ここで説明するAcroSensEマウスモデルおよび生細胞イメージング法は、精子先体細胞の細胞内コンパートメントにおけるカルシウム動態と、それらが膜融合および先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように制御するかを研究するための新しいアプローチを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
精子の単一のエキソサイトーシス小胞が原形質膜と融合する先体エキソサイトーシス(AE)は、受精に不可欠な複雑なカルシウム依存プロセスです。しかし、カルシウムシグナル伝達がどのようにAEを調節するかについての理解はまだ不完全です。特に、先体内カルシウム動態とAEに至る中間段階との相互作用は明確に定義されていません。ここでは、先体カルシウムの動態と、膜融合とその後の先体小胞のエキソサイトーシスとの関係について、空間的および時間的な洞察を提供する方法について説明します。この方法では、アクロソーム標的エキソサイトーシス用センサー(AcroSensE)を発現する新しいトランスジェニックマウスを利用します。このセンサーは、mCherryと融合した遺伝子コードカルシウムインジケーター(GCaMP)を組み合わせています。この融合タンパク質は、アクロソームカルシウム動態と膜融合イベントを同時に観察できるように特別に設計されました。生きたAcroSensE精子の先体カルシウム動態とAEのリアルタイムモニタリングは、高フレームレートイメージングと単一の精子を標的とする刺激剤送達システムの組み合わせを使用して達成されます。このプロトコルは、生データを定量化および分析するための基本的な方法の例もいくつか提供します。AcroSensEモデルは遺伝子コードされているため、他のマウス遺伝子モデルとの交配や遺伝子編集(CRISPR)ベースの方法など、すぐに利用できる遺伝ツールを使用することで、その科学的重要性を高めることができます。この戦略により、精子の受精と受精における追加のシグナル伝達経路の役割を解決できます。要約すると、ここで説明する方法は、特定の細胞内コンパートメント(精子先体)のカルシウム動態と、それらの動態が膜融合と先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように調節するかを研究するための便利で効果的なツールを提供します。
概要
精子は、受精能力1と呼ばれるプロセス中に受精する能力を獲得します。このプロセスの1つのエンドポイントは、精子がAEを受ける能力を獲得することです。20年以上にわたるデータは、哺乳類の精子におけるAEの複雑で多段階的なモデルの存在を支持しています(2,3に要約)。しかしながら、生精子におけるAEの研究は困難であり、このプロセスを適切な分解能でモニターするために現在利用可能な方法は、煩雑であり、複数の調製ステップ4を必要とし、AEの最終ステップの検出に限定され(例えば、PNA5を使用)、細胞質カルシウムの変化の測定に限定される(先体カルシウム動態とは対照的に)、 または、細胞質カルシウム動態または AE6 のいずれかの測定に限定されます。
生理学的条件下でのリアルタイムAE研究のいくつかの重要な制限を克服し、カルシウム動態とAEの相互作用の調査を可能にするために、独自のマウスモデルを作成しました。このマウスモデルでは、遺伝的にコードされたCa2+センサー(GCaMP3)とmCherryからなる融合タンパク質が発現し、アクロシンプロモーターとシグナル伝達ペ....
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プロトコル
すべての動物処置はガイドラインに基づいて実施され、コーネル大学の動物飼育および使用委員会(#2002-0095)によって承認されました。8〜10週齢のAcroSensEマウス2 を本研究に使用しました。AcroSensEマウスの利用可能性に関する情報のリクエストは、対応する著者に提出することができます。
1.精子の採取と洗浄
- AcroSensEマウスから精巣上体尾精子(この手順の詳細については11に記載)を採取します。0.5 mLの修飾ウィッテン培地(MW)を含む3.5 cmの組織培養皿で、37°Cで15分間のスイムアウト手順を実行します。 皿はMWの蒸発を減らすために覆う必要があり、培地が精巣上体尾を覆うのに十分な深さを持つように傾ける必要があります。
注:修飾ウィッテン培地(MW)には、22 mM HEPES、1.2 mM MgCl2、100 mM NaCl、4.7 mM KCl、1 mMピルビン酸、4.8 mM乳酸ヘミ-Ca2+ 塩、pH 7.35が含まれます。グルコース(5.5 mM)、NaHCO3 (10 mM)、および2-ヒドロキシプロピル--シクロデキストリン(CD;3 mM)は、容量誘導のために必要に応じて補充され( 材料表<....
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結果
図2 は、精子の刺激が成功した後に予想される蛍光変化のシーケンスを示す簡略化された図を示しています。 図2 の上部パネルは、GCaMP3の蛍光強度の変化を示しており、シグナルは最初は暗く(ベースラインのアクロソームカルシウム濃度はGCaMP3 KDよりも低い)、融合細孔 を介して カルシウムイオンが侵入すると、蛍光の明るさが増します。最後に、AEでは、拡散と細胞外空間へのセンサーの損失によるシグナルの損失があります。 図2 の下部パネルは、mCherry蛍光強度の変化を示しており、初期信号が明るく、AEとセンサーの拡散と先体マトリックスの他の内容物によってのみ、赤色の信号が減光します。
図3は、125μMのガングリオシドGM1(GM1が精子12のAEを調節する方法の詳細)で刺激され.......
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ディスカッション
ここでは、新たに作製したAcroSensEマウスモデルを用いて、先体カルシウム動態とAEに至る中間ステップの相互作用をリアルタイムでシングルセルモニタリングおよび解析する顕微鏡ベースの手法について紹介します。このモデルと方法は、他のマウス遺伝子モデルとの交配や遺伝子編集など、容易に利用できる遺伝的アプローチとともに、受精、AE、および受精に関連する精子シグナル伝達経路に関与するさまざまな成分および経路の役割を研究するための強力なシステムを提供します。
重要な手順
精子の取り扱いのすべてのステップでは、大口径のプラスチックトランスファーピペットまたは大口径のピペットチップを使用し、膜の損傷を最小限に抑えるために、収集と洗浄のすべてのステップを37°Cで実行することが重要です。同様に、固定角ローターよりもスイングバケットローターが好まれるのは、細胞がマイクロ遠心チューブの側壁と相互作用することによる膜の損傷を避けるためです。Z位置ドリフト補正が利用可能な場合は、Z位置補正ハードウェア/ソフトウェアを適用して、イメージング間隔中に画像化された精子が.......
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開示事項
この研究に関連して報告する利益相反のある著者はいません。
謝辞
この研究は、米国国立衛生研究所の助成金R01-HD093827およびR03-HD090304(A.J.T.)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100倍オイル対物レンズ | オリンパスジャパン | UPlanApo,2 | |
| -ヒドロキシプロピル-b-シクロデキストリン | Sigma | C0926 | |
| 35mmカバースリップディッシュ 1.5厚 | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL 丸底チューブ | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| 共焦点顕微鏡 | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| グルコース | シグマ | G7528 | |
| 目盛り付きヒント | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | 国立衛生 | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| 乳酸 | Sigma | G5889 | |
| 生細胞顕微鏡インキュベーションシステム | TOKAI HIT静岡 | STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| マイクロピペットプーラー | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| プラスチックトランスファーピペット | フィッシャーブランド | 13-711-6M | |
| ポリ-D-リジン | シグマ | P7280 | |
| ピルビン酸 | シグマ | 107360 | |
| シングルセルデリバリーシステム | カー、ホーポージ、ニューヨーク | ピコスプリッツァーIII |
参考文献
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal c....
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再版と許可
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