多色免疫測定法 による アレルギー性鼻炎ラットの鼻粘膜組織切片における免疫蛍光標識

アレルギー性鼻炎(AR)は、主に特異的免疫グロブリンE(IgE)^1,2によって媒介される鼻粘膜の慢性非感染性炎症性疾患です。くしゃみ、鼻水、鼻づまり、鼻かゆみなどの症状が特徴です。工業化と都市化に伴い、ARの普及は徐々に増加しており、世界人口の約10%〜20%に影響を与えています¹。免疫蛍光法(IF)は、抗体と抗原の結合反応を利用した蛍光染色法です。生体組織や細胞における特定のタンパク質の分布や発現レベルを検出し、定量化するために使用できます。AR研究では、IFはAR関連のサイトカイン、炎症細胞、受容体などを含む複数のターゲットを同時に検出できるため、ARの病因と薬物の効果の調査が容易になります3,4,5,6。

多色免疫蛍光(mIF)染色プロセスは、従来のIFと非常によく似ていますが、染色の各ラウンド中に抗体溶出ステップが追加されています。この修飾により、連続した単一標識と複数回の再染色により、同じ組織切片上の複数のバイオマーカーを同時に検出できます。mIFはチラミドシグナル増幅(TSA)に基づいており、TSA蛍光染色の繰り返しサイクルとマイクロ波加熱の使用により、蛍光シグナルを保持しながら抗体を除去することができます^7,8。従来のIFと比較して、mIFにはいくつかの利点があります:(1)従来の^IFでは同定が困難な弱発現抗原を検出できます^9,10;(2)S/N比が向上した高品質の染色を提供します。(3)組織特異的な構造と関心領域の定量化を可能にします¹¹。(4)複数の経路を多重化することで、組織を効率的に利用し、限られた病理学的資源を節約することができます¹²。(5)mIFによるマルチパラメータ解析は、組織へのより深い洞察を提供し、隠れた生物学的情報を明らかにします¹³。

全体として、mIFは、同じサンプル内の異なる抗原発現と分布の観察を可能にし、標的タンパク質の研究を容易にします。将来的には、複数の標的タンパク質の発現と分布を理解しようとする研究者にとって、この手法は貴重な選択肢となるでしょう。この研究では、ラットの鼻粘膜サンプルをARで染色するためのmIFの適用を実証し、ARのラットモデルの確立を評価します。

実験プロトコルと手順は、成都中医薬大学の管理および動物研究委員会から承認を受けています(記録番号:2022DL-010)。体重180〜200gの8週齢の雄のSprague Dawley(SD)ラットを市販し( 材料表を参照)、温度(23±〜2°C)および相対湿度(55%±10%)を制御した自然な明暗サイクルで飼育しました。12匹のラットを対照群とAR群の2つのグループに無作為に分けた。すべてのラットはこれらの条件に順応し、試験前の1週間は餌と水を自由に入手することができました。

1. ARのラットモデルの構築

1. 感作液の調製:生理食塩水100mLに30mgのオボアルブミン(OVA)と3gのAl(OH)₃を懸濁する(材料表参照)^14,15。
2. 基本的な感作:完全に覚醒しているラットをつかみ、腹部を上に向けて保持します。アルコールを75%含ませたコットンボールで腹部を消毒します。1.5 mLのシリンジを使用して、ステップ1.1で調製した感作液1 mLをAR群のラットの左腹腔に注入します。この注入を 2 日に 1 回 14 日間繰り返します(図 1A)。
   注意: 注射器を挿入するときは、大腸と小腸の損傷を防ぐために、ラットの頭が尾よりも低い位置にあることを確認してください。注射部位は腹側正中線から1.5cmの位置にあります。対照群のラットは、1 mLの生理食塩水1 mLを2日に1回、14日間腹腔内注射を受ける必要があります。.
3. 鼻の課題:基礎感作の翌日に、100 μLのピペット(図1B)を使用して点鼻薬を介して50 μLの5%OVAを投与し、この手順を7日間繰り返します(図1C)。
   注:5gのOVAと100mLの生理食塩水を混合して、5%OVA溶液を調製します。対照群には、同じ量の生理食塩水の点滴を投与します。

2. ラットの行動スコアリング

1. 最後の鼻腔チャレンジを完了してから30分以内に、 表1 (図1D)に概説されているスコアリング基準に基づいて、鼻を引っ掻く、くしゃみ、鼻水などの症状を特定するために、デジタルカメラを使用してラットを観察および記録します。
   注:ARモデリングの成功の確認は、合計スコア≥5ポイント¹⁴の達成に基づいています。

3. 鼻粘膜サンプルの採取

1. ネズミを生贄に捧げる:ネズミを_CO2の過剰摂取にさらして生贄に捧げます。その後、ラットを75%エタノールで消毒する( 材料表参照)。メスを使用して口の2つの角に沿って切開し、筋肉組織を露出させます(図2A)。次に、頬骨と頭蓋骨の両側の下顎骨の関節を組織ハサミで切断し(図2B)、下顎骨を切除します(図2C)。
2. 鼻腔への露出:止血槽(図2D)を使用して上顎骨の皮膚を分離し、鼻腔を露出させます(図2E)。鼻腔と上顎骨の間の骨の接続を組織ハサミで切断します(図2F)。次に、眼窩下孔で鼻腔と両側の眼窩骨との接続を切断し(図2G)、鼻腔を切除します(図2H)。
3. 固定:抽出した鼻腔を4%パラホルムアルデヒドに入れて固定し、室温で24〜72時間保管します( 材料表を参照)。
   注意: 使用するパラホルムアルデヒド固定剤の量が、適切に固定するために切片を完全に覆うのに十分であることを確認してください。

4. 鼻粘膜サンプルの前処理

1. 脱灰:ステップ3.1で除去した組織を固定することから始めます。PBSでそれぞれ20分間3回洗浄します。これに続いて、蒸留水で3回、毎回20分間洗浄します。続いて、室温での組織の20〜30倍の体積の脱灰液で組織を脱灰します。
   1. 脱灰溶液( 材料表を参照)は、7.2〜7.4のpHを維持する必要があります。最後に、脱灰した組織を脱水ボックスに入れます。
      注意: 脱灰液は毎週交換する必要があります。脱灰プロセスは、組織が軟化したときに終了できます(約2か月)。
2. 脱水とワックス脱毛:脱水ボックスを脱水機に移します( 材料表を参照)。アルコール度数75%で4時間、アルコール度数85%で2時間、アルコール度数90%で2時間、アルコール度数95%で1時間。
   1. 続いて、組織を無水エタノールに30分間浸し、さらに30分間プロセスを繰り返し、キシレンを5〜10分間使用し、このステップをさらに5〜10分間繰り返し、組織をワックスに1時間浸し、このステップをさらに1時間繰り返し、最後に組織をさらに1時間ワックスに浸します。
3. 包埋:溶かしたワックスブロックを包埋ボックス( 材料表を参照)に入れ、-20°Cの冷凍庫に保管します。ワックスが固まったら、それを取り除き、ワックスブロックをトリミングします。
4. スライス:トリミングしたワックスブロックをパラフィンミクロトーム( 材料表を参照)に挿入し、厚さ3μmのスライスにカットします。スライドスプレッダーの40°Cの水浴にスライスを置きます。ティッシュを平らにしてからスライドガラスで持ち上げ、60°Cのオーブンで焼きます。
   1. 水分が蒸発し、ワックスが適切にセットされたら、スライドを取り外し、25°Cの温度で保管します。

5. 鼻粘膜組織のH&E染色

1. 脱ワックスと水和:スライスをキシレンに20分間入れ、さらに20分間、無水エタノールで5分間、この手順をさらに5分間繰り返し、75%アルコールで5分間繰り返し、最後に5分間洗浄します。
2. ヘマトキシリン染色:100μLのピペットを使用して100μLのヘマトキシリン染色溶液( 材料表を参照)を3〜5分間分注し、5〜10秒間すすぎ、100μLの0.5%塩酸エタノールを10〜30秒間添加し、5〜10秒間すすぎ、100μLの0.2%アンモニア水を10〜30秒間添加し、30秒間すすぎます。
   注:ヘマトキシリン染色後、核に結合して細胞質に吸収された過剰なヘマトキシリン色素を除去するために、0.5%塩酸エタノールによる分化が必要です。エオシン染色を行うと、核と細胞質がはっきりと染色されます。0.5%塩酸エタノールで分化した後、スライスは赤またはピンク色に見えるので、分化後すぐにすすぎ、組織スライスから酸を取り除き、分化を止めます。次に、0.2%アンモニア水を使用して核染色を強化します。
3. エオシン染色:100 μLのピペットを使用して、100 μLのエオシン染色液( 材料表を参照)を5分間分注し、30秒間すすぎます。
4. 脱水と密封:スライスを無水エタノールに5分間浸し、さらに5分間プロセスを繰り返し、もう一度5分間、ジメチルを5分間、キシレンを5分間繰り返します。最後に、中性樹脂で密封します( 材料表を参照)。
5. 染色切片を顕微鏡に配置する:染色切片を顕微鏡に置き、画像がはっきりと見えるまで顕微鏡の焦点を調整し、倍率を40倍に設定して画像をキャプチャします。

6. 鼻粘膜組織の多色免疫染色

1. 脱ワックスと水和:ステップ5.1で説明したのと同じに従います。
2. クエン酸リン酸緩衝液処理:クエン酸リン酸緩衝液(pH 6.0)( 材料表を参照)をマイクロ波対応容器に入れます。沸騰するまで加熱して取り出し、スライドを容器に入れます。電子レンジで中火で沸騰するまで8分間加熱し、8分間火を止めた後、中火から弱火に切り替えて7分間加熱します。
   1. 自然冷却後、PBS(pH 7.4)に移し、振とうし、脱色シェーカーで5分ずつ3回洗浄します。
      注意: このプロセス中にバッファーが蒸発しないようにし、スライスが乾燥しないようにしてください。
3. 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング:スライスを乾燥させ、免疫組織化ペンで組織の周囲に円を描き(抗体の流出を防ぐため)、3%過酸化水素溶液(過酸化水素:純水=1:9)を塗布します。
   1. 室温で暗所で15分間インキュベートします。自然冷却後、スライスをPBS(pH 7.4)に入れ、脱色シェーカーで5分間ずつ3サイクル振とうします。
4. ブロッキング:サークル内に5%ヤギ血清を塗布し、30分間インキュベートします。
5. 一次抗体の添加:ブロッキング溶液を静かに除去し、FOXP3(希釈率:1:200、 材料表を参照)をスライスに加え、湿気のあるチャンバーに入れます。4°Cで一晩インキュベートします。
   注:抗体の蒸発を防ぐために、湿気チャンバーに少量の水を加えてください。
6. 二次抗体添加:スライスをPBS(pH 7.4)に入れ、脱色シェーカーで5分間ずつ3サイクル振とうします。スライスを静かに乾燥させ、二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG H&L 、材料表を参照)を円内に塗布します。暗所で室温で50分間インキュベートします。
7. チラミド希釈液の調製:100μLの3%H₂O₂ と100 mLの1x TBSTを混ぜ合わせます( 材料表を参照)。
8. TSAワーキング溶液の添加:1 mLのチラミド希釈液と2 μLのCY3-チラミドを混合して、TSAワーキング溶液を調製します。各スライスに100 μLのTSAワーキング溶液を塗布し、室温で暗所で10分間インキュベートします。次に、スライスをPBSで3回、毎回5分間洗浄します。
   注:TSAワーキングソリューションをすぐに準備して使用し、暗所で4°Cで保管してください。最大24時間有効です。
9. ステップ6.2〜6.8を繰り返します:RORγt(FITC蛍光色素)の1:200希釈に切り替え、次にTICAM1(TYP620色素)の1:200希釈に切り替えます( 材料表を参照)。
10. DAPI対比染色核:スライスを軽く振って乾燥させ、DAPI染色液を塗布し、室温で暗所で10分間インキュベートします。
11. 自家蛍光の消光:スライスをPBS(pH 7.4)に入れ、脱色シェーカーで5分間ずつ3サイクル振とうします。自家蛍光消光剤( 材料表を参照)をスライスに塗布し、5分間待ってから10分間洗浄します。
12. ブロッキング:スライスをPBS(pH 7.4)に入れ、脱色シェーカーでそれぞれ5分間の3サイクル振とうします。スライスを静かに振って乾かし、蛍光消光剤で密封します( 材料表を参照)。
13. 顕微鏡:染色した切片を顕微鏡に置き、顕微鏡の焦点を調整してはっきりと見えるようにし、倍率を20倍と40倍に設定して、画像をキャプチャします。
    注:DAPIのUV励起波長は330〜380nm、発光波長は420nm(青色光)です。FITCの励起波長は465-495nm、発光波長は515-555nm(緑色光)です。CY3は、励起波長が510〜560nm、発光波長が590nm(赤色光)です。TYP-690の励起波長は630nm、発光波長は690nm(ピンク色光)です。

6匹のSDラットを、OVA腹腔内注射と鼻腔チャレンジによりARモデルに誘導することに成功しました。ARは、AR群のすべてのラットに誘導され、群の100%を占めた。AR群のすべてのラットは、くしゃみ、鼻水、鼻かゆみなどの典型的な症状を示しました。すべての行動観察のスコアは≥5ポイントでした(表2)。

モデリング21日目 のH&E染色結果から、対照ラットでは、鼻粘膜の上皮細胞と繊毛が良好に配置されており、炎症性細胞浸潤の兆候がないことが明らかになりました。逆に、AR群では、鼻中隔粘膜が損傷して剥離し、好中球浸潤が顕著でした(図3)。

ARラットの鼻粘膜組織を対照群と比較したところ、RORγt(Th17細胞特異的転写因子)とTICAM-1(Toll様受容体リンカー分子-1)の発現が増加し、Foxp3(Treg細胞特異的転写因子)の発現が減少することが観察されました(図4)。

図1:実験ワークフロー 。 (A)腹腔内注射の模式図。(B)点鼻薬の模式図。(C)アレルギー性鼻炎ラットのモデリングのフローチャート。(D)行動観察の模式図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:鼻の除去プロセス 。 (A)口角の筋肉組織の切断。(B)頬骨と下顎骨の接続部を切断する。(C)下顎骨の分離。(d)上顎骨の皮膚の除去。(E)鼻腔を露出させる。(F)鼻腔と上顎骨の間の接続を切断します。(G)鼻腔と眼窩骨の間の接続を切断する。(H)切除した鼻腔。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:ARモデリング後の14日目の代表的な病理組織学的H&E染色画像(n = 6)。 (A)対照ラットの鼻粘膜の上皮細胞および繊毛は良好に配置されており、炎症性細胞浸潤は認められなかった。(B)AR群の鼻中隔粘膜が好中球浸潤により損傷し剥離した。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:RORγt、Foxp3、TICAM-1(n = 6)のMIF染色分析。 対照群と比較して、AR群のラットの鼻粘膜組織におけるRORγtおよびTICAM-1の発現は上昇したが、Foxp3の発現は減少した。スケールバー = 100 μm (左パネル);50 μm(右パネル)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:mIF技術の原理 mIF法は、蛍光シグナルを抗原に共有結合させるTSA法に基づいています。このプロセスでは、二次抗体に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識が触媒され、フルオレセイン基質の不活性状態から活性化状態への移行が促進されます。この活性化状態は、抗原上のチロシンに共有結合し、フルオレセインがサンプルに安定的に共有結合します。その後、共有結合していない抗体は熱修復によって除去されます。その後、一次抗体、二次抗体、フルオレセインを追加して、まったく異なる抗原の検出を可能にするために、この手順を繰り返します。この画像は、mIF模式図17を参照して再描画し、カラーマッチングした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:ラット行動試験の定量的スケール表。

表2:行動スコアリングの結果。

著者は何も開示していません。