高品質のRNAは、細胞死、不十分な解離、または不十分な破片除去の場合に期待できます。(D)健康なアストロサイトと炎症性アストロサイトの特定の炎症経路のRNAシーケンシング解析により、炎症性アストロサイトと比較して、分類された健康なアストロサイトにおける炎症の相対的な抑制が明らかになりました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:ACSA-2およびCD11b細胞の選別後の細胞収量、純度、および生存率。 この表は、Ahn, J. J. et al.16 から引用したものです。

何一つ