口腔カンジダ症のマウスモデルに対するクルクミノイド媒介抗菌光線力学療法

口腔カンジダ症(OC)は、口腔の主な真菌感染症です。カンジダ属菌の異常増殖が原因です。OCの素因には、内分泌機能障害、広域抗生物質の使用、放射線療法および化学療法、栄養欠乏症、口腔乾燥症(唾液流量の低下)、義歯の使用、衛生状態の悪さ、特に免疫抑制^{が含まれます1。}カンジダ種の中で、カンジダ・アルビカンスは最も一般的で毒性のあるものです。それは人体の共生種として、そして日和見病原体として見られます。C. albicansは、その形態を共生酵母(割胞胞)から病原性フィラメント(菌糸および偽菌^糸)に変化させる能力を持っています2。糸状体、特に菌糸は、エンドサイトーシスまたは能動的な浸透によって宿主上皮に侵入し^{、感染を引き起こす可能性があります}3。C.アルビカンスのその他の病原性因子には、脂肪分解酵素、加水分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテイナーゼ、カンジダリシンなどの毒素の接着、バイオフィルム形成、分泌^{などがあります4。}

OC治療には、抗真菌剤、特に局所ポリエンとアゾール(ナイスタチンとミコナゾール)の使用が含まれます⁵。しかし、それらは短期的な有効性を示すにすぎず、再発が頻繁です。さらに、抗真菌剤の過剰使用は、抗真菌剤耐性の発達^{と広がりの問題}を引き起こしました6。そのため、酸素存在下で光増感剤(PS)と適切な波長(PS吸収と同じ波長)の光を組み合わせる抗菌光線力学療法(aPDT)などの代替療法が必要です。PSは細胞に結合または取り込まれ、光によって活性化されると、感作細胞に有毒な活性酸素種(ROS)を産生する⁷。

aPDTでは、使用される光増感剤(PS)の1つが、ウコン植物(Curcuma longa L.)の根茎から抽出された天然由来の化合物であるクルクミン(CUR)です。クルクミンは、抗炎症作用、抗酸化作用、抗がん作用、抗菌作用など、多くの治療効果を持っています^8,9。以前の調査では、CURを利用したaPDTは、宿主の組織に害を及ぼすことなく、口腔カンジダ症のマウスモデルでC.アルビカンスを効果的に減少させることがわかりました¹⁰。CURはターメリックから抽出される主なクルクミノイドですが、デメトキシクルクミンやビスデメトキシクルクミンなどの他のポリフェノールもこの植物に含まれています。クルクミノイド媒介aPDTは、カテーテルで増殖した黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対して抗菌活性を示した¹¹。しかし、私たちの知る限り、C.アルビカンスに対する抗真菌活性は不明のままです。そこで、本研究では、OCのマウスモデルにおいて、C. albicansに対するクルクミノイド塩を介したaPDTを評価した。

マウスの使用に関する研究プロトコルは、UNESPのアララクアラ歯学部の動物使用倫理委員会(ケース番号05/2008および09/2020)によって承認されました。 C. albicans (ATCC 90028)を基準株として使用しました。本研究には、体重範囲が20〜30 gの6週齢の雌スイスマウス(n = 45)を使用しました。動物はサンパウロ州立大学、ユネスプロ、ボトゥカトゥから提供されました。

1. PSの準備とaPDT用光源の選択

1. 試験する物質の仕様に従ってPSを準備します。
   注:この研究では、クルクミノイドの水溶性混合物(CURベースの水溶性塩混合物¹²)をPSとして使用しました( 材料表 および 図1を参照)。20 μM、40 μM、80 μM(それぞれ15.6、29.2、58.4 mg/L)の希釈液を使用直前に超純水で調製し、5°Cに保ちました。
2. 組織を加熱することなく、光増感したターゲット全体を均一かつ同時に照らすことができる適切な波長(PS吸収と同じ波長)の照明器具を選択してください。
   注:この研究では、Instituto de Física de São Carlos(サンパウロ大学、サンカルロス、SP、ブラジル)で設計された発光ダイオード(LED、 材料表を参照)を含むハンドピースを使用しました。この光によって供給される出力電力は、約455nmの青色波長で89.2mW/^cm2 であった。

2. C. albicans inoculumの調製

1. 参照株 C. albicans (ATCC 90028) を酵母-ペプトン-グルコース (YEPD、 材料表を参照) に溶かし、50% グリセロールを -80 °C で使用まで保管してください。
2. 凍結菌株を室温で解凍し、100 μLのアリコートをサブロードデキストロース寒天培地(SDA)とクロラムフェニコール( 材料表参照)を含むペトリ皿に広げ、37°Cで48時間インキュベートします。
3. 5つのコロニーを2%グルコース(YNBg)培地を含む10 mLの酵母窒素ブロスに移し、37°Cで16時間好気的に増殖させます。
4. 酵母培養液を新鮮なYNBg(1:10)で希釈し、光学濃度が成長の中間期に達するまで37°Cで好気的にインキュベートします。
   注:以前に各実験室の微生物増殖曲線を標準化しました。本研究では、培養物を約8時間インキュベートし、540 nmでの光学濃度(OD₅₄₀)で示される成長の中間対数段階に達するまで、平均値は0.536±0.062任意の単位(平均±標準偏差[SD])でした。
5. 培養物を室温で5,000× g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、同量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS;0.136 M NaCl、2 mM KCl、1 mM KH₂PO₄、10 mM Na₂HPO₄、pH 7.4)でペレットを2回洗浄します。
6. 100 μL のアリコートを使用して PBS で 10 倍希釈を 4 回行い、SDA プレートに希釈液を広げ、37 °C で 48 時間インキュベートしてコロニーカウントを行います。標準として、真菌懸濁液は、約4.5×〜10⁷ コロニー形成単位/ミリリットル(CFU / mL)]の濃度で使用されます。

3. マウスにおけるOCの誘導

注:以下の方法論は、Takakura et ^al.13によって以前に記述され、いくつかの修正を加えて私たちのグループ^10,14によって再現されました。

1. マウスを9つのグループ(n = 5)にランダムに分布させ、同じ治療回数に対応する(補足ファイル1)。
   注:マウスの口腔は 、カンジダの 増殖に対して陰性でなければなりません。これは、口腔内を綿棒で拭き取り、サンプルをSDAにメッキして確認する必要があります。
2. 動物をプロピレン製の箱¹⁰個(1箱あたり最大5匹)に入れ、床材用の木の削りくずを入れ、温度管理されたビバリウムで23±2°C、12/12時間の明暗サイクルで飼育します。特定のエンリッチメントを提供する必要はありません。
3. マウスを押出マウスの餌とろ 過水で自由に維持します。
4. 免疫抑制剤であるプレドニゾロン (100 mg/kg 体重、 材料表を参照) を、C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20 μM、C+L- 40、C+L- 80、C-L+、および C-L- のすべてのメンバーに 1 日目に初めて皮下注射します (補足ファイル 1)。
   注:同じグループのマウスを同じ箱に入れ、ストレスや体重減少の兆候がないか毎日監視します。ストレスや体重減少が見られる場合は、鎮痛剤または変更された食物/水について獣医師のアドバイスを求めてください。.
5. 1日目から実験終了まで、0.83 mg / mLの飲料水に塩酸テトラサイクリンを提供します¹³。
6. 2日目に、C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20、C+L- 40、C+L- 80、C-L+、およびC-L-(補足ファイル1)を含むマウスの舌に 、C. albicans 接種物を接種する。ネガティブコントロールグループ(NCtrl)のマウスには接種しないでください。
   1. 接種を行う前に、各大腿部の筋肉に10 mg / kgのクロルプロマジン塩化物( 材料表を参照)を筋肉内注射して動物を鎮静させます。.
   2. 滅菌スワブ(動物1匹につき1本)を、新たに調製した(すなわち、接種直前に調製した)標準化されたC .アルビカンスの懸濁液に浸すことにより、マウスの口腔内接種を行う。
   3. 鎮静したマウスを仰臥位に置きます。滅菌鉗子を使用して、舌を口からそっと引き出します。各マウスの舌を浸した綿棒で30秒間こすります。マウスが鎮静から回復するまでマウスを監視します。
7. 5日目に、免疫抑制を維持するためにプレドニゾロン(100 mg / kg体重)の補完的な皮下注射を投与します。
   注:このプロトコルは、口腔内接種後7日間感染を維持するのに十分です。プロトコルのタイムラインを 図 2 に示します。

4. 抗菌光線力学療法と口腔病変からの C.アルビカンスの 回復

1. 7日目に、治療前に、塩酸ケタミン(100 mg / kg体重)とキシラジン(10 mg / kg体重)を組み合わせて腹腔内注射を使用して動物に麻酔をかけます( 材料表を参照)。
2. 口を開いたままにしておくために切歯の周りにループすることができるステンレス鋼ワイヤーを備えたパッド装置^14,15に各動物を仰臥位に置く。
   注:等温パッドは、鎮静中にマウスを温め、室温での低体温症を防ぎ、麻酔に関連する死亡を避けるために推奨されます¹⁵。麻酔をかけた各動物は、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまんだときの離脱反射の欠如によって監視されるべきです。.必要に応じて、元の用量の1/3(キシラジンなし)のケタミンの1回維持用量を投与できます。.
3. 下顎骨と頬を引っ込めた状態で、舌を口の外にそっと置きます。
4. C+L+群のマウスの場合、70 μLのPSを舌背にピペットで移します(試験濃度の1つ)。照射前期間として、マウスを暗所環境に20分間維持する。この間、各動物の舌が口腔内に配置されたままで、光増感剤(PS)が摂取されるのを防ぎます。.
5. 光増感期間の後、舌を口から引き抜いて照明します。LEDデバイスを舌の背部に置き、37.5 J / cm² (現在のデバイスでは7分)で点灯します(図3)。
6. C+L-群の動物については、試験濃度の1つで70 μLのPSを舌背にピペットで移し、これらのマウスを暗所で27分間保持します。
7. C-L +群の動物(事前に光感作を行わずに光で処理)の場合、70μLの滅菌生理食塩水を舌の背部にピペットで移動します。マウスを暗所で20分間放置した後、37.5 J/cm² (本装置では7分)で舌を照らします。
8. C-L-群のマウス(PSでも光でも処理していない)の場合、70μLの滅菌生理食塩水を舌の背部にピペットで移し、暗闇で27分間保管します。
9. 治療後すぐにすべてのマウスの舌から C.アルビカンスを 回収します。滅菌綿棒で舌の背側を1分間綿棒で拭きます。
10. 各サンプルスワブを1 mLの滅菌生理食塩水を含むチューブに入れ、1分間ボルテックスして微生物細胞を再懸濁します。
11. ただちにPBSで10倍段階希釈を行い、25 μLのアリコートをSDAプレートに二重に播種します。プレートを37°Cで48時間好気的にインキュベートします。
12. 48時間後、デジタルコロニーカウンター( 材料表を参照)を使用して、酵母コロニー数を決定します。各動物の C. albicans 負荷量 (CFU/mL) を計算します。
13. CFU/mL の値を_{log 10} に変換し、実験計画とデータの仮定に従って適切に分析します。
    注:本調査では、Welchの一元配置分散分析とGames-Howellの事後検定(α = 0.05)¹⁶ を使用しました。

5. 病理組織学的解析

1. 8日目に、腹腔内注射により100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンを組み合わせてマウスに麻酔をかけ、ケタミンの過剰摂取(200 mg / kgを会膜内投与)で安楽死させます。呼吸運動の欠如(無呼吸)と心拍の欠如(収縮)をチェックして死亡を確認します。
2. 慎重に舌をつまんで動物の口から引き出します。手動メスを使用して、乳頭の周りを切開し、前部と中央部を傷つけることなく舌全体を外科的に除去します。
3. 舌を10%緩衝ホルマリン(pH 7.2-7.4)で24時間固定し、流水で2時間洗浄します。
4. パラフィンプロセスへの包含を進めます:脱水、清澄化、および含浸^10,14。
5. ミクロトームを用いて連続切片(厚さ5μm)を切断し、スライドガラスに貼り付けます。過ヨウ素酸-シッフとヘマトキシリン(PAS-H)を使用してこれらの切片を染色し、病理組織学的検査を行い、光学顕微鏡下での観察を通じて真菌を同定します。
6. 病理学者に、できれば研究対象群を盲検にして、 C.アルビカンス 感染による組織反応を調べるように依頼してください。
7. 組織(上皮および結合組織)の組織学的特徴、特にさまざまな強度の局所炎症反応について説明します。

OCのマウスモデルでは、感染したすべてのマウスの舌に典型的な白い斑点と偽膜が見られました(図4A)。C-L-動物から回収された C.アルビカン スは、この微生物による組織コロニー形成を確認しました(値は1.62 x 104 から4.80 x 105 CFU / mLの範囲でした)。予想通り、NCtr群の動物は、サンプリング後に組織の変化やコロニーの成長を示さなかった(図4B)。

aPDTは、クルクミノイドを光増感に80 μMで使用した場合、 C.アルビカンスの 生存率を低下させました(図5)。80 μM の PS 媒介 aPDT で達成された平均 log10 の減少は、C-L- 群(p = 0.008)と比較して 2.47 でした。

マウスの舌から回収した C.albicans コロニーの数は、照明なしでクルクミノイドを投与したマウス(C+L-群)、光で処理したが光感作をしていないマウス(C-L+群)、および未処理のマウス(C-L-群)の間で有意差はありませんでした(p ≥ 0.210)。

非感染動物の舌の組織学的特徴(NCtr)は、無傷の固有層、基底膜、糸状乳頭などの正常/健康な組織を示しました(図6A)。対照的に、C-L-群のマウスの舌の病理組織学的画像を調べると、真菌の浸潤はなかったが、上皮の角質化層内に酵母とフィラメントが存在することは明らかでした。基礎となる結合組織では、主に単核細胞によって媒介される軽度の炎症反応が観察され、糸状乳頭は顕著に存在しませんでした(図6B)。C+L-群とC-L+群のマウスの舌の組織学的解析では、同様の特徴が見られました。対照的に、80 μMのクルクミノイド媒介aPDTで処理したマウスの舌切片では、主に上皮の角質化層に限定された真菌細胞の数が減少していることが明らかになりました(図6C)。

図1:光増感剤の化学構造。 53.4%の天然クルクミンと46.6%の他のクルクミノイド(デメトキシクルクミンおよびビス-デメトキシクルクミン)を含む、光増感剤として使用される水溶性塩混合物の化学構造。最終的な平均分子量は 730.32 g/mol です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:口腔カンジダ症とaPDTのマウスモデルのプロトコルタイムライン。 口腔カンジダ症と抗菌光線力学療法(aPDT)のマウスモデルのプロトコルを概説するタイムライン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:光感作後のマウス舌の照明。光増感(感染組織と光増感剤のインキュベーション)後、青色(~455 nm)のLEDライトを用いて舌を37.5 J/cm2で照射した。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:マウス口腔カンジダ症モデルの白色病変。 (A)口腔カンジダ症のマウスモデルで観察された白色病変を描いた代表的な画像。(B)陰性(非感染)コントロール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:マウスの舌から回収した カンジダ・アルビカン ス。 データは、治療群±log10(CFU/mL)の平均値標準偏差を表しています。ウェルチの一元配置分散分析は、治療の効果がグループ間で統計的に有意に異なることを示しました(p < 0.001)。平均の横の異なる小文字(a、b、c)は、Games-Howell検定(p≤0.030)に従って統計的に有意な差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:マウスの舌の組織切片の代表的な画像。 マウス舌の組織切片をPAS-Hで染色し、画像を200倍で撮影しました。 (A)口腔カンジダ症、光増感、照明を誘発しないネガティブコントロールマウス(NCtrグループ)。(B)光増感もLED照明もばく露されていない口腔カンジダ症を誘発したマウス(C-L-群)。(C)80 μMのクルクミノイドと37.5 J/cm2のLED照明(C+L+80群)に曝露された口腔カンジダ症を誘発した動物。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:実験グループ。 本研究で利用した実験グループの一覧です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.