このプロトコルは緑 膿菌からの総siderophores、pyoverdineおよびpyochelinの質的な、量的な分析を提供する。
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この記事について
サマリー
要約
緑膿菌 (P. aeruginosa)は、宿主に感染を確立するためにさまざまな病原性因子を産生することで知られています。そのようなメカニズムの1つは、シデロフォア生成による鉄の掃気です。 緑膿菌は 、鉄キレート親和性が低いピオケリンと、鉄キレート親和性が高いピオベルジンの2種類のシデロフォアを産生します。この報告は、ピオベルジンは細菌の上清から直接定量できるのに対し、ピオケリンは定量前に上清から抽出する必要があることを示しています。
シデロフォアの産生を定性的に分析するための主要な方法は、クロムアズロールスルホン酸(CAS)寒天プレートアッセイです。このアッセイでは、Fe3+-色素錯体からCAS色素が放出されると、青色からオレンジ色に色が変化し、シデロフォアの生成が示されます。総シデロフォアの定量のために、細菌上清をマイクロタイタープレートでCAS色素と等の割合で混合し、続いて630 nmで分光光度分析を行いました。ピオベルジンは、細菌上清を 50 mM Tris-HCl と等量ずつ混合し、分光光度分析を行うことにより、直接定量しました。380 nmのピークにより、ピオベルジンの存在が確認されました。ピオシュリンについては、細菌の上清から直接定量することができなかったため、最初に抽出する必要がありました。その後の分光光度分析により、313 nmにピークを持つピケリンの存在が明らかになりました。
概要
生物は、電子輸送やDNA複製など、さまざまな重要な機能を果たすために鉄を必要とします1。 緑膿菌はグラム陰性日和見病原体であり、宿主に感染を確立する様々な病原性因子を有することが知られており、そのメカニズムの1つがシデロフォア形成である2。鉄が枯渇すると、 緑膿菌 はシデロフォアと呼ばれる特殊な分子を放出し、周囲の環境から鉄を消光します。シデロフォアは細胞外に鉄をキレート化し、得られた鉄−シデロフォア複合体は細胞3に積極的に輸送される。
緑膿菌は、ピオベルジンとピオケリンの2つのシデロフォアを産生することが知られています。ピオベルジンは鉄キレート親和性が高い(1:1)のに対し、ピオケリンは鉄キレート親和性が低い(2:1)ことが知られています4。ピョーシュリンは、鉄キレート親和性が低いため、二次シデロフォアとも呼ばれます5。シデロフォアの産生と調節は、緑膿菌6のクォーラムセンシング(QS)システムによって能動的に制御されています。
鉄の消光に加えて、シデロフォアは病原性因子の調節にも関与し、バイオフィルム形成に積極的な役割を果たします7。シデロフォアは、細胞シグナル伝達への関与、酸化ストレスに対する防御、微生物群集間の相互作用の促進など、さらに重要な役割を果たします8。シデロフォアは、通常、鉄をキレート化する特定の官能基に基づいて分類されます。この分類における3つの主要な二座配位子は、カテコール酸、ヒドロキサメート、およびα-ヒドロキシカルボン酸3です。ピオベルジンは、緑膿菌や蛍光蛍光菌などの蛍光シュードモナス種の特徴です5。それらは、6〜12個のアミノ酸を含むオリゴペプチドに結合した混合緑色蛍光発色団で構成されています。いくつかの非リボソームペプチド合成酵素(NRP)がそれらの合成に関与している9。ピオベルジンの産生と調節に関与する4つの遺伝子は、pvdL、pvdI、pvdJ、およびpvdD10です。ピオベルジンは、哺乳類の感染と病原性にも関与しています11。緑膿菌は中程度の鉄制限条件下でピオケリンを産生することが知られており、ピオベルジンは厳しい鉄制限環境で産生される12。ピケリン産生に関与する2つのオペロンは、pchDCBAとpchEFGHI13です。ピオシアニンの存在下では、ピオケリン(カテコール酸)が酸化的損傷および炎症を誘発し、宿主組織に有害なヒドロキシルラジカルを生成することが注目される11。
クロムアズロールスルホン酸(CAS)アッセイは、感度はあるものの特異性が高すぎる可能性のある微生物学的アッセイと比較して、その包括性、高感度、および利便性のために広く採用されています14。CASアッセイは、寒天表面または溶液中で実施できます。これは、第二鉄イオンが強い青色の錯体からオレンジ色に遷移するときに発生する色の変化に依存しています。CAS比色アッセイは、Fe-CAS界面活性剤の三元錯体からの鉄の枯渇を定量化します。金属、有機染料、界面活性剤からなるこの特定の錯体は青色をしており、630 nmで吸収ピークを示します。
本報告では、寒天プレート上のシデロフォアの産生を検出できるシデロフォア産生の定性検出法について紹介する。また、緑 膿菌由来の2つのシデロフォア(ピオベルジンおよびピオケリン)の検出および定量分析を行うマイクロタイタープレートにおける総シデロフォア産生量の定量的推定方法も提供される。
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プロトコル
緑膿菌のすべての分離細菌は、インドのバドーダラとジャイプールの医療微生物学研究所から入手しました。選択されたすべての臨床分離株はバイオセーフティキャビネット(BSL2)で取り扱われ、実験中の細菌分離株の取り扱いには細心の注意が払われました。すべての試薬/溶液の商品詳細は、材料表に記載されています。
1. クロムアズロールスルホン酸(CAS)色素および寒天培地の調製
- CAS色素(100 mL)を以下の組成で調製します。
- 60mgのCASを50mLの蒸留水に溶解する(溶液1)。
- 2.7mgのFeCl3・6H2Oを10mLの10mM HCl(溶液2)に溶解する。
- 73mgの臭化セトリモニウム(HDTMA)を40mLの蒸留水(溶液3)に溶解します。
- 溶液1、溶液2、溶液3を慎重に混ぜます。ガラス瓶に保管してください。
- 以下の手順に従ってCAS寒天を調製します。
- 750mLの蒸留水に100mLのMM9塩溶液を加えます。
- 32.24gのピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)遊離酸を溶解します。
- 寒天15gを加える。オートクレーブして冷まします。
- 30 mLの滅菌カサミノ酸溶液と10 mLの滅菌20%グルコース溶液を混合物に加えます。
- 100 mLのCAS色素を加えて混合し、無菌状態で注いでいます。
注:MM9培地、カサミノ酸溶液、および8-ヒドロキシキノリンの調製は、 補足ファイル1に記載されています。PIPES緩衝液はpHに敏感です。pH 5.6に達するまで溶解しません。PIPESが水に溶け始めると、pHがさらに下がるため、pHを常に監視してください。クロロホルムに溶解した同量の3%8-ヒドロキシキノリンでカサミノ酸を抽出します。混ざり合わない溶液を4°Cで約20分間放置し、下相を乱さずに溶液の上相を慎重に回収します。
2. シデロフォア産生の定性分析
- OD600 nmを0.2に設定し、 緑膿菌を24時間培養します。
- 滅菌ワイヤーループを使用して、CAS寒天プレート上で細菌培養物をストリークします。
- 30°Cで24時間インキュベートします。
注:ペプトン水培地または0.8%生理食塩水を使用して、細菌培養を希釈できます。24時間で細菌の増殖が観察されない場合は、CASプレートを48〜72時間インキュベートします。
3. 全シデロフォアの定量的推定
- 緑 膿菌 の24時間培養培養物を、OD600 nmを0.25に調整した後、ペプトン水培地に再接種し、30°Cで48時間インキュベートします。
- 48時間後、細菌培養物を4650 x g で室温で10分間遠心分離します。
- 遠心分離後、100 μLの無細胞上清を96ウェルマイクロタイタープレートに添加し、100 μLのCAS色素を添加します。
- プレートをアルミホイルで覆い、室温で20分間インキュベートします。
- インキュベーション後、630 nmで分光光度測定値を取得します。
- 全シデロフォアの定量化で得られた結果をパーセントシデロフォアユニット(PSU)として計算します。
注:PSUは次のように計算できます:[(Ar - As)/A r] x 100
ここで、Ar = 630 nmにおける基準の吸光度、As = 試料の無細胞上清の吸光度。参考までに、CAS色素を未接種のペプトン水培地に添加する必要があります。試験管、フラスコなどのすべてのガラス器具を6 M HClで2時間満たし、蒸留水で2回すすぎ、微量の鉄分を取り除きます。
4. ピオベルジンの定量的推定
- 緑 膿菌 の24時間培養培養物を、OD600 nmを0.25に調整した後、ペプトン水培地に再接種し、30°Cで48時間インキュベートします。
- 48時間後、さらに先に進む前に、細菌増殖のOD600 nmを測定します。
- 細菌培養物を4650 x g で室温で10分間遠心分離します。
- 遠心分離後、100 μL の無細胞上清を 96 ウェルマイクロタイタープレートに添加し、100 μL の 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)を添加します。
- OD405 nmで分光光度測定値を取得します。
5. ピョーシュリン抽出と分光光度法
- 緑膿菌の24時間培養培養物をKing's B培地(補足ファイル1)に再接種し、OD600 nmを0.25に調整した後、30°Cで24時間インキュベートします。
- 24時間後、100 mLの培養液を採取し、室温で4650 x g で10分間遠心分離します。
- 遠心分離後、上清に1 Mクエン酸5 mLを加えます。50 mLの酢酸エチルで2回抽出します。
- 硫酸マグネシウムで有機相をシリンジフィルターでろ過します。ろ過した有機相を-20°Cで保存します。
- 320nmで分光光度法を読み取ります。
注:ピオケリンは室温で非常に不安定な化合物であるため、氷上で抽出プロセスを行ってください。フィルター分離には50 mLの滅菌シリンジを使用してください。シリンジの先端に綿を置き、その上に1グラムの硫酸マグネシウムを加えます。シリンジの先端に滅菌シリンジフィルターを固定し、濾液を滅菌チューブに集めます。
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結果
臨床分離株からのシデロフォアの定量化の前に、シデロフォア産生の定性スクリーニングを実施して、シデロフォア産生を確実にしました。臨床分離株からのシデロフォアの定性的検出は、CAS寒天プレート上のストリーキング細菌によって観察されました。MR1、TL7、J3、およびPAO1(参照株)の3つの臨床分離株が研究のために選択されました。3つの臨床分離株とPAO1はすべて、シデロフォア産生に肯定的な結果を示し、青色寒天表面の細菌増殖の周りの透明なオレンジ色のハローは、シデロフォア産生が陽性であることを示しました(図1)。CAS寒天培地(図1)上のハロー形成は、臨床分離株によるシデロフォア産生の大まかな推定値を与えました。そこで、CAS試薬と液体培地を用いたシデロフォア産生の定量的推定を行った。
全シデロフォア定量は、無細胞上清から直接行いました。...
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ディスカッション
このプロトコルにより、研究者は、細菌の無細胞上清から緑膿菌の総シデロフォアと2つの異なるシデロフォア、すなわちピオベルジンとピオケリンを定量化することができます。CAS寒天プレートアッセイでは、CAS色素とFe3+イオンが複合体を形成します。バクテリアがシデロフォアを生成すると、CAS-Fe3+複合体からFe3+イオンを消光し、バクテリアの増殖周囲に色の変化をもたらします。この変化により、細菌の増殖の周囲に透明なオレンジ色のハローが生じます14,15。バクテリアはCAS寒天プレートに直接ストリークすることができますが、全体的な結果に影響を与える可能性があります。多数のバクテリア細胞を縞模様にすると、バクテリアの成長の周囲に広いオレンジ色のハローが作成され、使用するバクテリアセルの数が少ないと、クリアゾーンが狭くなる可能性があります。これに対処するために、OD600を調整して均一な数の細菌細胞を縞模様にしました。潔癖な...
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
著者は、DBT(バイオテクノロジー教育プログラム)、DBT(BUILDERプログラム)、およびFISTからの資金提供を認めています。SHODHから受けたフェローシップに感謝します。CSIRから受けたフェローシップに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 寒天、I型 | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-ヒドロキシキノリン | ローバケ | ミー4151 | |
| カサミノ酸 | SRLケミカルズ | 68806 | |
| チルトリメチル臭化アンモニウム(CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| クロロホルム | メルク | 1070242521 | |
| クロムアズロールスルホン酸 | HIMEDIA | RM336-10G | |
| クエン酸 | メルク | 100241 | |
| デキストロース 一水和物 | メルク | 108342 | |
| ジクロロメタン | メルク | 107020 | |
| 塩化第二鉄六水和物 | HIMEDIA | GRM6353 | |
| ガラスフラスコ | ホウロシル | 5100021 | |
| ガラス試験管 | ボロシル | 9820U05 | |
| 塩酸 | SDFCL | 20125 | |
| キングスミディアムBベース | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9最小中塩HIMEDIA | G013-500G | ||
| 硫酸マグネシウム | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV分光光度計 | Thermo Scientific | 51119200 | |
| ペプトン I型、細菌学 | HIMEDIA | RM667-500G | |
| パイプ 遊離酸 | MP バイオメディカル | 190257 | |
| リン酸二水素カリウム | メルク | 1048731000 | |
| プロテオース ペプトン | HIMEDIA | RM005-500G | |
| 島津製作所の紫外可視分光光度計 | 島津 | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| 塩化ナトリウム | Qualigens | 15915 |
参考文献
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
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