前臨床研究のための結紮誘発性歯周炎マウスモデルの最適化

サマリー

結紮誘発性歯周炎マウスモデルは、歯周病の研究において効果的かつますます人気のあるツールです。近位間歯槽骨破壊に焦点を当てたモデルの簡略版実装に関する詳細なガイダンスが示されており、実験室での研究設計、3Dプリントツールの作成、μCT解析を用いた骨定量が含まれます。

要約

マウスにおける結紮誘発性歯周炎の実験モデルは、歯周病の病因理解に根本的な役割を果たしてきました。しかし、翻訳的および治療的応用には十分に活用されていません。人間の病気と同様に、マウスの結紮誘発性歯周炎は、微生物、炎症、骨免疫学的な一連の明確な出来事を通じて発症します。結紮による歯槽骨破壊は比較的短期間で進行し、容易に定量化できるため、前臨床研究において費用対効果の高い疾患モデルとなっています。

古典的な結紮モデルの技術的課題を克服するため、簡略化された結紮誘発歯周炎マウスモデルの確立が策定されました。隣接する2本の歯の全周にわたって病気を誘発するのではなく、単純化された疾患モデルは、2本の後歯の近位部のみで炎症性骨破壊を中心としており、この領域は人間で一般的な歯周病が発症する領域でもあります。3Dプリントツールでリガチャルを配置しているため、この方法は迅速かつ効果的で、マウス1匹あたり5〜10分の手順時間で済みます。骨破細胞生成シグナル伝達は結紮後3日間で検出されますが、結紮後9日で骨破壊が一貫して発生します。

ここでは、研究設計に特有の重要な要素(すなわち、検出力計算、手順標準化、校正)、3Dプリントツールの開発(例:「マウスデンタルベッド」や「結紮ホルダー」)、μCT解析を用いた歯槽骨定量を強調することで、簡略化された結紮モデルプロトコルを詳細に説明しています。歯肉遺伝子発現である Rank、Rankl、Opgは 、破骨細胞形成のマスター調節三位元であり、治療効果の間接的な証拠として用いられています。本論文で提示された手法は、前臨床環境で革新的な歯周治療薬を試験するための簡略結紮誘発歯周炎モデルの実施を導きます。

概要

歯周病は複雑な炎症性プロセスで、歯肉、歯周靭帯、セメント質、歯槽骨などの歯を支える構造を破壊します。歯周骨の喪失が進行するには、歯肉バリアの破損と細菌の侵入、炎症細胞の動員、そして先天優位から獲得優位への移行が必要です^1。最終的な骨芽細胞と破骨細胞の不均衡は、その破壊による歯槽骨の喪失^{をもたらします。}歯周病と可逆的歯肉炎(歯肉炎)の診断を区別する特徴的な表現型所見は、歯槽骨の喪失です。したがって、歯を支える歯槽骨の量は前臨床環境における重要な治療成果となります。

単一の動物モデルは、異なる^{治療薬の開発}に必要なすべての生物学的側面を再現することはできません^3,4,5。結紮誘発性歯周炎マウスモデルは、比較的短期間(3〜9^日)で骨破壊を定量的に発生させるため、歯周炎の予防と調節のための新しい治療介入を検証するための費用対効果の高いモデルとなっています。第II相から第III相のヒト臨床試験6,7,8,9,10の開発に成功したにもかかわらず、マウスの結紮誘発性歯周炎は前臨床モデルとして一般的には利用されていません。結紮が歯を囲む古典モデルの技術的課題を克服するため、簡略化された結紮誘発歯周炎マウスモデル^11,12が確立されました。クラシックモデルの単純な修正は、歯の周囲ではなく歯の間にある骨破壊部位に焦点を当てています。この改良の利点は多岐にわたり、1) 人員訓練に必要な時間の短縮、2) 実験手順の技術的容易さ、3) 骨の定量の再現性の向上などです。さらに、この簡略化されたモデルの下で発生し現れるいくつかの微生物学的および免疫学的事象が、一般的な人間の歯^周病の現在の理解と一致していることが発見^{されました。}最後に、米国^2.14で以前報告された効果的な薬物誘発性骨損失予防は、新規歯周治療の主要側面を評価するための生体内ツールとして簡略結紮誘発歯周炎モデルの利用を支持しています。

簡略結紮誘発性歯周炎モデルの革新的な側面として、病気誘発プロセスをより容易に行う3Dプリントツールの開発が挙げられます^(11,12)。一部の人には直感的に感じられますが、研究者たちは3Dプリントツール¹⁵を組み立てられないと報告しており、これが動物実験の開始をさらに妨げたり遅れさせたりする可能性があります。本研究は、前回のプロトコル研究¹¹で示された情報を拡張し、簡易結紮誘発性歯周炎モデルの実験室での成功裏の実装を可能にする詳細な情報を提供します。この現在のプロトコルに含まれる詳細は、科学的発見の再現性の欠如に寄与する複雑な要因の一部^である。過去10年間にわたり、^{複数の研究}2,11,12,14,18および共同研究グループによる13,19,20,21で確認された一貫したモデル使用と信頼性の高い骨吸収は、科学コミュニティにおける再現性を促進するために詳細な情報を広める重要性を支持しています。

プロトコル

このプロトコルは動物研究:生体内実験報告(ARRIVE)ガイドライン^22,23に準拠しています。このプロトコルで記述されたすべての実験的手法は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のIACUCによって承認されています。

1. 実験設計

1. サンプルサイズの計算
   注:研究プログラムの翻訳的性質のため、ここで示す検出力の計算は8〜12週齢の野生型C57Bl6マウスの肺胞骨測定に基づいています。
   1. セメント質-エナメル質接合部と歯槽骨稜(CEJ-ABC)間の線形測定に基づいて骨を解析します。
      1. 健康なマウスの平均アタッチメントレベル(CEJ-ABC測定値)は0.2mmであり、結紮後9日時点で歯周炎のマウスはその2倍(CEJ-ABC距離0.4mm)となります¹¹。11番の結紮術後9日から18日経過しても、歯槽骨の減少は有意に増加しません。
      2. この効果量に基づいて検出力計算を行い、健康と疾患の違いを明らかにするために必要なマウスの数を特定します(ここでは合計8〜10匹[図1A])。
         注:パワーは2標本平均乗を用いて0.8から0.95のべき乗(α = 0.05)を達成するよう計算されました。グループ平均と標準偏差は 図1Bに示されています。
   2. 骨損失に対する治療効果を判断するには、別の検出力計算を行います。このプロトコルでは、実験群と対照群の両方で歯周炎を発症するため、健康マウスと病変マウスを比較する代わりに、骨損失調節を簡易結紮誘発性マウスモデルで検証する際に、1グループあたり19〜31匹のマウスを分けて再現性を確保しました(代表的な結果および 図1C参照)。
      注:検出力は上記のテストと同じ方法で計算されました。グループ平均と標準偏差は 図1Dに示されています。
2. 手順の標準化と人員の校正
   1. 研究開始前に疾患誘導および定量化に関わる全職員を訓練・校正(相互校正および校正内;r² ≥ 0.90)。
      注:結紮の位置と骨損失の定量化のトレーニングには2〜3か月の期間がかかると推定されています(表 1にタイムラインを示します)。その他の必要な手順 は表1のタイムラインとして示されています。
   2. 結紮の設置手順では、2名の訓練を受けた調査員が処置室で協力して作業します。主な研究者(内部および相互校正)は、固定を設置するオペレーターとして残ります。
   3. 2人目の調査員に手続きアシスタントとして働き、以下の手順を実行します。
      1. 記録的なマウスの重さ。
      2. ネズミを麻酔箱に入れてください。
      3. マウスに眼軟膏を塗ってから、操作員に渡して「マウスデンタルベッド」に入れます。
      4. ≥3個の「リガチャーホルダー」が適切にリガチャーを装填し、使用準備が整っていることを確認してください。
         注意:効率を高めるために、オペレーターが適切に装填した≥「リガチャーホルダー」を設置するのが理想的です。効率性(例:1マウスあたり5〜10分の手順時間)が推奨されており、1日に実施される実験数を増やし、バッチ効果の可能性を減らします。
      5. マウスモニタリング(施術前後)を行ってください。
         注:結紮誘発性歯周炎は非侵襲的・非外科的な処置で、人間の歯のフロスに似ています。結紮はマウスに軽度の不快感(主に2本の歯の間に細菌が蓄積するため)と予想されますが、鎮痛剤の使用は必要ありません。訓練を受けた専門家による結紮の後は合併症は期待されません。結紮後、すべての動物は2〜3日ごとにモニタリングされます。人道的な最終結果(例:グルーミングや給餌の失敗、起立・歩行困難、呼吸困難、壊死または感染した創傷)は承認された動物プロトコルに記載すべきですが、合併症が発生した場合は適切な対応について獣医スタッフに相談してください。

2. マウスの結紮歯周炎を誘発するための印刷ツールの開発

注:リガチャーの配置を最適化するために、マウスデン タルベッド と リガチャーホルダー と呼ばれる3Dプリントツールが開発されました。これらは複数の個別の3Dプリントパーツで構成され、それぞれ別々に印刷され、さらに手作業で組み立てられます。これらの装置の設計図仕様は以前に^公開 されており、経験豊富な調査員が個別のSTLファイルを作成するために利用できます。本研究の新しい装置は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のBeAMデザインセンターと共同で開発されました。材料は各コア施設を通じて入手するか、 補足ファイル1のSTLファイルを使って3Dプリントできます。

1. マウス歯床
   1. 3.0mmポリラク酸(PLA)フィラメントを使用した3Dプリンターで、標準印刷品質でマウスの歯科用ベッド(図2A)とリガチャーホルダー(図2B)を印刷します。歯科用ベッドは設計された向きで印刷し、他の部分は均一な平面をプリントベッドに対して下向きに配置します。 サポート素材 オプションを有効にするには、 サポート配置設定を有効にしてください。「 ビルドプレートに触れる」オプションを選択して、サポート材がまずビルディングプレートに接触していることを確認してください。
      注意: 補足ファイル1 の5つのSTLファイルを使用して、切り離されたチューブ、リガチャー(ノッチ付き)、マウスデンタルベッド(ノッチ付き)、蓋、リガチャーホルダーロックなど、必要なすべての要素を印刷してください。各項目の寸法については 材料表 を参照してください(設計図仕様は以前に示した¹⁰)。
   2. 印刷が終わったら、ワイヤーカッターやニードルノーズペンチ、その他の器具を使ってモデルの印刷支持部品をトリミングします。
      注意:この処置中は安全ゴーグルを着用してください。
2. マウス歯科ベッドアセンブリ
   1. マウスの歯科ベッドを準備するには、図3Aのようにすべての部品を配置し、接着剤を準備します(図3B)。
   2. 数滴の接着剤(図3C)を置き、図3Dのようにネジを取り付けます。再び、接着剤を塗布する部分に移す準備をしてください(図3E)。プリントチューブのスロット(図3F)を、トゲの端をマウスデンタルベッドから反対方向に向けてスライドさせます(ここにイソフルランを投与するホースが接続されます)。
   3. 頭部安定パーツは接着剤で固定します(図3F)。
   4. 余分な接着剤を拭き取り、挿入したすべてのパーツに軽く圧力をかけてしっかり固定します(図3F)。
3. リガチャーホルダーの調整
   1. 機構のロック/アンロック時の不快感を減らすために、リガチャーホルダーロックの外側部分(図4A)の四角い・鋭いエッジをすべて、15Cメスブレードハンドル(No.3、15Cブレード)で45°角度でわずかに面取りしてください。
   2. ロック機構をリガチャーホルダーにしっかりとフィットさせるために、15Cのメスブレードを使ってリガチャーホルダーロックの内部の丸みを角ばらせます(図4B-F)。
      注意:これによりロックはリガチャーホルダーに完全にフィットし、わずかな調整のみで済みます。
      1. 3Dプリントのトリミングツールや15Cのスカルペルブレードを使って、ほとんどの支持を外した後でも上下のエッジに残る「フラッシュ」を取り除き、エッジを45°でわずかに面取り(ステップ1のリガチャーホルダーロックに施した面取りに似ています)して、しっかりと合うロックを確保します。
         注意:あまり多くの素材を外さず、ロックが抵抗なくスライドできる程度にだけ取り除いてください。
   3. 細すぎる場合は、それぞれの先端の長さを切り詰めて、より厚い断面(少なくとも0.5mm厚)になるようにし、結びつけ時に口蓋に当たらないよう先端間に十分な隙間を確保します。切断後、先端が少なくとも3mmの長さであることを確認してください(図5A、「CUT」で示されています)。
   4. リガチャーホルダーの先端には、工具が印刷された「サポート」部分のフラッシュを外し、チップの側面が平らであることを確認してください(図5B、矢印)。
   5. 各先端の側面を45°の角度で切り取ると、結紮を積み重ねやすくし、軟部組織への外傷を防ぐために縁を柔らかくします(図5C、矢印で示されています)。
   6. リガチャーホルダーの各先端には、縫合糸シルクのリガチャーが収まる「V」字型の切り欠きが含まれていることを確認してください。もしステップ2.3.6で初期の印刷先端が薄すぎてこれが削除された場合は、印刷上で細かく仕上げるか再現してください。
      1. この「V」字型の切り欠きが見えたら、リガチャーホルダーをテーブルトップに平行に両端を置き、15Cのメス刃を切り欠きの根元に優しく差し込み、刃を左右に優しく揺らして刃の刃先が「V」字の根元に留まり、刃の側面が「V」字の上部壁に接触するようにします。刃を切り欠きの根元に置き、刃を先端の外側に慎重に角度付け、この動作を繰り返して外縁の「V」字型の切り欠きの根元を細かくし、縫合糸がよりスムーズに位置に導かれるようにします。
         注:この揺れ動きはフィラメントにちょうど良い動きを与え、フィラメントをどかして切り欠きを細かくしつつ、過剰な材料を取り除くことはありません。
      2. この「V」字型の切り欠きが見え ない場合は 、リガチャーホルダーをテーブルトップに垂直に両端を平らな場所に置きます。リガチャーホルダーの両端を真下に見ながら、15Cのメス刃を先端の中央に置き、意図的に浅い切り込みを入れて「V」字型の切り欠きの始まりを作ります。
         注意:両方の先端で刃を正しい位置に配置しようとするよりも、それぞれの先端で個別に行う方が簡単なことが多いです。
      3. 必要に応じてステップ2.3.7.2を繰り返し、メス刃の刃先が常に先端の中央の同じ場所に戻っていることを確認してください。
         注意:刃の刃が同じ場所に戻らないと、複数回の切断が行われ、その部分でフィラメント層が剥がれ始め、工具の性能が低下する可能性があります。
         注意:「V字型の切り欠き」の深さは、結びた縫合糸とシルクの結び目で定期的にテストし、結び目がしっかり固定されているか、またはずれ落ちるかを判断してください(さらなる調整が必要であることを示す場合があります)。ホルダーは、ノッチがビルドプレート上で下向きに、リガチャーホルダーロックが広い開口部がビルドプレートに接する向きに印刷されなければなりません。サポート素材は、サポート配置がビルドプレートに触れる設定に設定した場合に使用できます。
4. リガチャーホルダーの組み立て
   注意:改造が完了した後、リガチャーホルダーを組み立て、以下の点を確認してください。
   1. リガチャーが固定されたら、ロックがリガチャーホルダー(矢印で示されている図 6A には見えませんが、 図6Bで見られます)に糸をつまむようにしてください(可能であれば両方とも可能ですが、これは難しい場合があります)。
      注意:この摩擦により、縛りがずれないようにします。
   2. リガチャーホルダーの溝にリガチャーを通す際、先端からずれ続ける場合は溝を深くするか、先端の外側にさらに伸ばして「トラック」を作り、糸が収まるようにしてください。
   3. リガチャーホルダーの正面から見たとき、2つの結び目が中心に位置しているか(図6C)か、そして水平( 図6Dの直線)かを確認してください。そうでなければ、一方の溝がもう一方より深いことになります。
   4. 結紮が切り欠きのちょうど内側に収まっているか、深く収まっていないか確認してください。そうでなければ、結紮ホルダーの先端が軟部組織に接触し、結紮時に外傷を引き起こすリスクが高まります。
   5. デンタルエクスプローラー(図6E)を使い、結び目の間に優しい力を加えても結び目が滑ることなく元の位置に戻ることを確認します(これは結び目を置く際に受ける力をシミュレートします)。

3. 結紮の配置

注:結紮は、ヒト歯周病原体の添加の有無にかかわらず、マウスの歯の間に挿入されることが可能です¹¹。結合部位の微生物組成の時間依存解析(ヒト細菌種の補助なし)により、歯周炎発症時にマイクロバイオーム群落の変化(ディスバイオーシス)が見られることが示されました¹²。このため、結紮交換は結果の再現性に影響を与える可能性があるため推奨されません。結合と組み合わせて細菌種を含めるかどうかは、特定の研究で扱う問題に依存します。推定10〜15%の結^紮減少のため、結紮は1匹のマウスに両側に置かれます。この方法は実験中のマウスの損失を最小限に抑えます。

1. 吸入したイソフルランで麻酔した後、麻酔を施したマウスをマウスデンタルベッドに置き、背中をベッドにつけ、鼻を鼻コーンの近くに置きます。
   注意:マウスは4%(vol/vol)のイソフルランで麻酔を行うべきです。イソフルラン蒸気器と酸素は0.2μmの空気フィルターでろ過されます。マウスが完全に麻酔されマウス歯科ベッドに置かれたら、鼻のコーンを通る1.5〜2.5%の流量を維持します。マウスは無意識の身体動作と呼吸数(~55〜65回/分)で監視されます。結紮性歯周炎を発症したマウスには鎮痛剤の投与は不要で、これは非侵襲かつ非外科的な処置であり、人間の歯のフロスに似ています。結紮はマウスに軽度の不快感を与えると予想されます(主に2本の歯の間に細菌がたまるため)が、鎮痛剤の使用は必要ありません。訓練を受けた専門家による結紮の後は合併症は期待されません。
2. 輪轭でネズミの頭を安定させ、口を開けます。
   注:下顎切歯の周りのバンドは舌を引っ込める役割も果たし、顎を引っ張ることなく開くための受動的な張力です。光源を角度に合わせて照射することで、影が視野を遮らないようにすることで、奥歯の可視化が容易になります。マウス用歯科ベッドは、簡略化された結紮誘発性歯周炎マウスモデル向けに特別に設計されました。マウスの鼻とコーンの間の距離は、実験中にマウスが小さな身体の動きを持てるように必要です。このマウスの動きにより、リガチャーホルダー使用中の操作者の手の動きを適切に監視でき、リガチャルを置く際の力の量を制御できます。結紮の位置はマウス1匹あたり5〜10分で終わるはずです。動物実験を行う際は、換気の良いフード内で行うべきです
3. 右側にリガチャーを置くには、右手にリガチャーホルダー、左手にエクスプローラーを握ります。
   注意:結び目が先端の中心ではなく、どちらか一方の先端に近い場合、結び目は特定の側に配置する方が適している場合があります。例えば、結び目をリガチャーホルダーの右先端に近い位置に置くと、そのリガチャーは右側に置きやすくなります。
4. 探検器の先端を口蓋側の第一大臼歯と第二大臼歯の近接部の下に優しく置きます。
   1. エクスプローラーの先端をまず歯に触れさせ、その後滑らせて歯肉に当てて軟部組織に外傷を与えないようにします。適切な位置に置いたら、エクスプローラーハンドルを水平の角度で休めます。
   2. どちらのエクスプローラーの端が右側に使われ、どちらが左側に使われているかをメモしてください。エクスプローラーの先端が近位接触部に上向きに入り、シャンクの曲がりを反対側に横切るようにして、設置時の反作用から頭部を安定させます。
5. リガチャーホルダーを水平方向に使い、まず第2大臼歯と第3大臼歯の近接部の上にリガチャーホルダーを位置付け、縁を頬に押し当てて頬を動かし、次に第1大臼歯と第2大臼歯の近接部に位置付けて頬を引きます。
   注意:このステップは、粘膜が結紮部と歯の間に挟まって配置を妨げるのを防ぐのに役立ちます。
6. 結紮が第一大骨と第二大臼歯の近接部に位置したら、結紮ホルダーのハンドルを最大45°回転させ、優しく揺らしながらスライドさせながら、結びつきを接触部に押し込みます。
7. 余分な糸を切る:
   1. 細い針の鉗子で右側の結び目に付いている余分な糸を留め、糸を歯の左側に引っ張り、わずかに開いたハサミで糸に沿って滑らせて結び目から約1.5mm離れた位置に位置づけてから切ります。
      注意:これにより余分なものを切る際の誤った粘膜損傷の可能性を減らすことができます。
   2. 上記を逆にして、もう一方の結び目も同様に繰り返します。
8. 上記のステップを3.3のものに反映してください。3.7.2に。口の反対側に結紮を当てるとき。
   注:犠牲時の結紮は推奨されます。なぜなら、異なる実験条件によって不安定なシフトが変化する可能性がある^{からです。}採取を容易にするために、マウスをマウスデンタルベッドに入れ、結び目の一つを切り取ってから、鉗子で優しく隣接間を除去します。結紮採取中にマウスデンタルベッドを使用することで、マウスの適切な安定性と結紮部位へのアクセスのしやすさが可能となります。

4. 骨破壊の量化

1. μCT解析
   1. ソフトウェアを開き、「ファイル|」をクリックします 。画像をインポート...
   2. ポップアップメニューで「 Browse 」をクリックし、Dicomファイルがあるフォルダに行って1回目のファイルを選択してください。
   3. 「 Examine 」をクリックすると、同じスキャンサンプルに含まれるフォルダ内の他のファイルを見つけて選択できます。 OKをクリックします。
   4. 画像の読み込みが始まったら、「 Visualize 」と 「Isosurface」をクリックします。
   5. 画像の閾値を5,000に、表面品質率(%)を55に変更してください。
   6. 「画像スムージングを有効にする」と「現在のROIでクリップ表面を有効にする」とマークされたボックスにチェックを入れ、「更新」をクリックしてください。
   7. レベルプロパティを調整するには、下部のウィンドウ/レベル(図7A)を右クリックし、「ウィンドウ/レベルプロパティの編集」をクリックしてください。すべてのサンプルで標準的な骨密度値を選択します。このプロトコルに従うには、2,000個を使い、サンプルの骨密度に応じて変え、すべての測定で一定に保つようにしてください。
   8. 飛行機を操作するには:
      1. キーボードショートカットI /J/K を使って3つの異なる平面を非表示・表示してください。
      2. 右クリックしてカーソルを動かしてズームイン・ズームアウトします。
      3. Shiftキーを押してから左クリックでパンします。
      4. ス ライス をクリックすると平面を移動・回転させてください。
      5. 平面の中心をクリックして前後に動かすか、カーソルを目的の平面の中央に置き、上下矢印キーで1スライスずつ移動できます。
      6. 平面の端をクリックすると、その辺に平行な線を中心で回転します。
      7. 平面の角をクリックすると、その平面の周りを回転します。
   9. z軸(画面上部の青いペイン-zスライス)を配置し、3本すべての歯の表面や形状が同時に(またはできるだけ近い位置で)見えるようにします(図7B)。
   10. 同じ平面(画面Zスライスの上部の青いパネル)をスクロールして、第^{1・第2大臼}歯の根が見えるようにします(図7C)。根の下の方に十分位置があり、周囲の解剖学が見えるだけでなく、管がはっきりと一直線に見える点を選ぶようにしましょう。
       注意:運河を垂直方向に配置するために平面を回転させる必要がある場合があります。
   11. x軸(zスライスパネルの縦の緑線)を第^1大臼 歯と第^2大臼 歯の頬根に合わせるように配置してください(可能であれば各根管の中心部を通るようにしてください。そうでなければ、第^1臼歯 の頬根と第^2大臼 歯の遠口側の根に沿って合わせてください)(図7D)。
   12. xスライスの向きを基準にyスライス(xスライスパネル内の縦の青い線)のアライメントを判断してください。
       1. yスライスをxスライスパネルの第一大臼歯の根を垂直に平行に合わせます(図7E)。平面を回転させて根を垂直に向きます。青い線が根の中央を横切っているのに注目してください。
          注:骨の喪失が見られる領域(このモデルで予想される通り)では、歯槽稜に欠損があることがあります。したがって、周囲の骨が存在しない可能性があるため、根の正中線を推定する必要があります。
   13. Yスライスパネルでは、セメントエナメル接合部(CEJ)から歯槽骨稜(ABC)までの距離を測定します。カーソルを溝の最も深い点に置き、CEJの1を押してから、ABCの最も近い点にカーソルを置いて2を押して測定します(図7F参照)。1^点目は青い矢印で、2点目は緑の矢印で示されます。
       1. 矢印が両方のポイントを選択しない限り表示されない場合は、矢印を希望の領域にカーソルし、キーボードの数字キーを押して選択します。マウスをクリックするだけでは動作しません。
       2. CEJの特定が難しい場合は、上下矢印キーを使って隣接するスライスをスクロールして位置を確認してください。
       3. 「最も近い点」が判別しにくい場合は、ABCの複数の点を測定し、測定にほとんどまたは全く差がないことを確認します。
          注:正しい測定が取られていることを確認するには、xとzのスライスが目的の根の上で交差しているのを確認し、平面を隠すことで3Dビューで測定値を視覚的に確認できます(図7F)。
2. Rankl/OpgおよびRankl/Rankの歯肉発現定量化
   1. 前述の歯肉組織を採取する⁹.
      注:最良のRNA抽出結果は新鮮な組織サンプルで得られ、RNA精製はできるだけ早く処理する必要があります。
   2. 参照キットとセラミックビーズを用いてビーズビーディングで歯肉組織RNAを抽出します。キットの指示に従い、 qRT-PCRによる分析まで-80°Cでサンプルを保存してください。

結果

a、WTマウスのベースライン(健康状態)および結紮後9日時の線形歯槽骨測定の代表的なデータ解析を図 1Aに示しています。検出力計算によると、主な結果がμCTで測定された線形骨レベルであれば、これらのグループ間の差異を検出するには合計10匹(グループあたり4〜5匹)のマウスが必要です(図1B)。しかし、前臨床試験の検出力計算では、両グループのマウスが歯周炎を発症しつつ、一方のグループに治療的介入が行われる必要があります(図1C)。この種の研究では、グループあたり19〜31匹とマウス数がより多く必要です(図1D)。前臨床試験で必要な動物の数が多い主な理由は2つあります。1) 両群で疾患が誘発される一方で、一方のグループに実験的介入が適用され、結果の分散が増加し再現性に影響を与えること、2)

ディスカッション

本研究は、^{以前に提示}された簡略結紮誘発性歯周炎マウスモデルプロトコルに関する洞察に満ちた情報と詳細な段階的なガイダンスを提供します。本論文に含まれる詳細は再現性に大きな影響を与える可能性があり、この特定の結紮誘発性マウスモデル11,12,13,18,19,21に関するグループの経験によって裏付けられています。3Dプリントツールの設計、開発、組み立てに関する詳細説明と、骨破壊を定量化するためのステップバイステップガイドも提供しています。ここに記載された情報は、簡素化された結紮誘発性歯周炎マウスモデルを、将来の治療介入開発のための費用対...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブレード	インテグラ	4-315C	15Cブレード
セラミックビーズ	VWR	10158-608	0.5 mL x 1.4 mm セラミックビーズ
接着剤/樹脂素材	ゴリラグルー社	8401519
リガチャーホルダー(ノッチ付き)	UNCチャペルヒル校 BeAMデザインセンター施設のコア	該当しません	118.01 mm x 13 mm x 13.74 mm
リガチャーホルダーロック	UNCチャペルヒル校 BeAMデザインセンター施設のコア	該当しません	17.5 mm x 14.57 mm x 17.8 mm
Lulzbot mini v1.0 3Dプリンター	Lulzbot(ファーゴ・アディティブ・マニュファクチャリング・イクイクイップメント3D, LLC)	該当しません	Aleph Objects, Lulzbot Mini v1.0 モデル
MicroViewソフトウェア	パララックス革新	2.5.0-3139	骨の測定に使われるソフトウェア
マウス用歯科ベッド(切り欠き付き)	UNCチャペルヒル校 BeAMデザインセンター施設のコア	該当しません	103.86 mm x 196.85 mm x 50.99 mm
マウスデンタルベッドトップ	UNCチャペルヒル校 BeAMデザインセンター施設のコア	該当しません	99.8 mm x 77 mm x 21.5 mm
ポリラクティック酸(PLA)フィラメント	逐語的に	55259	3.0 mm PLA
ラピュアRNA組織キット	MPバイオメディカル	112721050
メスブレードハンドル	バード・パーカー	371030	15Cメスブレードハンドル
縫合絹	ロボズ外科機器	SUT-15-1
Taqman qPCRプライマー	サーモ・フィッシャー	ランク(Mm00437135_ m1)、ランクル(Mm00441906_ m1)、Opg(Mm00435452_ m1)、ガプド(Mm99999915_g 1)
VX-765	インビボジェン、サンディエゴ、アメリカ合衆国	#inh-vx765-1	宿主調節に用いられるカスパーゼ1阻害剤