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方法論記事

バイオリファイナリーアプローチによる紅海藻 Gracilaria gracilis の価値化

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DOI:

10.3791/65923

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2023年11月21日

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1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

この記事について

サマリー

ここでは、 Gracilaria gracilisの統合的な価値化を目的としたいくつかのプロトコル(野生種の収穫、自社栽培、生物活性成分の抽出)について説明します。抽出物の抗酸化作用、抗菌作用、細胞毒性作用が評価され、海藻バイオマスと色素が豊富に含まれた食品の栄養と安定性の評価も行われます。

要約

海藻は、貴重でマルチターゲットの生物活性成分を得るための豊富な原料として、継続的に高まっています。本研究では、化粧品、薬理学、食品、飼料用途の寒天やその他の原料の供給源として商業的に利益を得るために世界中で養殖されている食用紅海藻である Gracilaria gracilisの可能性を探ります。

G. gracilis の生育条件は、栄養繁殖と胞子形成によって最適化され、物理化学的条件を操作して大量のバイオマスストックを達成しました。エタノールと水を用いた緑色抽出法は、海藻バイオマスに対して実施されました。抽出物の生理活性の可能性は、細胞毒性、抗酸化性、および抗菌特性に関する一連の in vitro アッセイを通じて評価されました。さらに、乾燥海藻バイオマスをパスタの配合に取り入れ、食品の栄養価を高めました。 また、G. gracilis から抽出した色素は、天然着色料としてヨーグルトに配合され、その安定性が評価されました。どちらの製品も、市場に出る前に最高の最終処方を達成することを目指して、半訓練された官能パネルの評価に提出されました。

結果は、 G. gracilis がバイオマス全体、抽出物および/または色素として適用されるかどうかにかかわらず、その多様性を裏付けています。この作業は、いくつかの最適化されたプロトコルを実装することで、食品、化粧品、水産養殖市場に利益をもたらす可能性のある製品の開発を可能にし、環境の持続可能性とブルーサーキュラーエコノミーを促進します。

さらに、バイオリファイナリーのアプローチに沿って、残留海藻バイオマスは植物成長のためのバイオスティミュラントとして使用されたり、ポルトガルのレイリアにあるMARE-Polytechnicの社内養殖システムの水質浄化に使用される炭素材料に変換されます。

概要

海藻類は、医薬品、食品、飼料、環境分野で利益を得るための興味深い天然原料と見なすことができます。それらは、関連する生物学的特性を持つ、陸生生物には見られない多くの分子を生合成します1,2。しかし、大量のバイオマスストックを確保するためには、海藻に最適化された培養プロトコルを実施する必要があります。

養殖方法は、海藻の性質と全体的な形態を常に考慮する必要があります。 Gracilaria gracilis はクローン分類群であり、付着器官は複数の栄養軸を生成します。このようにして、断片化による伝播(栄養繁殖)が達成され、これらの軸のそれぞれが主葉状体3から独立した生命を完全に採用することができる。クローン分類群は、葉状体を小さな断片に分割することで大量のバイオマスが得られ、それが急速に再生し、遺伝的に同一の新しい個体に成長するため、単純で迅速なワンステップ培養方法とうまく統合できます。このプロセスでは、ハプロンティックタリーとディプロンティックタリーの両方を使用できます。この属は複雑なハプロ-ディプロンティック同型三相性生活環を示すが、改良作物を達成するために株の遺伝的更新が必要な場合を除き、胞子形成はめったに必要ではない。この場合、四胞子(減数分裂によって形成されるハプロン胞子)と手肉胞子(有糸分裂によって形成される双発胞子)の両方が巨視的なタリーを生じさせ、栄養繁殖によって成長および繁殖することができる4。成長サイクルは、着生植物の出現や他の生物の付着などの他の生物学的要因の中でも、環境条件と個体の生理学的状態によって決定されます。したがって、高い生産性を確保し、良質なバイオマスを生産するためには、生育条件の最適化が不可欠です5。

G. gracilisを含む海藻からの生理活性化合物の抽出は、さまざまな方法で達成できます6,7。抽出方法の選択は、対象化合物、目的とする用途、海藻の特性によって異なります。本研究では、海藻バイオマスから水やエタノールなどの緑色溶媒を用いて生理活性物質を溶解・抽出する溶媒抽出に着目しました。抽出は、多用途で効果的な方法でマセラシオンによって行うことができ、幅広い化合物に使用できます。これは、バイオマスを溶媒に長時間浸す、通常は室温またはわずかに高温で行う、シンプルで広く使用されている方法です。溶媒を攪拌して、抽出プロセスを強化します。所望の抽出時間の後、溶媒は濾過または遠心分離によって固体材料から分離される。

水は、その安全性、入手可能性、および幅広い食品との適合性により、食品用途で一般的に使用される溶媒です。水抽出は、多糖類、ペプチド、特定のフェノール類などの極性化合物に適しています。ただし、非極性化合物を効果的に抽出できない場合があります。エタノールは、食品用途でも広く使用されている溶媒であり、フェノール化合物、フラボノイド、特定の色素など、さまざまな生理活性分子の抽出に効果的です。エタノールは一般的に食品に安全に使用できると認識されており、簡単に蒸発して抽出された化合物を残します。抽出方法の選択では、効率、選択性、費用対効果、環境への影響などの要因を考慮する必要があることは注目に値します。溶媒濃度、抽出時間、温度、圧力などの抽出パラメータの最適化は、 G. gracilis やその他の海藻由来の生理活性化合物の最適な収量を達成するために重要です。

海藻類は、細菌、真菌、ウイルスなど、幅広い微生物に対して抗菌活性を示すことがわかっています8。この活性は、フェノール類、多糖類、ペプチド、脂肪酸などの生理活性成分に起因します。いくつかの研究は、 大腸菌、 黄色ブドウ球菌、 サルモネラ 属菌、 緑膿菌などの病原体に対する有効性を実証しています9。海藻の抗菌活性は、微生物の細胞壁、膜、酵素、およびシグナル伝達経路を妨害する可能性のある生理活性化合物の存在に起因します10。これらの化合物は、微生物の増殖を阻害し、バイオフィルムの形成を阻害し、免疫応答を調節する可能性があります。

紅海藻は、シャク植物とも呼ばれ、さまざまな微生物に対して抗菌活性を示すことができる藻類のグループです。このグループ内では、 G. gracilis には、報告されている抗菌活性に寄与する可能性のあるさまざまな生理活性化合物が含まれています。特定の分子はさまざまですが、 G. gracilis で報告され、抗菌特性を持つ可能性のある一般的なクラスは、多糖類、フェノール類、テルペノイド、および色素です11。ただし、これらの成分の存在と量は、海藻の収集場所、季節性、タリーの生理学的条件、環境条件などの要因によって異なる可能性があることに注意することが重要です。したがって、 G. gracilis の抗菌化合物の特定のクラスと濃度は、それに応じて異なる場合があります。

G. gracilis は、フリーラジカルを除去し、酸化ストレスを軽減することが示されているさまざまなフェノール化合物を含む抗酸化特性を保持することもわかっています12。抗酸化物質は、活性酸素種によって引き起こされる損傷から細胞を保護するのに役立ち、潜在的な健康上の利点があります。抗酸化能は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)フリーラジカル捕捉活性など、さまざまな方法で直接評価でき、間接的には総ポリフェノール含有量(TPC)の定量化を通じて評価できます13。

成分は顕著な生理活性を有すると報告されていますが、その細胞毒性評価は、生きた細胞や組織と接触して使用される天然および合成物質を評価するために不可欠です。細胞毒性の測定にはいくつかの方法があり、それぞれに利点と限界があります。全体として、それらは、細胞に対する多くの物質の有害な影響を評価すると同時に、細胞の損傷と死のメカニズムを調査するためのさまざまなオプションを提供します14。

この研究では、Mosmann (1983)15によって導入された比色法である3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイを使用します。この方法は、代謝活性細胞によるテトラゾリウム塩の紫色のホルマザン生成物への還元を測定します。ホルマザン結晶の量が多いほど、生細胞の数が多くなり、細胞毒性の間接的な測定値が得られます14。この研究では、 G. gracilis の水とエタノール抽出物を皮膚化粧品の製剤に組み込むことを意図しているため、 in vitro 細胞毒性評価はケラチノサイト(HaCaT)細胞株で行われます。

食品用途に関しては、海藻は一般的に低カロリーで、食物繊維、必須元素、アミノ酸、多糖類、多価不飽和脂肪酸、ポリフェノール、ビタミンが豊富です2,16。G. gracilisも例外ではなく、興味深い栄養価を持っています。Freitas et al. (2021)4 は、養殖された G. gracilis は、野生の海藻と比較して、タンパク質とビタミン C のレベルが高く、総脂質のレベルを維持することを発見しました。これは、栄養学的に言えば、野生資源の開発よりも生産が好ましいため、経済的および環境的利点を表す可能性があります。さらに、消費者は自分が食べる食品の種類にますます関心を持っているため、食品を豊かにするための新しい成分を導入し、新しいリソースを使用して、製品に付加価値を与え、「クリーンラベル」を主張できる抽出物を入手することが重要です。その上、現在の市場は非常に競争が激しく、メーカーを競合他社と差別化するための新製品と革新的な戦略の開発が必要です17。

パスタなどの栄養価の低い商品に海藻などの水産資源を豊富に含め、新たな食品として導入する戦略であり、栄養価の異なる商品による市場の差別化戦略です。一方、 G. gracilis はフィコビリタンパク質18などの天然赤色色素の供給源であり、食品産業への応用が期待されています。この海藻はいくつかの分野で高い関心を示しており、その適用は海藻全体、抽出物、および/または残りのバイオマスを使用して行うことができます。この作業では、そのようなアプリケーションの例をいくつか示します。

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プロトコル

1. バイオマスの収穫と調製

  1. G. gracilisの標本は干潮時に収穫し、乾燥、光、空気への暴露を避けるために、暗くて冷やした箱に入れて実験室にすばやく輸送します。
  2. 実験室では、各葉状体を流水で洗浄し、完全に洗浄して、破片、壊死部分、着生植物、およびその他の生物を表面から取り除きます。
  3. 野生バイオマスを常時曝気した海水(31-35 psu)中の気候室(20±1°C)で、日光、涼しい白色、蛍光灯、日長を16:08(明:暗)に設定して7日間保管します。この期間中は、栄養培地を供給しないでください。これにより、海藻は新しい室内条件にゆっくりと順応することができます。

2. 在庫管理

  1. 馴化期間の後、海藻の健康な先端を滅菌刃で切ります。Redmond et al. (2014)19 に従い、無菌条件下で、ペトリ皿(1.0%の細菌学的寒天培地、蒸留水/海水比1:1)で事前に調製した寒天ゲルに各チップを通し、残っている汚染物質を除去します。各チップに対して寒天ドラッグを3回実行し、常に寒天ゲルの未使用部分にチップをドラッグします。
  2. ガラス器具を塩酸溶液(HCl、15%)で酸洗浄し、蒸留水で十分にすすいでください。洗浄工程で使用するすべての工具、ガラス器具、寒天、海水、蒸留水をオートクレーブ(121°C、15分)で滅菌します。
    注意: サプライヤーから提供されたHClの安全データシートを参照してください。
  3. Redmond et al. (2014)19によると、チップは35 psuの滅菌海水で成長し、紅海藻用に修飾されたフォン・ストッシュ濃縮溶液(VSE)を添加した。二酸化ゲルマニウム(GeO2)を培地(1 mL/L)に添加し、着生珪藻の増殖を防ぎます。
    注意: サプライヤーから提供されたGeO2 の安全データシートを参照してください。
    注意: 部分的または全体的な変色によって観察される色素沈着の喪失を示すチップは、ストレスを受けているか、すでに死んでいるため、廃棄する必要があります。

3. 栽培とスケールアップ

  1. 馴化期間後、20±1°Cに設定された気候室で、約8〜10個の健康なチップを250mLの平底フラスコにランダムに分配し、20±0.5μmol光子m-2 s-1 (1500ルクス)、16時間:8時間(明:暗)に設定した日長、および毎週更新されるVSE培地で濃縮された滅菌海水。
  2. 毎週の体重測定を行い、タリーに過度に負担をかけないようにします20。このためには、培地からチップを慎重に取り出し、静かにすすぎ、実験室スケールでミリグラムの重量を量ります。
    注:この手順は、培養培地の毎週の更新と一緒に実行できます。
  3. タリは、これらのフラスコ内で最大2 g / Lの密度まで成長する可能性があります。この時点で、レシピエントのスケールアップ(250 mL、1 L、5 L)を行います。容量が5Lに達したら、培養液を50L以上の屋外の開いた白い容器に移します。
  4. Patarra et al. (2017)21 に従って相対成長率 (RGR) を計算します。
    RGR (% fw/day) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    ここで、IWとFWはそれぞれグラム単位で表される最初と最後の生鮮重量であり、tは日単位の時間です。
    注:この実験室のセットアップでは、RGRは1日あたり最大21%の値に達します。バイオマス収穫はいつでも行うことができます。バイオマスは、使用目的に応じて、オーブン乾燥、凍結乾燥、または単に冷凍保存(-20°C)のいずれかによって、分解を防ぐために迅速に処理する必要があります。乾燥したバイオマスは、室温(RT)で保存することも、冷凍保存することもできます。

4. 抽出手順

注:G. gracils抽出物のin vitro細胞毒性、抗酸化性、および抗菌性を評価するために、その調製では、抽出温度と溶媒の種類という2つの異なるパラメータが考慮されます。

  1. 抽出を行うには、 G. gracilis バイオマスをオーブン乾燥し、粉末が200μmのふるいを通過するまでバイオマスを粉砕します(家庭用コーヒーグラインダーなど)。
  2. 乾燥バイオマス(10g)を秤量し、100mLの溶媒(無水エタノールまたは滅菌水)に溶解します。
  3. 光から保護された容器で30分間攪拌します。
  4. 室温、40°C、70°Cで水>エタノール抽出および水>エタノール抽出を連続して行います。
  5. 各温度について、エタノールと水で別々に2回抽出を行います。
  6. 濾紙(Whatman No.1)でろ過して残りのバイオマスから液体抽出物を分離し、続いて室温で8000 x g で10分間遠心分離します。
  7. 残りの藻類バイオマスは、他の溶媒でさらに抽出するために再利用します。サンプルを最初にエタノールで抽出した場合は、次に水で抽出し、その逆も同様です。
  8. 水性抽出物を凍結乾燥し、40°Cのロータリーエバポレーターでエタノール抽出物を蒸発させます。
  9. 乾燥抽出物は4°Cで保存します。
  10. 抽出物を50 mg/mL(抗菌アッセイ)または10 mg/mL(抗酸化アッセイ)の濃度で溶解します。水性抽出物を滅菌水に溶解し、エタノール抽出物を無水エタノールに溶解します。

5.抗菌活性

注:エタノール抽出物と水性抽出物は、 枯草菌(Bacillus subsp . spizizenii )(DSM 347)、 大腸菌 (DSM 5922)、 およびListonella anguillarum (DSM 21597)に対して個別に試験する必要があります。抗菌薬検査は、National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS、2012)22の推奨事項に従って実施する必要があります。すべての培養物は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)から入手しました。 L. anguillarum は、1%塩化ナトリウム(NaCl)を添加したトリプシン大豆ブロス(TSB)またはトリプシン大豆寒天(TSA)で増殖しました。残りの2株はLB培地(VWRケミカルズ)で増殖させた。枯草菌(Bacillus subsp . spizizenii )(DSM 347)および Listonella anguillarum (DSM 21597)の培養物は30°Cでインキュベートし、 大腸菌 (DSM 5922)は37°Cでインキュベートしました。ブロス微量希釈法は、液体培地中の抗菌活性の測定に使用でき、これはミクロスケールで実施し、抗菌ポテンシャルを迅速かつ効率的に決定できるようにする必要があります。この低コストの方法は、わずか24時間で結果を得ることができるため、特定の微生物株に対して、成長阻害作用の観点から結果を得ることができる最良の抽出条件を早期に決定するのに適しています。ただし、この方法論では、微生物の増殖に特異的な蓋を備えた滅菌マイクロプレートの使用と、600 nm波長用のマイクロプレートリーダーの可用性が必要です。

  1. 170 μL の Muller-Hinton Broth (MHB) を添加し、10 μL の標準化接種物 (0.5 McFarland 標準試料) と 20 μL の各抽出物 (50 mg/mL) を接種した、未処理の丸底 96 ウェルマイクロプレートを使用して、ブロスの微量希釈試験を実施します。
  2. プレートを各菌株に最適な温度で24時間インキュベートします。
  3. 0時間および24時間でマイクロプレート分光光度計で光学濃度( OD600)を記録して測定した可視濁度の減少により、抗菌活性を検出します。
  4. 結果を阻害のパーセンテージで表す:
    figure-protocol-1
    ここで、Abs. ext は、抽出物の存在下で増殖する細菌株を含むウェルで測定された吸光度の差 (0 時間から 24 時間の間) であり、Abs は、細菌株と溶媒を含むウェルで測定された同じ測定値を指します。
  5. この方法では、ネガティブコントロールとなる培地のみを含むウェルだけでなく、溶媒(エタノールまたは水)に添加した標準菌株を接種した培地と、細菌株とポジティブコントロール抗生物質(クロラムフェニコール)を培地で接種したウェルを含む対照反応を含めます。

6. 抗酸化作用と総ポリフェノールの定量

  1. 総ポリフェノール含有量
    注:総ポリフェノール含有量(TPC)は、Folin-Ciocalteu法23 を使用して実施され、マイクロスケールに適合しています。
    1. 光から保護した96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、158 μLの超純水、2 μLのサンプル、および10 μLのFolin-Ciocalteu試薬を加えます。
      注意:サプライヤーから提供されたFolin-Ciocalteu試薬の安全データシートを参照してください。
    2. 2分後、30μLのNa2CO3(20%)を添加する。
    3. 室温で暗所で1時間インキュベートした後、サンプルを755 nmで分光光度法で測定します。
    4. 没食子酸(検量線をプロットできる)または超純水(2 μL)をコントロールとして使用します。
    5. 結果は没食子酸当量(mg GAE/g抽出物)で表します。
  2. 2,2ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカル捕捉活性
    注:抽出物の抗酸化活性は、Duan et al.(2006)24によって記述されているように評価され、マイクロスケールに適合しています
    1. 光から保護された 96 ウェルマイクロプレートに、各サンプル 2 μL(濃度 10 mg/mL)と無水エタノール(0.1 mM)に溶解した DPPH 198 μL を入れます。
      注意: サプライヤーから提供されたDPPHの安全データシートを参照してください。
    2. 暗闇のRTで30分間反応を実行します。マイクロプレート分光光度計で517nmの吸光度を測定します。
    3. 2 μL の無水エタノール/蒸留水と 198 μL の DPPH 溶液でコントロール反応を行います。抽出物2 μLと無水エタノール198 μLでブランク測定を行います。
    4. 結果は、次の式を使用してDPPH阻害の割合として表されます。
      figure-protocol-2
      ここで、Asは藻類抽出物の吸光度、Abはブランクサンプルの吸光度、Acはコントロールの吸光度です。

7. 表皮細胞における細胞毒性評価

注:G. gracilisの水性およびエタノール抽出物のin vitro細胞毒性効果は、前述のようにMTT比色アッセイを通じてヒトケラチノサイト(HaCaT細胞-300493)で評価されます25。細胞はCell Lines Services, Germany(CLS)から入手し、この方法は施設のガイドラインおよびCLSの指示に従って実施しました。
注意: サプライヤーから提供されたMTTの安全データシートを参照してください)

  1. 細胞培養の維持
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質/抗真菌剤溶液(アムホテリシンB、0.25 mM、ペニシリン、60 mM、ストレプトマイシン、100 mM)を添加したダルベッコ改変イーグル高グルコース培地(DMEM)でHaCaT細胞を培養します。
    2. トリプシン-EDTAを使用して細胞を解離します。
      注:HaCaT細胞の継代培養は、細胞が全合流に達した後に行われます。
    3. 37°C、5%CO2 、湿度95%のチャンバーで細胞を培養します。
    4. 培養が80%〜85%のコンフルエンスに達するたびに、バイオバンクの指示に従って細胞を継代培養します。
  2. 細胞毒性評価
    1. 細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、HaCaT細胞(4 x 104 細胞/ウェル)をDMSO(100 mg/mL)に溶解した乾燥抽出物で処理します。次に、抽出液2 μLを培地198 μLに加え、プレートを24時間インキュベートします。
    2. 培地を除去し、100 μLのMTT(0.5 mg/mL)を細胞に加えます。細胞を上記の通常の培養条件で暗所で30分間インキュベートします。
    3. MTT溶液を除去し、細胞内ホルマザン結晶を100μLのDMSOで可溶化します。
    4. マイクロプレートリーダーを使用して570nmの吸光度を測定します。結果をコントロールの未処理細胞のパーセンテージとして表します。

8. フード・イノベーション

  1. 新食品:海藻パスタ
    1. 材料の選択とパスタの配合
      注:材料の選択は、パスタ会社と共同で行われました。主要食材(セクション8.2で説明)の選択は、アクセスのしやすさと既存の生産ラインとの互換性を考慮して行われ、海洋資源を使用して栄養価の高いパスタを入手しました。
      1. 成分を選択したら、スプレッドシートを使用して製剤の理論化学組成を分析し、意図した栄養価(食物繊維、ビタミン、ミネラル元素の供給源、低飽和脂肪)に従って配合を設計します。
      2. 理論上の要件が満たされたら、ステップ8.1.2で説明されているように、ラボスケールの生産に進みます。
      3. 半訓練されたパネル(>10人のテイスター)で官能試験を実施し、次のステップで再調合の必要性または調合の受け入れを検証します。
        注:パネルは以前にパスタの試飲について訓練を受けており、風味、味、匂い、食感、外観などの属性に関して提示された配合を快楽的に評価しました。
    2. パスタ製造
      注:パスタ押出機を使用して Chifferi パスタサンプルを製造します。
      1. 装置で、米粉、 G.グラシリス、 クロレラ尋 常性クロレラの事前に定義された部分を混合し、混合物に約30%の水を加えます。
      2. 乾燥パスタを得るには、 Chifferi を68°Cで42分間乾燥させ、続いて76°Cで5時間30分間乾燥させ、工業プロセスをシミュレートします。
      3. 最後に、サンプルを梱包して真空シールし、さらに分析するまで室温の暗い場所に保管します。
    3. 栄養分析
      注:栄養プロファイル分析には、乾燥および浸軟したサンプルを三重に使用してください。
      1. 粗タンパク質含有量:Duarte et al.(2022)26から適応したKjeldahl法により、ステップ8.1.3.2-8.1.3.6に従って総タンパク質アッセイを実行します。
      2. 1.0gのサンプル(またはブランクアッセイ用の蒸留水)を正確に秤量し、消化チューブ内で2つのケルダール錠と25 mLのH2SO4 と混合します。
        注意: サプライヤーから提供されたH2SO4の安全データシートを参照してください。
      3. ケルダール消化槽で220°Cで30分間、続いて400°Cで90分間サンプルを分解します。
      4. 室温まで冷却した後、80mLの蒸留水を加え、形成したアンモニアをブロモクレゾールグリーンおよびメチルレッドを含む4%H3BO3溶液30mLに蒸留する。このステップは、アルカリ性条件下で行われます(ケルダール蒸留器を使用して40%NaOHで蒸留します。
        注意: サプライヤーから提供されたブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、および40%NaOHを含むH 3 BO3溶液の安全データシートを参照してください。
      5. 灰色がかったピンク色への色の変化が観察されるまで、蒸留サンプルをHCl 0.1 Mで滴定します。
      6. サンプルの窒素含有量で表される粗タンパク質含有量を計算し、次の式を使用して100 gあたりのgとして表します。
        figure-protocol-3
        ここで、Vs はサンプル滴定に使用されるHCl容量(mL)に対応します。Vb はブランクで使用される体積に対応します。N は HCl 正規性に対応します。wは試料重量(g)に相当します。
      7. 総脂肪含有量:Folch et al.(1957)27から適応したFolch法を使用して、手順8.1.3.8-8.1.3.14に従って総脂肪含有量を決定します。
      8. CHCl3 と MeOH を 2:1 (v:v) の割合で混合して Folch 試薬を調製します。
        注意:サプライヤーから提供されたFolch試薬の安全データシートを参照してください。
      9. 1 gのサンプルが入った試験管には、5 mLのFolch試薬と0.8 mLの蒸留水を加えます。渦の中で1分間混ぜます。
      10. 次に、さらに 5 mL の Folch 試薬を加えて 5 分間ホモジナイズし、1.2 mL の 0.8% NaCl 溶液を加えて 2 分間ホモジナイズします。
      11. サンプルを 7000 x g で 10 分間遠心分離します。有機相(下相)を親水性綿と無水硫酸ナトリウムでろ過し、丸底のガラスフラスコに入れます。
      12. サンプルの損失を避けるために、5 mLのCHCl3の添加、均質化、遠心分離、およびろ過のステップを同じ条件で繰り返します。
      13. 低圧蒸発により回収した有機相から有機溶媒を除去し、105°Cのオーブンで4時間放置する。デシケーターでサンプルを冷却します。
      14. 次の式を使用して、100 gあたりのgとして表される脂肪含有量を計算します。
        figure-protocol-4
        ここで、W1 は空の丸底ガラスフラスコの重量です。W2 はサンプルの初期重量です。W3 は、試料重量を有する丸底ガラスフラスコである。
      15. 粗繊維含有量:ISO 6865(2000)28から適応された方法論を使用して、手順8.1.3.16-8.1.3.22に従って粗繊維含有量を決定します。
      16. サンプル(W0)1gをフィルター底付きのガラスるつぼ(基準P2)に秤量し、ファイバー分析装置に入れます。
      17. 最初のステップは酸加水分解です:予熱した1.25%H2SO4の150mLと2mLの消泡剤(n-オクタノール)を各るつぼのカラムに加えます。沸騰するまで加熱し、30分間保持します。
      18. この溶媒を除去した後、脱イオン水で3回洗浄して塩基性加水分解に進みます。予熱した1.25%NaOH150mLと消泡剤5mLを無液カラムに加え、酸加水分解と同様の加熱手順を行います。
      19. 最後に、150 mLのアセトンで3回洗浄して低温抽出します。
      20. このプロセスの後、るつぼをシステムから慎重に取り外し、150°Cのオーブンに1時間入れます。最終的な重量 (W1) を記録します。
      21. るつぼをマッフル炉に500°Cで3時間置き、最終重量(W2)を記録します。
      22. 粗繊維含有量を計算し、次の式を使用して結果をパーセンテージで表します。
        粗繊維の割合 = 100 x (W1-W2)/W0
      23. 脂肪酸(FA)プロファイル:Fernández et al.(2015)29に従って、手順8.1.3.24-8.1.3.29に従って脂肪酸プロファイルを決定します。
        注:脂肪酸メチルエステル(FAME)は、粉砕された凍結乾燥サンプルの直接酸触媒によるトランスメチル化によって得られます。すべての分析は三重に行われます。
      24. メタノール中の2%(v/v)H2SO4 溶液2 mLを50 mgのサンプルに加え、混合物を80°Cで2時間、連続撹拌しながら注ぎます。
        注意: サプライヤーから提供されたメタノールの安全データシートを参照してください。
      25. 室温まで冷却した後、各サンプルに超純水1 mLとノル マルヘプタン2 mLを加え、混合物を1分間ボルテックスし、5分間遠心分離します。
        注意: サプライヤーから提供されたn-ヘプタンの安全データシートを参照してください。
      26. FAME を含む上層 n-ヘプタン相(有機)を回収し、ガスクロマトグラフィー(GC)バイアルに移します。
      27. TR-FAMEキャピラリーカラム(内径60m×0.25mm、膜厚0.25μm)、オートサンプラー、フレームイオン化検出器(FID)を搭載したガスクロマトグラフで分析します。
      28. インジェクター(スプリットレスモード)を 250 °C に設定し、検出器を 280 °C に設定します。 カラムの初期温度を 75 °C に設定し、1 分間保持します。その後、5°C/minで170°Cまで昇降させ、10分間保持します。その後、5°C/minで190°Cまで昇降させ、さらに10分間保持します。最後に、2°C/minで240°Cまで昇温し、10分間保持します。ヘリウムをキャリアガスとして、流速1.5mL/minで使用します。空気と水素をそれぞれ350mL/minと35mL/minの流量で供給します。
      29. 得られた保持時間を標準値と比較することによりFAプロファイルを決定し、その結果を総脂肪に対する割合で表します。
      30. 鉱物元素プロファイル:Pinto et al.(2022)30から採用された方法に従い、8.1.3.31-8.1.3.34の手順に従って、ICP-OESによって分析された鉱物元素(Ca、P、Mg、Na、K、Fe、Cu、Mn、Zn)を決定します。
      31. 各乾燥サンプルの約 0.4 g を正確に秤量し、7.5 mL の HNO3 と 2.5 mL の塩酸を加えます。
        注意: サプライヤーから提供されたHNO3 およびHClの安全データシートを参照してください。
      32. 分解は、30分で室温から90°Cまで温度を上げ(この温度でさらに30分維持)、続いて105°Cで60分という2段階のプロセスに従います。
      33. サンプル溶液を冷却し、25 mLに希釈し、ろ過してラベル付きチューブに保管します。各分解では、標準物質とブランクを使用して同じプロセスを実行します。ICP-OESによって異なる元素の濃度を取得します。
      34. 結果は、fw 100 g あたり mg で表します。
      35. 炭水化物含有量:手順8.1.3.36-8.1.3.37に従って炭水化物含有量を計算します。
      36. 国連食糧農業機関(FAO;2003)31に従って、次の式を使用して、100 gあたり以前に決定された係数の差によって利用可能な炭水化物(繊維を除く)含有量を計算します31
        figure-protocol-5
      37. 結果は 100 g あたりの g で表します。
      38. 水分と灰分:手順8.1.3.39-8.1.3.45に従って水分と灰分を推定します。
      39. 磁器るつぼを105°Cで3時間インキュベートし、デシケーターで冷却し、秤量します。
      40. 10 gのサンプルをるつぼに秤量し、連続する重み付けの値が10 mgを超えて異なることがなくなるまで、105°Cの乾燥オーブンに3時間サイクル入れます。
      41. 次の式を使用して、fw 100 g あたり g で表される水分含有量を計算します。
        figure-protocol-6
        ここで、W1 は空のるつぼの重量、W2 は新鮮なサンプルを含むるつぼの重量、W3 は乾燥サンプルのるつぼの重量です。
      42. 含水率アッセイ後、乾燥したサンプルを入れたるつぼを525°Cの焼却炉に4時間入れます。
      43. 連続する重み付けの差が1 mgを超えなくなるまで、この手順を繰り返します。
      44. サンプルをデシケーターでRTに冷却し、秤量します。
      45. 次の式を使用して、fw 100 g あたり g として表される灰分を計算します。
        figure-protocol-7
        ここで、W1 は空のるつぼの重量、W2 は新鮮なサンプルを含むるつぼの重量、W3 は重量のあるるつぼの重量です。
      46. エネルギー値: 手順 8.1.3.47-8.1.3.48 に従ってエネルギー値を計算します。
      47. 次の式を使用して、EU規制:消費者への食品情報の提供(規則1169/2011)32に従って、サンプルのエネルギー値を計算します。
        エネルギー(kcal/100g)= 4×(タンパク質g)+ 4×(炭水化物g)+ 9×(脂肪g)+ 2×(食物繊維)
        エネルギー(kJ / 100 g)= 17 x(gタンパク質)+ 17 x(g炭水化物)+ 37 x(g脂肪)+ 8 x(g繊維)
      48. 結果を100gあたりのキロカロリーと100gあたりのキロジュールで表します。
    4. 消費者の受容
      1. 蒸留水で8分間調理したパスタサンプルを使用して、消費者の受容性を評価します。
      2. 消費者受け入れテストの実施:サンプルの外観、色、食感、匂い、海の味、全体的な味、全体的な評価、および購入意向を評価します。
        注:消費者受容テストは、外観、色、食感、匂い、海の味、全体的な味、全体的な評価、および購入意向を1〜9のスケールで評価するヘドニックテストに基づいており、1は悪い評価、9は非常に良い評価です。
      3. 官能分析ラボの個々の官能ブースで官能試験を実施します(温度と照明の制御付き)。カトラリー、ナプキン、ミネラルウォーターの入ったガラスカップを用意して、サンプル間の口蓋をきれいにします。
        注:テイスターは、すべてのバックグラウンド(n > 80)の16〜64歳です。
  2. ヨーグルト
    1. 色素抽出
      注:色素抽出は、Pereira et al.(2020)18に記載されている方法で行ってください。
      1. 抽出溶媒であるリン酸ナトリウム緩衝液を、二塩基性リン酸ナトリウム(0.03 M)およびリン酸ナトリウム一塩基性(0.07 M)とともに調製します。NaOHまたはHClを使用してpHをpH6.8に設定します。
      2. G. gracilis1 gを秤量し、50 mLのリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.8)を加えます。10分間均質化した後、乳鉢と乳棒で10分間浸軟します。
      3. 溶液をチューブに移し、12,298 x g (4°C)で20分間遠心分離します。
      4. 上清をプールし、65%硫酸アンモニウムをゆっくりと加えます。硫酸アンモニウムがすべて溶解したら、溶液をアルミニウムシートで覆い、4°Cで一晩沈殿させます。
        注意: サプライヤーから提供された硫酸アンモニウムの安全データシートを参照してください。
      5. 沈殿物を12,298 x g (4°C)で20分間遠心分離します。ペレットを回収し、蒸留水(約5mL)に溶解します。
      6. チューブメンブレン(14 kDa)を用いて抽出物を水に対して24時間透析した後、凍結乾燥します。凍結乾燥抽出物は、使用するまで4°Cで光から保護して保管してください。
    2. ヨーグルトの作り方
      1. 低温殺菌牛乳1L、ナチュラルヨーグルト120g、砂糖20g、粉乳50gをサーモミキサーで5分間、50°C、速度3で混合してナチュラルヨーグルトを調製します。
      2. 混合物をサーモミキサージャーに入れ、37°Cのインキュベーターで12時間加熱します。
      3. 抽出物を0.21%の濃度でヨーグルトに混ぜて配合します。サンプルは、分析するまで4°Cのガラスフラスコに保管してください。
      4. ヨーグルトの個々の部分を色素なしで保存(コントロール)し、分析するまで4°Cで保存します。
    3. 色の安定性
      注:ヨーグルト中の色素の安定性を12日間色分析して評価します。反射率比色計、2 度の標準オブザーバー、および D65 光源を使用して色分析を実行します。結果は、L (明度、黒 - 白、0 - 100)、a* (緑 - 赤、-60 - 60)、b* (青 - 黄、-60 - 60) パラメーターを持つ CIELab 座標として表示されます。パラメータ a* は、赤みがかった色には正の値、緑がかった色には負の値があります。パラメータ b* は、黄色がかった色には正の値を取り、青みがかった色には負の値を取ります。L*は明度のパラメータであり、各色が黒と白の間のグレースケールのメンバーと同等と見なすことができる特性です33。
      1. メーカーが提供する白いセラミックプレート(L * 88.5、a * 0.32、b * 0.33)を使用して測色計を校正します。
      2. セルに約 28 g のサンプル(またはコントロール)を充填し、カラーデータ解析ソフトウェアを使用して色を分析します。
        注:カラーデータ解析に使用したソフトウェアはSpectraMagic NXでした。
      3. サンプル/コントロールの3回に分けて5回読み取りを行います。
    4. 官能分析
      注:トライアングルテスト(ISO 4120、2004)34 および色、味、および全体的な鑑賞の快楽的評価を使用して、色素を組み込んだヨーグルトの官能評価を実行します。
      1. トライアングルテストでは、パネリストに3つのサンプル(色素入りヨーグルト1サンプルと対照サンプル2サンプル、または色素入りヨーグルト2サンプルと対照1サンプル)を渡し、香り、食感、味に基づいて別のサンプルを選択してもらいます。ランダムな 3 桁のコードで識別された類似量のサンプルを提供します。
      2. 色素入りヨーグルトの快楽的評価では、パネリストに色素入りヨーグルトのサンプルを渡し、9段階の快楽的尺度(極端に嫌いから極端に好き)を用いて、色、味、全体的な評価を評価してもらいます。

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結果

抗菌活性

得られた結果を解釈する際には、阻害の割合が高いほど、その特定の菌株の増殖を阻害する抽出物の有効性が高くなり、その結果、抽出物が抗菌剤としてより興味深いものになることに留意する必要があります。この方法論により、特定の細菌株に対してより大きな活性を持つ抽出物を迅速に特定し、将来の使用に関して最も興味深いものを特定することもできます。したがって、同じ抽出物に関するさらなる研究の出発点を持つことができます。

図1は、第1および第2の抽出において、バイオマス乾燥直後(図1A)および第3および第4の抽出(図1B)において、エタノール抽出後に得られた

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ディスカッション

液体培地中の抗菌活性試験は、液体培地に懸濁した微生物に対する抗菌物質の有効性を評価するために使用され、通常、微生物の成長を阻害または殺す物質の能力を決定するために実行されます35、36、37、38.それらは、抗菌剤に対する微生物の感受性を評価するために使用され、試験管または微量滴定プレートで実施され、そこでは、異なる濃度の抗菌物質が標的微生物の標準化された懸濁液に対して試験される22。抗菌活性は、適切なインキュベーション期間後の培地中の微生物の増殖または濁りの有無を測定することによって評価されます。

これらの試験を実施するには、ブロス希釈法、寒天拡散法(ディスク拡散試験など)、および最も使用されている38の1つであるブロス微量希釈法な...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、MARE-Marine and Environmental Sciences Centre(UIDP/04292/2020およびUIDB/04292/2020)およびAssociate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)に付与された戦略的プロジェクトを通じて、ポルトガル科学技術財団(FCT)の支援を受けました。FCTはまた、Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)とTatiana Pereira(2021.07791. BD)。この作業は、ポルトガル2020プログラムの下でERDF(欧州地域開発基金)が共同出資するプロジェクトHP4A(すべての人のための健康的なパスタ)(共同プロモーション番号039952)によっても財政的に支援され、COMPETE 2020 - 競争力と国際化運用プログラムを通じて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Absolute EthanolAga, Portugal64-17-5
Ammonium ChloridePanReac12125-02-9
Amphotericin BSigma-Aldrich1397-89-3
Analytical scale balanceSartorius, TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizeniiGerman Collection of Microorganisms and細胞培養(DSMZ)DSM 347
BiotinPanreac AppliChem58-85-5
CentrifugeEppendorf, 5810R5811JH490481
ChloramphenicolPanReac56-75-7
CO2 ChamberMemmertN/A
Cool White Fluorescent LampsOSRAM Lumilux SkywhiteN/A
濃度計 McFarlandGrant InstrumentsN/A
DMEM mediumSigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma, Steinheim, Germany1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
エタノール96%AGA-ポルトガル64-17-5
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(Na2EDTA)JTベイカー6381-92-6
ウシ胎児血清(FBS)シグマアルドリッチF7524
濾紙(Whatman No.1)WhatmanWHA1001320
FlasksVWRインターナショナル、アルカビデチェ、ポルトガル N / A
フォリン-チョカルテウVWRケミカル31360.264
没食子酸 Merck149-91-7
酸化ゲルマニウム (IV), 99.999%AlfaAesar1310-53-8
HaCaT cells – 300493CLS-Cell Lines Services, Germany 
ホットプレートマグネティックスターラーIKA、C-MAG HS706.090564
鉄VWRケミカルズ10124-49-9
層流フードTelStar、ポルトガル526013
LBミディアム VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarumGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 21597
塩化マンガンVWRケミカル7773.01.5
マイクロピペット エッペンドルフ、ポルトガルN/A
MicroplatesVWR International、アルカビデチェ、ポルトガル 10861-666
マイクロプレートGreiner738-0168
マイクロプレート (滅菌)Fisher Scientific10022403
Microplate reader エポック マイクロプレート分光光度計、BioTek、バーモント州、米国1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)VWR Chemicals90004-658
オーブンバインダー、FD11512-04490
オーブンバインダー、BD11504-62615
ペニシリンSigma-Aldrich1406-05-9
pHメーター Inolab VWRインターナショナル、アルカビデチェ、ポルトガル 
ピピートのヒントエッペンドルフ、ポルトガル5412307
Pyrexボトルメディアストレージ VWRインターナショナル、アルカビデチェ、ポルトガル 16157-169
ロータリーエバポレーターハイドルフ、Laborota 4000 80409287
RotavaporIKA HB10、VWR International、アルカビデチェ、ポルトガル07.524254
炭酸ナトリウム (Na2CO3)Chem-Lab497-19-8
塩化ナトリウム (NaCl) Normax Chem7647-14-5
二塩基Riedel-de Haën7558-79-4
SpectraMagic NXコニカミノルタ、日本色データ分析ソフトウェア
分光光度計Evolution 201、Thermo Scientific、マディソン、ウィスコンシン、米国5A4T092004
ストレプトマイシンSigma-Aldrich57-92-1
チアミンPanreac AppliChem59-43-8
トリプシン-EDTASigma-AldrichT4049
トリプシン性大豆寒天 (TSA)VWR ChemicalsICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB) VWRケミカルズ22091
超純水 アドバンテージ A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, GermanyF5HA17360B
真空ポンプスイス ブッヒFIS05-402-103
Vitamin B12Merck68-19-9
DSM5922ズ300493硫酸ズ15212099リン酸性

参考文献

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562(2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516(2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81(2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492(2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822(2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769(2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688(2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611(2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482(2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427(2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068(2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364(2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642(2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380(2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431(2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

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