末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング

Summary

現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。

Abstract

眼球レンズは透明で柔軟な組織で、その形状を変化させてさまざまな距離からの光を網膜に集束させます。水晶体は、被膜と呼ばれる器官を取り囲む基底膜を除けば、前半球の上皮細胞の単層と水晶体線維細胞の塊からなる完全な細胞である。上皮細胞は生涯を通じて水晶体赤道の発芽帯で増殖し、赤道上皮細胞は遊走、伸長、分化して新たに形成された線維細胞になります。赤道上皮細胞は、ランダムに詰め込まれた丸石型の細胞から、子午線列を形成する整列した六角形の細胞に形態を実質的に変化させます。新たに形成されたレンズ線維細胞は、六角形の細胞形状を保持し、前極および後極に向かって伸び、前世代の線維に重ねられた細胞の新しいシェルを形成します。水晶体上皮細胞から線維細胞への顕著な形態形成を促進するメカニズムについてはほとんど知られていません。レンズの構造、発達、機能をよりよく理解するために、接眼レンズのマウント全体を使用して末梢構造を画像化する新しいイメージングプロトコルが開発されました。ここでは、カプセルの厚さ、上皮細胞面積、細胞核面積と形状、子午線列細胞の順序と充填、および繊維細胞幅を定量する方法を示します。これらの測定は、生涯にわたる水晶体の成長中に発生する細胞の変化を解明し、加齢や病態によって発生する変化を理解するために不可欠です。

Introduction

眼水晶体は、眼の前部に位置する柔軟で透明な組織で、網膜に光を細かく合わせる役割を果たします。レンズが機能する能力は、部分的には、その複雑なアーキテクチャと構成に起因する可能性があります1,2,3,4,5,6。水晶体組織を取り囲むのは、水晶体構造と生体力学的特性を維持するために不可欠な基底膜であるカプセルです^7,8,9。水晶体自体は完全に細胞状で、上皮細胞と繊維細胞の2種類の細胞で構成されています。上皮層は、レンズ¹⁰の前半球を覆う直方体細胞の単層からなる。生涯を通じて、上皮細胞は増殖し、水晶体嚢に沿って水晶体赤道に向かって移動します。前上皮細胞は断面が静止し、丸石であり、水晶体赤道付近では上皮細胞が増殖し、新しい線維細胞への分化過程を経始める^11,12。赤道上皮細胞は、ランダムに詰められた細胞から、六角形の細胞を持つ組織化された子午線列に変化します。これらの分化細胞の基底側では六角形の細胞形状が維持され、頂端側は水晶体の支点またはモディオラスで収縮して固定されます4,13,14,15。赤道上皮細胞が新たに形成された線維細胞に伸長し始めると、細胞の頂端先端は前上皮細胞の頂端表面に沿って前極に向かって移動し、基底の先端は水晶体嚢に沿って後極に向かって移動します。新世代の繊維細胞は、前世代の細胞に重なり、繊維の球状の殻を形成します。細胞の伸長および成熟過程において、繊維細胞はそれらの形態を実質的に変化させる11,12,16。これらの繊維セルは、レンズ質量^{11、12、16、17、18}の大部分を形成する。

複雑な水晶体の微細構造、細胞形態、およびユニークな細胞組織の確立に寄与する分子メカニズムは、完全にはわかっていません。さらに、水晶体嚢と細胞構造が水晶体全体の機能(透明度、水晶体形状の変化)に寄与するかどうかは不明です。しかし、これらの関係は、新しいイメージング方法論と、水晶体の構造的および細胞的特徴の定量的評価を使用して解明されています2,4,19,20,21,22。水晶体嚢、上皮細胞、末梢線維細胞の高空間分解能可視化を可能にするレンズ全体を画像化するための新しいプロトコルが開発されました。これには、カプセルの厚さ、細胞サイズ、細胞核のサイズと真円度、子午線の行順序、繊維細胞の充填、および繊維細胞の幅を定量化する方法論が含まれます。これらの可視化および画像定量化法は、詳細な形態測定検査を可能にし、全体的な3D組織構造を保持することにより、他の可視化法(フラットマウントまたは組織切片のイメージング)よりも優れています。これらの方法により、新しい仮説の検証が可能になり、水晶体細胞パターンの発達と機能の理解が継続的に進むことが期待されます。

以下の実験では、野生型およびRosa26-tdTomatoマウスのタンデム二量体-トマト(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)(tdTomato)²³ (Jackson Laboratories))を、雌雄6週齢から10週齢までのC57BL/6Jバックグラウンドで使用しました。tdTomatoマウスは、N末端ミリスチル化および内部システイン-パルミトイル化部位を介して原形質膜を標的とする変異MARCKSタンパク質のN末端8アミノ酸に融合したtdTomatoタンパク質の発現により、ライブレンズ内の細胞原形質膜の可視化を可能にする²³。また、Robert Adelstein博士(National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から入手したNMIIA^{E1841K/E1841K} マウス²⁴ も用いる。前述したように、²⁰に示すように、CP49ビーズ状中間フィラメントタンパク質の欠損(成熟した線維細胞の形態および全水晶体バイオメカニクスを維持する)を有するFvBN/129SvEv/C57Bl6バックグラウンドのNMIIA^{E1841K/E1841K}マウスを、C57BL6/J野生型マウスと戻し交配した。野生型CP49対立遺伝子の存在について子孫をスクリーニングしました。

共焦点イメージングは、20倍(NA=0.8、作動距離=0.55mm、1倍ズーム)、40倍(NA=1.3オイル対物レンズ、作動距離=0.2mm、1倍ズーム)、または63倍(NA=1.4オイル対物レンズ、作動距離=0.19mm、1倍ズーム)のレーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡で行った。すべての画像は、光学断面の厚さの決定要因であるピンホールサイズを使用して、1エアリーユニットで取得されました(結果の光学厚さは図の凡例に記載されています)。画像はZen Softwareで処理しました。画像は.tif形式にエクスポートされ、FIJI ImageJ Software (imageJ.net) にインポートされました。

Protocol

マウスはデラウェア大学の動物施設に収容され、病原体のない環境で維持されています。CO2吸入による安楽死を含むすべての動物処置は、デラウェア大学動物実験委員会(IACUC)によって承認された動物プロトコルに従って実施されました。

1.レンズマウント全体の準備とイメージング

1. ホールマウントイメージング用レンズの固定
   1. 安楽死後、前述のように眼球を摘出し、水晶体を解剖する²⁵。解剖後、レンズを室温で新鮮な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS;1.1 mM_KH2PO₄、155 mM、NaCl、3.0 mM Na₂HPO_{4-7H 2}O;pH 7.4)に直ちに移します。
      注:レンズをPBSに長期間保存すると細胞形態が変化する可能性があるため、解剖後~10分以内にすぐに修正することをお勧めします。
   2. 水晶体前部のホールマウントイメージングでは、作製したばかりの4%パラホルムアルデヒド(PFA)0.5 mLを1x PBS中の微量遠心チューブに室温で浸漬してレンズ全体を固定します。30分後、レンズを1x PBSで3回(1回の洗浄で5分)洗浄します。ステップ1.2に進むか、1x PBSで4°Cで保存します。 固定レンズは最大5日間保管できます。
   3. レンズ赤道領域のホールマウントイメージングでは、作製したばかりの 4% PFA 0.5 mL を 1x PBS の微量遠心チューブに室温で浸漬してレンズ全体を固定します。1時間後、レンズを1x PBSで3回(1回の洗浄で5分)洗浄します。ステップ1.3に進むか、1x PBSで4°Cで保存します。 固定レンズは最大5日間保管できます。
2. 前レンズ領域の全体マウント(固定またはライブ)
   1. 固定レンズのホールマウントイメージングの場合は、手順1.2.3に進みます。
   2. ライブレンズのホールマウントイメージングでは、1%抗生物質/抗真菌剤を含む1 mLの培地199(フェノールレッドフリー)を含む48ウェルプレートのウェルにレンズを移します。レンズを37°C、5%_CO2 でイメージングするまでインキュベートします。イメージングの前に、蛍光標識小麦胚芽凝集素(WGA-640、1:500)およびHoechst 33342(1:500)を含む溶液中で、培地199で少なくとも10分間インキュベートします。手順 1.5 に進みます。
   3. レンズカプセル、F-アクチン、および固定レンズの核を染色するには、WGA-640(1:500)、ローダミン-ファロイジン(1:50)、およびHoechst 33342(1:500)を含む500 μLの溶液にレンズを透過/ブロッキングバッファー(0.3%トリトン、0.3%ウシ血清アルブミン(フラクションV)および3%ヤギ血清を含む1x PBS)に入れます。レンズを4°Cで一晩染色します。
   4. 一晩インキュベートした後、レンズを1 mLの1x PBSで3回(1回の洗浄で5分)洗浄します。イメージングレンズに進みます。
   5. 共焦点イメージング用の固定レンズを安定させるには、前述のようにイメージングディッシュ上のアガロースにレンズ固定ディボットを作成します²¹ (図1)。
      1. PBS中の2%アガロースを加熱し、溶液が液化するまでマイクロ波で穏やかに混合します。液化させた2%アガロース250 μLをガラス底のディッシュにピペットで移し(図1A)、柔軟なプラスチックカバーガラスを使用してディッシュ全体でアガロースを平らにします(図1B)。アガロースが冷却され、完全に固まったら、先端の細い鉗子を使用してカバーガラスを取り除き(図1C)、3mmの生検パンチを使用して、皿の中央にアガロースに穴を開けます(図1D)。
      2. デリケートなタスクワイプを使用して余分なアガロースを除去します(図1E)。アガロースモールドを1x PBSで水和させ、使用するまで4°Cで維持します。アガロースカビは、最大1週間の保存に成功しています。
   6. 胚鉗子を使用して、ライブレンズまたは固定レンズをアガロースのくぼみに静かに移し(図1F)、~2 mLの1x PBS(固定レンズ)またはフェノールレッドフリー培地199(ライブレンズ)を含み、皿を倒立顕微鏡ステージに置きます。水晶体が前部が対物レンズに面した位置にあることを確認するために、核染色を視覚化します。核が観察されない場合は、後部領域が対物レンズに面している可能性があります。
   7. レンズを反転させるには、湾曲した鉗子を使用し、前方領域が対物レンズに面するようにレンズを~180°静かに回転させます。共焦点顕微鏡で画像を取得します。
   8. レンズカプセルの可視化には、ステップサイズ0.3μmの40倍対物レンズを使用してzスタック画像を取得します。水晶体嚢の表面の前の最初の画像(WGA染色で示される)と、上皮細胞の頂端表面の後の最後の画像を取得します。上皮細胞を可視化するには、水晶体上皮細胞を可視化するために、ステップサイズ0.3 μmの63倍対物レンズを使用してzスタック画像を取得します。
      注:これらの顕微鏡パラメータは、カプセルの厚さや上皮細胞面積の画像定量化に不可欠な画像の適切な3次元(3D)再構成を可能にします。また、前述^{したように}上皮細胞単層を透過して撮像することにより生体レンズtdトマトレンズで縫合糸を撮像することも可能である。
3. 水晶体赤道上皮および線維細胞の染色
   1. 固定レンズを、ローダミン-ファロイジン(1:300)、WGA-640(1:250)、およびHoechst 33342(1:500)の0.5 mL溶液に、透過/ブロッキング溶液(3%BSA、3%ヤギ血清、0.3%トリトン)の微量遠心チューブに入れます。4°Cで一晩維持します。
   2. 一晩インキュベートした後、レンズを1mLの1x PBSで3回洗浄します(1回の洗浄で5分)。
   3. 前述のようにレンズ固定アガロースウェッジを作成します^4,10。
      1. 簡単に説明すると、1x PBSで溶融した2%アガロースを5~6 mL皿に流し込むことにより、ガラス底の皿(FD35-100、WPI)にアガロースウェッジを作成します(図2A)。アガロースが固まったら(図2B)、鋭利な刃で三角形のくぼみを作ります(図2C)。アガロースウェッジを取り出し、1 mL の 1x PBS をアガロースディッシュに入れます(図 2D)。
      2. アガロースを切断した際に残る可能性のある残留アガロースを吸引します。.複数の異なるサイズのレンズ(図示せず)に適合させるために、ディッシュごとに複数のウェッジを作成することができる。アガロースモールドを保存するには、1 mLの1x PBSをアガロースモールドに置き、4°Cに保ちます。 ウェッジは最大1週間保管できます。
   4. 湾曲したピンセットを使用して、1 mLの1x PBSを含むアガロースウェッジ内にレンズを置き、レンズの赤道領域が共焦点対物レンズの上の顕微鏡ガラスに下向きになるように調整します(図2E-F)。赤道領域に焦点が合っていることを確認するには、原子核を可視化し、赤道で原子核が一列に並んでいることを確認します。赤道上皮細胞は、不規則に充填され、形作られているため、識別することもできます。また、子午線の列細胞は正確に整列し、六角形の形をしており、細胞膜でのF-アクチン染色によって示されます。
   5. 視野内の核がランダムに詰め込まれている場合、レンズの前側は対物レンズに面しています。核が観察できない場合は、水晶体の後側が対物レンズに面している可能性が高くなります。レンズが赤道上にない場合は、レンズの向きを変え、湾曲したピンセットを使用して、レンズの赤道で正確に位置合わせされた核が観察されるまでレンズを回転させます。
   6. レーザー走査型共焦点顕微鏡(20倍対物レンズ、NA = 0.8、ステップサイズ0.5 μmおよび/または40倍オイル対物レンズ、NA = 1.3、ステップサイズ0.4 μm)を使用して、レンズ赤道上皮細胞およびファイバー細胞を画像化します。赤道上皮細胞が一番上にあり、そのすぐ下に子午線列細胞とファイバー細胞が続くzスタック収集の前に画像を回転させます。

2. 画像解析手法

1. レンズカプセルの厚さ測定
   1. WGAで標識されたライブtdTomatoレンズまたはWGAとrho-phalloidinで標識された固定レンズのいずれかの40倍対物レンズ(0.3 μmステップサイズ)で得られたzスタック画像を使用して、3D再構成のXZビューで光学2D投影を取得し、.tif形式で保存します。Zenソフトウェアを使用して画像を処理します。
   2. XZ スライス (.tif) イメージを FIJI ImageJ ソフトウェアで開きます。
   3. レンズカプセルの厚さを測定するには、直線機能を使用します( 図3A、Bを参照)。[ > オプションの編集] > [線幅] を選択して、線幅を 50 ピクセルに設定します。この線幅は、顕微鏡の設定で高いS/N比が得られるように経験的に決定されました。最適な線幅は、他の顕微鏡/顕微鏡の設定や、他の種のレンズを使用する場合によって異なる場合があります。次に、カプセルの上面から上皮細胞の基底領域の下まで線を引きます。
   4. ラインを関心領域として保存するには、 Ctrl + T キーを押します。
   5. チャンネルを画像、カラー、分割チャンネルのタブに分けます。
   6. カプセル チャネルの線に沿って強度を測定するには、 Ctrl + K を押します。
   7. スプレッドシートで、強度値を距離の関数としてプロットし、上皮細胞のカプセル表面と基底領域をそれぞれ表すカプセルとF-アクチンの強度ピークを決定します。X 軸は線距離です。
   8. 次に、カプセルと上皮蛍光強度ピークの間の距離を決定して、カプセルの厚さを計算します(図3C、D)。
2. 細胞面積解析
   1. 63倍の対物レンズ(NA = 1.4、0.3 μmステップサイズ)を使用して得られたzスタック画像を使用して、ライブtdTomatoレンズまたはファロイジンで標識された固定レンズで、上皮細胞の中央(側方)領域に焦点が合っている場所に対応するzスタック共焦点画像からXYビュースライスを解析します。側膜は、tdTomato膜色素を使用するか、側側細胞膜に存在するファロイジンを可視化することによって見えることに注意してください。
      注:レンズの曲率のため(XZビューで見られるように;図4A-C)、すべての上皮細胞が画像内で焦点を合わせるわけではありません。上皮の中央領域は、細胞側膜(図4D-E)と核(図4G-I)の両方が焦点を合わせている領域に対応する。
   2. 画像を.tifとしてエクスポートし、FIJI ImageJ で開きます。
   3. 解析用に FIJI ImageJ で縮尺を設定するには、ライン ツールを使用して、共焦点画像から縮尺記号の長さのラインを作成します。
   4. ラインのピクセル長と縮尺記号の長さを記録します。ツールバー メニューの [分析] に移動し、[ スケールの設定] を選択します。[距離 (ピクセル単位)] に線の長さであるピクセル数を入力し、[既知の距離] に縮尺記号の既知の長さを入力します。
   5. tdTomato染色またはローダミン-ファロイジン染色を細胞境界の目安として使用し、多角形ツールを使用して画像内で焦点が合っている細胞集団の輪郭を手動で作成します。側膜が見える細胞のみを追跡し(図4E)、部分的に見える細胞(つまり、画像の端)をトレースしないようにします。ROI を保存するには、 Ctrl+T キーを押します。ツールバーメニューの[編集]に移動し、[ 外部をクリア]を選択します。次に、FIJI ImageJ で Ctrl + M を押して、総セル面積 (ROI) を測定します。
   6. ROI 面積を合計セル数で割って、平均セル面積を計算します。細胞の数を決定する簡単な方法は、核の数を数えることです。nucleiチャンネル(青)に移動します。ROIメニューで、保存されているセルのROIアウトラインを選択します(図4G)。ROIの外側をクリアするには、[Edit]に移動し、[ Clear outside ]をクリックします(図4H)。マルチポイントツールを使用して、個々の原子核をクリックして原子核を数えます。
3. 細胞核領域と形状解析
   1. 核の面積と形状の解析では、tdTomato上皮細胞の中間(側方)領域に焦点が合っている場所に対応するzスタック共焦点画像からXY平面視光学切片を解析します。核領域が最も大きい共焦点画像からzスタックスライスを解析します(図5A)。これは、原子核の中央部分を表します。
      注:レンズの曲率により、XZビュー(図4G および 図5A)に見られるように、すべての核に焦点が合っているわけではないことに注意してください。
   2. 焦点が合っている核の部分母集団を選択し、ROIを節約します。
   3. 「外側をクリア」機能を使用します。ROI内で、フリーハンド選択ツール(左から4番目のメニューボタン)を使用して、核の境界を注意深くトレースします(図5B)。Ctrl+T キーを押して、各核トレースを ROI ウィンドウに保存します。完全な核が見え、核が互いに接触していない場合にのみ、核の輪郭を描きます。
   4. すべての核の輪郭が決まったら、 Ctrl+Mを押して、個々の細胞の核の面積と形状(つまり、真円度)を測定します。
   5. データをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、平均核面積と真円度を計算します(図5C)。
4. 子午線上皮パッキング
   1. 子午線乱れを測定するには、20倍の対物レンズ(0.5 μmステップサイズ)を使用して画像を取得します。
   2. 画像上のレンズの支点/モディオラスを特定します。支点は、伸長する上皮細胞の頂端が収縮して、赤道での最初の線維細胞の分化と伸長の間にアンカーポイントを形成する領域です。明るいF-アクチン強度( 図6AのXZ図では矢印で示し、 図6Bでは赤い破線で示)とXY図の単一光学切片における細胞組織の変化に基づいて支点を特定します。
      注:さらに、上皮細胞の基底領域と頂端領域の両方のF-アクチン染色は支点の上に見られますが、伸長細胞の基底領域のみが支点の下に見られます(図6A)。支点線より上の上皮細胞は不規則に充填され、ロゼットを形成する傾向がありますが、支点の下の線維細胞は平行に並んでおり、膜での明るいF-アクチン染色によって示されます(図6B)。
   3. 生後2ヶ月のマウスで支点が同定されたら、XY平面の支点の周辺(水晶体嚢に向かって)の単一の光学セクションを選択します。この距離は、生後2ヶ月齢マウスの子午線列細胞のすべての核が支点の周辺~5μmにあるときに焦点が合っているという観察に基づいて選択されます。1 つの光ディスク・セクション (.tif) を保管します。FIJIで画像を開きます。
      注:この分析は生後2ヶ月のマウスでのみ行われたため、この距離が年齢とともに変化するかどうかを結論付けることはできません。
   4. 画像解析を行う前に、ステップ2.2.2でImageJのスケールをμmに設定してください。
   5. 図7Aに示すように、フリーハンドのラインツールを使用して、核のアライメントを特定することにより、子午線の行領域全体(関心領域/ROI)を手動でアウトライン化します。ROI を保存するには、Ctrl+T キーを押します。ツールバーメニューの[編集]に移動し、[外部をクリア]を選択します。FIJI ImageJ で Ctrl + M を押して、セルの総面積 (ROI) を測定します。
   6. FIJI ImageJのフリーハンドラインツールを使用してアウトラインを描き、F-アクチン染色によって示される障害領域を特定します。無秩序領域の基準には^、先に示したように、列の分岐、不規則なパッキング、および列のずれが含まれます(図7B)。
   7. FIJI ImageJ で Ctrl + M を押して、輪郭を描かれた無秩序な領域/パッチを適用した領域を測定します。スプレッドシートの無秩序な面積の合計を合計します。
   8. 無秩序な面積の合計をROI面積で割り、100を掛けて無秩序な面積の割合を求めます。無秩序が観察されない場合は、無秩序な領域に 0% の値を設定します。
5. 隣接セルの子午線行番号
   1. 隣接する細胞の数を測定するには、40倍のオイル対物レンズ(0.4 μmステップサイズ)で取得したF-アクチン染色画像を使用します。
   2. 水晶体嚢から内側の子午線列細胞の基底領域に、F-アクチンが子午線列細胞の全周に濃縮されている光学切片(XY平面)を特定し、すべての子午線列細胞に焦点が合っていて、同じ平面上にあります。
   3. 子午線の各行セルの隣接セルの数をカウントします(図8)。スプレッドシート内の 6 つの隣接するセルを持つセルの平均割合を測定します。
      注:20倍の対物レンズで隣接するセルの数を決定します。しかし、六角形の形状を40倍の対物レンズで観察する方がはるかに簡単です。
6. 赤道線維細胞の画像解析
   1. ローダミンファロイジン染色レンズのzスタック共焦点画像を20倍対物レンズ(0.5 μmステップサイズ)で撮影します。
   2. 手順2.4.2で示されている支点を特定します。支点が特定されたら、1つの光学セクションを選択します。標準化のため、およびレンズ間の比較のために、XY平面の支点から内側に~10μmのファイバーセル幅を定量化します(図9A)。
   3. 生の画像を FIJI ImageJ に書き出します。FIJI ImageJでは、隣接する複数のファイバーセルに線(通常300~400μmの長さ)を引き、F-アクチン染色ピーク間の距離を測定します(ラインスキャン分析; 図9A;ピンクの線)。
   4. Ctrl+Kを押して、フィジーのラインスキャン距離の蛍光強度を取得します。次に、データをスプレッドシートにエクスポートして、ピーク間距離を計算します(図9A-Bに示す例)。これは、ファイバセル幅に相当します。

Results

前水晶体嚢、上皮細胞領域、および核領域
水晶体カプセルの厚さを分析するために、ライブレンズまたは固定レンズのいずれかで水晶体カプセルをWGAで染色しました。水晶体上皮細胞は、ライブレンズでtdTomatoで膜を標識するか(図2A)、または固定レンズの細胞膜でF-アクチンをローダミン-ファロイジン染色(図2B)することで同定しました。直交(XZ)投影法では、WGAおよびtdTomato/rhodamine-phalloidinの染色により、蛍光強度のピークtoピークラインスキャン分析を行うことができます。WGAチャネルのメジャーピークは被膜表面を示し、tdTomato/rhodamine-phalloidinチャネルのメジャーピークは上皮細胞の基底領域を示します。これらのピーク間の距離を計算することで、被膜の厚さを得ることができます。ラインスキャン解析の結果、生眼レンズ9週齢マウスのカプセルの厚さは11.2μm、9週齢の固定レンズマウスのカプセルの厚さは12.5μmであった。これらの観察されたカプセルの厚さは、以前の調査結果^2,4を代表しています。

tdTomato標識トランスジェニックマウスレンズ(またはローダミン-ファロイジン染色レンズ;図示せず)のホールマウントイメージングにより、上皮細胞の形態をライブで可視化できます。直交(XZ)投影は水晶体上皮細胞の側面図を提供し、側面領域の平面(XY)図は上皮多角形形状の視覚化を可能にします。健康な水晶体では、細胞間に隙間は見られません。画像内の細胞の集団をトレースし、その面積をROI内の細胞数で割ることで、平均細胞面積を計算できます。細胞数は、所与のROIにおけるヘキスト染色核の数をカウントすることによって決定される。この分析では、平均細胞面積が260μm2であることが示され、これは以前の研究と一致しています^2,4。

核のヘキスト染色は、上皮細胞における水晶体上皮細胞核形態測定の検査も可能にします。直交(XZ)投影により、原子核の側面図が可能になります。平面(XY)ビューは、原子核の円形/楕円体形状を示しています。核を追跡することで、個々の細胞の核面積や、真円度などの形状パラメータを計算できます。この分析では、平均核面積が64μm2、平均真円度が0.8であることが実証されています。真円度の値が 1 に近い場合は完全な円を示し、0 に近い値はより細長い形状を示します。

赤道上皮細胞パッキング、ファイバーセル六角パッキング、およびファイバーセル幅
水晶体赤道領域の平面(XY)図は、支点に収束する六角形の規則的に充填された水晶体上皮細胞を示しています。支点は、赤道^4,13,14,15での最初の線維細胞の分化と伸長の間に、伸長する上皮細胞の頂端先端が収縮してアンカーポイントを形成する場所です(図6B、赤い破線で示)。支点は、赤道上皮細胞と線維細胞を隔てる連続線を形成するF-アクチン染色の増加に基づいて局在化できます(図6B、赤い破線)。また、細胞膜でのF-アクチン染色では、支点の下の細胞が正確に整列し、平行に並んでいる細胞形状の変化も見られます(図6)。細胞核も支点の下に整列しています。

水晶体子午線上皮細胞および線維細胞を可視化するために、子午線列細胞の基底領域が視野に入るXY平面上の支点(水晶体嚢に向かって)の周辺4.5〜5μmの画像を、前述のように選択する²⁰。子午線列の乱れを測定するために、関心領域(ROI)の輪郭を描きます(図7A、黄色のボックス)。野生型レンズ像におけるROIの面積は15,833μm2である。観察可能な障害がないため、障害の面積の割合は 0 です。NMIIA-E1841K変異を有するマウスを用いた細胞六角形パッキングにおいて、非筋肉ミオシンIIA(NMIIA)が果たす重要な役割は、以前にも報告されている²⁰。図7Aは、南北行細胞障害を示す代表的なNMIIA^{E1841K/E1841K}レンズ赤道画像を示す。子午線列のROIは20,757μm2でした。次に、無秩序なパッチの総面積を追跡しました。障害の総面積は3,185μm2であった。計算された障害の割合は15.3%(障害領域 x 100/総ROI;図7B)。この無秩序な領域の割合は、以前の研究²⁰の範囲内にあります。

次に、野生型子午線列細胞における六角形パッキングの検討が実証された²⁰。F-アクチンは、子午線列細胞の全周および野生型(NMIIA^+/+)レンズの細胞膜基底領域の6つの頂点すべてに濃縮されているため、F-アクチン染色を使用して細胞の形状と充填組織を評価しました。代表画像1では、細胞を標識し、各細胞の周囲に隣接する細胞の数をカウントしました。画像1では、10個のセルすべてに6つの隣接するセルがあり、これらのセルがハニカム充填組織に配置されていることを示唆しています(図8)。対照的に、10個の細胞のうち8個(細胞の80%)には、細胞が不規則に詰まっていることを示す6つの隣接する細胞があります(図8)。

最後に、線維細胞の幅を測定するために、ローダミン-ファロイジンで標識した固定野生型レンズの支点から~10 μm内側に位置する末梢線維細胞を調べました(図9A)^2,4。なお、生きたtdTomatoマウスを用いてファイバー細胞の幅を測定することも可能ですが、tdTomatoではヘテロ接合体であるレンズからの信号は赤道域では弱い傾向にあります。したがって、tdTomatoのホモ接合体マウスは、より強い蛍光を示すことがわかっているので、使用することをお勧めします(図示せず)。ラインスキャン分析を用いてF-アクチン染色細胞境界間の距離を前述のように測定し、ファイバー細胞幅^2,4を示しました(図9B)。この解析により、野生型レンズの平均ピーク間距離は11.45 μm±2.11 μmであることが明らかになりました(4つの異なるマウスレンズ画像からのN = 117ファイバー細胞、図9B)。

図1:イメージング中にレンズを固定するためのアガロースディボットを作成する手順。 (A)ガラス底のディッシュを使用して、2%アガロースを液化ピペットで採取した。(B)フレキシブルカバースリップで平らにし、(C)冷めたら、細い先端鉗子を使用して取り外します。(D)くぼみには、3mmの生検パンチを使用して穴を開けます。(E)残留アガロスを吸引し、PBSですすぎ、糸くずの出ないティッシュで表面をきれいに拭き取ります。(F)レンズ全体をディボット内に慎重に取り付けます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:レンズ赤道上皮細胞および線維細胞をイメージングするためのアガロースディボットを作成する手順。 (A)2%溶融アガロースを組織培養皿に流し込む。(B)アガロースが完全に固まるまで室温で冷却する。(C)鋭利な刃で、三角形のディボットを作成します。(D)1 mLの1x PBSを組織培養皿に入れます。(E)解剖したレンズをくさびに置き、 (F) レンズをアガロース壁の間に挟んだ赤道上に立てかけます(赤い矢印)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:レンズカプセルの厚さの決定。 (A)ライブレンズカプセルと(B)固定レンズカプセルの共焦点zスタックの再構成からの矢状(X、Z平面図)光学セクション。(C)ライブレンズおよび(D)固定レンズのラインスキャンの蛍光強度は、カプセルの上面とカプセルに隣接する上皮細胞の基底領域(赤)に対応する単一のWGA(緑)ピークを示しています。2つのピーク間の距離を測定して、カプセルの厚さを定量化します。40倍のオイル対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、tdTomato/Rhodamine-PhalloidinチャンネルとWGAチャンネルにそれぞれ1.0 μmと1.2 μmの光学切片をもたらしました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:上皮細胞面積の定量化。 (A)水晶体上皮細胞のX、Z平面図で、細胞膜には(B)tdTomato、核には(C)Hoechst。(d)水晶体上皮細胞の中央領域のX、Y平面図。(E)tdTomatoシグナルは、焦点が合わされている細胞のグループに対応する関心領域を定義するためのガイドとして使用されます。(F)定義された領域の面積が決定されます。(G)核のヘキスト染色は、定義された領域内の細胞数を決定するために使用されます。(H)原子核の数は、(I)FIJI ImageJのマルチポイントツールを使用してカウントされます。平均セル面積を計算するには、定義された関心領域の総面積をセルの総数で割ります。63倍のオイル対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、HoechstチャンネルとtdTomatoチャンネルにそれぞれ0.7 μmと1.0 μmの光学切片をもたらしました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:核の面積と形状の決定。 (A)原子核中央領域のXY平面図。(B)核に焦点が合っている関心領域が定義されました。ROI内の核が概説されます。(C)個々の細胞の核の面積と真円度を表にし、面積と真円度の平均を算出した。63倍のオイル対物レンズを使用し、1つのエアリーユニットのピンホールを使用して取得した画像は、ヘキストチャンネルの光学断面が0.7 μmになりました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:レンズ支点の同定。 F-アクチンと核は、支点と子午線の列を識別するために使用できます。(A)XZビューは、支点に対応するF-アクチンのファロイジン染色を濃縮した図です。(B)レンズの支点に焦点を合わせた単一の光学XY平面図セクション。核のヘキスト染色では、支点の上の核は不規則に詰まっているのに対し、支点の下の核は正確に整列していることがわかります(右上)。F-アクチンのファロイジン染色では、支点の上の細胞は不規則な形をしているのに対し、支点の下の細胞は平行に並んでいることが分かります(左下)。赤い破線は支点の位置を示しています。20倍の対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、Hoechst、Rhodamine-Phalloidin、WGA-640チャンネルでそれぞれ1.5 μm、2.0 μm、2.2 μmの光学切片をもたらしました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:子午線乱れの判定 (A)野生型とNMIIA^{E1841K/E1841K} 子午線列細胞の単XY平面図光学切片は、支点から~5μm離れています(水晶体嚢に向かって)。子午線の列セル全体が、核のアライメントに基づいて青色の輪郭で囲まれています。野生型水晶体におけるF-アクチン(赤)染色は、子午線列細胞が正確に整列しており、障害の徴候がないことを示しています(0%)。野生型の代表的な順序付き領域が概説されています(オレンジ色)。細胞が乱れているレンズでは、無秩序な領域(黄色)の輪郭を描きます。(B)野生型から秩序化された領域の高倍率(Aのオレンジ色のボックス)。(C)列の分岐、(II)不規則な細胞形状とハニカムパッキンの喪失、(III)列のずれなど、さまざまなタイプの障害を示す無秩序領域の高倍率。NMIIA^{E1841K/E1841K} レンズの画像は、15.3%の経絡行細胞障害を示しています。20倍対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、ヘキストチャネルとローダミン-ファロイジンチャネルでそれぞれ1.5 μmと2.0 μmの光学切片をもたらしました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図8:レンズ子午線細胞ハニカムパッキングの分析。 (A)F-アクチンのローダミン-ファロイジンで染色した子午線行細胞の単一光学XY切片。低倍率の画像(上パネル)は、評価中のセルを示しています(ピンク色の番号)。黄色で囲まれた領域が拡大されています(下図)。黄色のローマ数字は、隣接するセルの数です。画像 1 は、すべて六角形のセルで、それぞれに 6 つの隣接するセルがあるセルを示しています。画像 2 には、セル番号 1 と 5 にそれぞれ 5 個と 7 個の隣接するセルがある不規則性があります。(B)データを記録し、計算した六角形のセルの割合を集計します。40倍対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、ローダミン-ファロイジンチャネルの光学切片が1.0 μmになりました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図9:ファイバーセル幅の分析。 (A)支点から~10μm以内のレンズファイバーセルの単一の光学XYビューセクション。細胞をローダミン-ファロイジンで染色し、細胞膜でのF-アクチンの可視化を行いました。線(ピンク、ダッシュ)が多数のファイバーセルの上に引かれます。(B)距離の関数としてのF-アクチン強度の代表的なラインスキャン。ピーク間距離は、ファイバーセルの幅を表します。40倍対物レンズと1つのエアリーユニットピンホールを使用して取得した画像は、ローダミン-ファロイジンチャネルの光学切片が1.0 μmになりました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

記載されているプロトコルは、水晶体の前方および赤道領域における周辺レンズ構造および細胞の高空間分解能の視覚化を可能にします。本研究では、3次元レンズ全体の構造が保たれたインタクトレンズ(ライブレンズまたは固定レンズ)を用いて、レンズ周辺構造を可視化する手法を示した。さらに、一般に公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用した形態測定定量分析の簡単な方法も提供されました。マウント全体の可視化と定量化の方法は、以前の研究で使用されてきました。これらの方法により、水晶体の形状変化や老化に対する前嚢と細胞の応答を理解することができました^2,4。これらの方法は、レンズ形状の変化や経年変化による赤道線維細胞の膨張を調べたり^2,4したり、正確な六角形の形状や末梢線維細胞の組織化の確立におけるNMIIAの役割を決定するためにも用いられている²⁰。

ホールマウントイメージングにより、レンズ構造の 顔面イメージング を高い空間分解能で行うことができます。前レンズ領域では、ホールマウントイメージングは、カプセル構造の完全性および/または上皮細胞形態を変化させる可能性のある損傷を防ぐことにより、フラットマウントイメージングよりも有利です。さらに、上皮細胞と線維細胞の間の界面が保持されます。この方法は、 表面 イメージングにより空間分解能が高く、上皮細胞領域と核領域の分析が可能になるため、レンズ切片の視覚化よりも利点があり、選択した領域(つまり、ここに示すように、中外側)または細胞の他の領域を形作ることができます。さらに、イメージング法により、レンズの赤道領域に沿った特定のポイントでの形態学的特徴を定量化できるため、空間分解能の不足や切片作成時に発生する可能性のある組織の歪みにより、イメージング染色レンズ切片では容易に達成できない六角形形状、子午線列細胞パッキング、支点、およびファイバーセル幅の視覚化が可能になります。

概説されたプロトコルでは、ライブレンズのイメージングにより、特定のレンズ構造と細胞を経時的に追跡することもできます。ライブレンズイメージングプロトコルは、以前の研究で役立ちました、 レンズの平坦化を誘発するために、レンズ圧縮前後の同じレンズからの細胞の亜集団からのカプセルの厚さと上皮細胞面積の繰り返し測定^{分析が行われました}4。水晶体の圧迫は、カプセルの厚さの減少と上皮細胞面積の増加を誘発することが判明しました。個々のレンズ間でカプセルの厚さと上皮細胞面積に大きなばらつきがあり、レンズの圧縮によって引き起こされるこれらのパラメータへの影響の大きさのため、独立した測定デザインを使用した場合(つまり、個々の非圧縮レンズと個々の圧縮レンズを比較する)を使用すると、違いを検出することは困難です。ライブイメージング法を用いて、生きた上皮細胞におけるF-アクチン再編成の追跡を可能にする上皮細胞²²のF-アクチンを可視化するために、LifeACT-GFP26を内在的に発現する生きたマウスレンズのホールマウントイメージングを実施しました。

概説されたプロトコルはマウスレンズのイメージング用に開発され、他の種の水晶体構造を視覚化するために適応される可能性がありますが、他のげっ歯類レンズ(ラット、モルモット)および他の哺乳類レンズ(ウシ、マカク、およびヒト)のレンズの前部および赤道末梢構造の両方を視覚化するための染色プロトコルは、データは示されていません。より大きなレンズで構造を可視化するには、より長い固定(4%PFA、氷上、4時間)、ブロッキング(1時間)、染色(一晩、4°C)が必要です。注目すべきは、異なる種でのイメージングは固定レンズでのみ行われたことです。ライブイメージングプロトコルでは、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスのレンズを使用するため、他の種由来のレンズのライブイメージングは困難な場合があります。したがって、このイメージングは、遺伝子組み換えが一般的ではない他の種のイメージングレンズを排除する可能性があります。しかし、マウス水晶体を親油性プローブFM4-64またはF-アクチン結合プローブSiR-ジャスプラキノリド(SiR-アクチン)でそれぞれプレ染色することにより、水晶体上皮細胞膜またはF-アクチンのライブ可視化を行うことができました(図示せず)。このようなプローブを使用して、他の種のライブレンズを画像化できる可能性があります。ただし、このようなプローブを使用する場合は、オフターゲット効果を回避するために注意が必要です。例えば、SiR-ジャスプラキノリドは、F-アクチンダイナミクスの変化をもたらす可能性がある²⁷。ライブレンズであろうと固定レンズであろうと、染色法のもう一つの限界は、そのようなプローブの浸透が限られていることです。そのため、撮像は周辺領域に限定される。tdTomatoトランスジェニックマウス⁴のレンズを用いて、内部領域(すなわち、深部線維細胞)をイメージングすることが可能であり、これもまた蛍光タンパク質のトランスジェニック発現に依存している。また、この発現は、深部ファイバー細胞の明るいシグナルに対して十分な高さでなければなりません。

それにもかかわらず、概説されたプロトコルにより、周辺レンズの特徴の効果的な形態学的定量が可能になりました^2,4,20。定量化の方法論は効果的で、オープンソースで公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用しています。関心領域の識別には手動トレース ツールが使用されていましたが、関心領域の識別を自動化できる場合があります。自動化は、特定の構造(核境界など)をFIJI ImageJベースで同定するためのコントラストを高めるために蛍光閾値を適用するのと同じくらい簡単な場合もあれば、細胞形状の違い(不規則な上皮細胞や繊維細胞の形状など)を検出するためのより複雑な機械学習アルゴリズムを適用するのと同じくらい簡単な場合もあります。より複雑な分析には、専用のプラグインまたはイメージングソフトウェアが必要になる場合があります。専用のプラグインまたはソフトウェアを使用すると、取得したzスタックから3D体積形態測定値を取得することもできます。全体として、説明されている定量化法は簡単にアクセスでき、費用対効果が高く、多くの有用なアウト^{カム指標に適しています}が^2,4,20、イメージングプロトコルプラットフォームは、高度なソフトウェア分析と組み合わせることで、将来の研究のための豊富な追加の形態学的測定を提供する可能性があります。

水晶体は、細胞の位置と深さに依存する形状とそれに関連する構造に依存する特殊な機能を持つ複雑な生体組織です。ここで紹介したイメージングプロトコルと定量法を用いることで、レンズ構造やレンズの複雑な構成がどのように確立されているかをより深く理解することができます。さらに、イメージングプロトコルと定量化方法は、レンズの構造と機能の関係を描写するのに役立ちます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm 生検パンチ	Acuderm Inc	NC9084780
アガロース	Apex BioResearch Products	20-102GP
抗真菌薬/抗生物質	Cytiva	SV30079.01
ウシ血清アルブミン (フラクション V)	プロメテウス	25-529
デリケート タスク ワイプ	キムワイプ
ガラス底皿 (フルオロディッシュ)	ワールドプレシジョンインターナショナル	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
レーザー走査型共焦点顕微鏡880	Zeiss
MatTekイメージングディッシュ	MatTekライフサイエンス	P35G-1.5-14
パラホルムアルデヒド	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R