二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

サマリー

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。

要約

細胞外小胞(EV)は、診断、ドラッグデリバリー、再生医療など、さまざまな生物医学的応用に大きな可能性を秘めています。それにもかかわらず、EVを分離するための現在の方法論には、複雑さ、時間の消費、かさばる機器の必要性などの大きな課題があり、臨床翻訳の妨げとなっています。これらの制限に対処するために、私たちは、大量のサンプルからEVを連続的に効率的に分離するための、環状オレフィン共重合体オフ化学量論チオール-エン(COC-OSTE)に基づく革新的なマイクロ流体システムの開発を目指しました。本研究で使用した技術は、サイズと浮力に基づく分離を利用することで、尿および細胞培地サンプルからの既存のアプローチと比較して大幅に狭いサイズ分布を達成し、将来のアプリケーションで特定のEVサイズ画分をターゲットにすることを可能にしました。当社の革新的なCOC-OSTEマイクロ流体デバイス設計は、二股非対称フローフィールドフロー分画技術を利用して、大量のサンプルに対して簡単で連続的なEV分離アプローチを提供します。さらに、このマイクロ流体デバイスの大量生産の可能性は、拡張性と一貫性を提供し、高い一貫性とスループットが不可欠な要件である日常的な臨床診断や産業プロセスにEVアイソレーションを統合することを可能にします。

概要

細胞外小胞(EV)は、エクソソーム(30-200 nm)とマイクロベシクル(200-1000 nm)の2つの主要なタイプからなる細胞由来の膜結合粒子^です1。エクソソームは、多胞体(MVB)内のエンドソーム膜の内向きの出芽によって形成され、細胞膜との融合時に管腔内小胞(ILV)を細胞外空間に放出^{します1。}これに対して、マイクロベシクルは、細胞膜²の外向きの出芽および分裂によって生成される。EVは、タンパク質、核酸、脂質、代謝産物を輸送し、細胞の生理学的状態(増殖、血管新生、転移、増殖、治療抵抗性など)を反映することにより、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たします³。その結果、がんを含む疾患の有望なバイオマーカーや治療標的として浮上し、診断やドラッグデリバリーシステムにおける可能性を浮き彫りにしています⁴。

EVを疾患の診断や治療に活用するには、さまざまな生体液から効率的に分離することが重要です⁵。一般的な方法には、超遠心分離(UC)、密度勾配遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ろ過、免疫単離^{などがあります6。}UCは広く使用されている技術であるが、EVではない同様の密度の粒子を生成する可能性があり、EV凝集体を生成する可能性がある⁷。SEC は、密度⁸ ではなくサイズに基づいて粒子を除外することで、より純度の高いサンプルを提供できるため、人気を博しています。ただし、カイロミクロンや低密度リポタンパク質などの不要な粒子の共単離を最小限に抑えるには、SEC カラムに適したポアサイズの慎重な選択とクロマトグラフィー条件の最適化が^{不可欠です8。}どちらの方法もその有効性にもかかわらず、特に細胞培地や尿などの大量のサンプルの場合、自動化に時間がかかり、自動化が困難であるため、産業用途での拡張性が制限されます⁹。

近年、非対称磁場流れ場分画(A4F)は、サイズと浮力に基づくマイクロおよびナノメートルサイズの粒子分離のための強力な分離技術として進化しています¹⁰。A4Fの動作原理は、その底部に多孔質膜を備えたマイクロ流体チャネルに依存し、クロス^フロー10と呼ばれる膜に向かって加えられる力を生成します。系に固有のブラウン運動およびポアズイユ流と組み合わされると、クロスフローは、流れダイナミクス内の粒子位置が変化するため、効率的な粒子分離を容易にする¹¹。利点にもかかわらず、この方法は、マイクロリットル範囲内のサンプル量¹² に限定され、追加の集束ステップを必要とし、プロセス¹⁰の持続時間を延長する。

過去10年間で、マイクロ流体工学は、迅速で効率的、かつ臨床的に信頼性の高いEV分離のためのツールとして注目を集めてきました¹³。しかし、EV分離用に設計されたほとんどのマイクロ流体分析法は、少量、高濃度のEVサンプル用に最適化されているか、複雑な分離手順に依存しています¹⁴。さらに、マイクロ流体工学の分野では、ポリジメチルシロキサン(PDMS)は、その光透過性、生体適合性、および使いやすさにより、ゴールデンスタンダード材料として認識されています¹⁵。それにもかかわらず、EVを含む親油性低分子を吸収する既知の傾向は、EV分野でのその応用にとって問題となり得る¹³。

環状オレフィン共重合体(COC)は、生体適合性、分子の吸収が小さく、耐薬品性が高いため、マイクロ流体工学で頻繁に使用される材料です¹⁵。しかしながら、COC装置の製造は、しばしば複雑なプロセスまたは特殊な装置¹⁶を伴う。あるいは、オフ化学量論チオールエン(OSTE)は、低分子の吸収の減少、優れた化学的安定性、製造の容易さ、およびスケーラブルな製造プロセスにより、PDMSの有望な代替品です^17,18。ただし、チューブへの接続が複雑なため、デバイスは漏れやすい場合があります¹⁹。

本研究の目的は、尿や細胞培地などの大容量サンプルからEVを分離するための、OSTEとCOCを組み合わせたマイクロ流体デバイスおよび二股A4F原理を設計および製造することでした。

プロトコル

ラトビア大学生命医科学研究倫理委員会(決定N0-71-35/54)により検体採取が承認されました。

注: このスタディで使用した材料は、 材料表 ファイルに含まれています。

1. 3次元(3D)プリント金型製作

1. CADソフトウェアで、トップチャンネルの寸法が高さ0.5 mm、幅1 mm、長さ210 mmの蛇行形状のダブルネガティブ金型を設計します。下部の溝には、幅1.5mm、高さ0.6mm、長さ210mmの同じデザインを使用してください。金型の幅、長さ、高さ、設計等角図などの寸法を 図1に示します。デザインを .stl ファイルとして保存します。
2. Z-Suiteでファイルを準備します。サポートを追加する必要はありません。強靭な黒色樹脂を使用した紫外線液晶ディスプレイ(UVLCD)3Dプリンターを使用して金型を印刷します。
3. 印刷後、プリンターの表面から金型を慎重に取り外します。超音波処理でイソプロパノール(IPA)で20分間金型を洗浄します。
4. 金型をN₂でブロードライします。
5. ND33フィルターを使用して金型を810秒間浸水暴露し、60°Cのオーブンに48時間入れます。

2. PDMS金型の準備

1. PDMSの重量を10:1のw/w比で行います(金型ごとに、16gのエラストマーベースと1.6gの架橋剤を使用します)。プラネタリー遠心ミキサーで成分を混合し、500RPMで1分間混合します。
2. 混合したPDMSを3Dプリントした金型に流し込み、真空デシケーターで-800mbarで30分間、または気泡が観察されなくなるまで脱気します。
3. 厚さ100μmのポリ塩化ビニルライナーを液体PDMSの上に慎重に置きます。
   注意: 気泡の形成を防ぐために、ライナーを片側から反対側にゆっくりと適用します。
4. PDMSで金型をモールドインプレース治具に挿入し、0.3Nmに設定したトルクレンチで治具を締め付けます。
5. 治具を60°Cのオーブンに3時間入れてPDMSを硬化させます。
6. 六角レンチを使用して治具を分解し、3Dプリントした金型を治具から取り外します。
7. 3Dプリントしたマスター金型からPDMS金型を慎重に取り出し、メスで金型の端を走り回り、ピンセットで金型を取り除きます。
   注:カビの除去を容易にするために、IPAを使用できます。ただし、余分なIPAを蒸発させるために、金型を60°Cで10分間加熱する必要があります。

3. OSTE-COCトップチャンネルの準備

1. 重量 OSTE は 1.09:1 w/w 比で行います (5 つのデバイスの場合、A 部 1.56 g、B 部 1.44 g が必要です)。遊星遠心ミキサーで成分を混合します:750 RPMで5分間混合し、次に750 RPMで5分間脱気します。
2. 混合したOSTEを遠心チューブに移し、真空デシケーターで-800 mbarで30分間脱気します。
3. 2 x 16 ミニ ルアー コネクタで COC スライドを IPA で 10 分間超音波処理して洗浄します。スライドをN₂で慎重に乾燥させます。
4. 平らな面が上向きになるようにきれいなCOCスライドをプラズマアッシャーに入れ、表面を800 SCCM酸素プラズマで2分間、700 Wの電力で0.133 mbarの圧力で処理します。
5. 酸化したCOCスライドをトップチャネルのPDMS金型に置き、処理面がPDMSの構造化表面と接触するようにします。アセンブリをモールドインプレース治具に配置し、トルクレンチを0.3Nmに設定して治具を締め付けます。
6. 圧力システムを6 barの圧縮空気ラインに接続します。脱気されたOSTEの遠心分離管を取り出し、内径(ID)0.8mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブを使用して、圧力システムの指示に従って組み立てます。
7. PTFEチューブをPDMSモールドの入口に接続し、圧力システムにある圧電ポンプによって維持された1000 mbarの圧力を使用して、デバイスを充填します。ガラス面を上にした治具をマスクアライナーに入れ、ND33フィルターを用いて850mJの用量で露光する。
8. 露光後、六角レンチを使用して治具を分解し、構造化されたOSTE層を持つCOCスライドをPDMS金型から慎重に取り外します。
9. 構造化されたOSTEを、細孔数50 nm、細孔密度11.8%の25 mm x 75 mmのメンブレンに接触させ、チャネルがメンブレンで完全に覆われるようにします。
   注:塗布の過程でメンブレンをできるだけまっすぐに保つことが特に重要です。
10. メンブレン側を上にして60°Cに設定されたホットプレートにアセンブリを置き、メンブレンの上に清潔なスライドガラスを置き、上から1.6 kPaの圧力をかけて均一に接着できるようにします。アセンブリを一晩加熱します。
    注:このステップの後は、ボンディング性能とチャネルの変形を評価することが特に重要です。

4. OSTE-COCボトムチャネルとデバイスアセンブリの準備

1. 1.09:1 w/w比でOSTEを混合します(5つのデバイスの場合、1.56 gのAパートと1.44 gのBパートが必要です)。遊星遠心ミキサーで成分を混合します:750 RPMで5分間混合し、次に750 RPMで5分間脱気します。
2. 混合したOSTEをファルコンチューブに移し、真空デシケーターで-800 mbarで30分間脱気します。
3. IPAで10分間超音波処理してCOCスライドを洗浄します。スライドをN₂で慎重に乾燥させます。
4. クリーンなCOCスライドをプラズマアッシャーに入れ、800 SCCMの酸素プラズマで表面を700 Wの電力で2分間、0.133 mbarの圧力で処理します。
5. 酸化したCOCスライドをボトムチャネルのPDMS金型に置き、処理面がPDMSの構造化表面と接触するようにします。アセンブリをモールドインプレース治具に配置し、トルクレンチを0.3Nmに設定して治具を締め付けます。
6. 脱気されたOSTEでファルコンチューブを取り出し、内径0.8mmのPTFEチューブを使用して圧力システムの指示に従って組み立てます。
7. PTFEチューブをPDMS金型の入口に接続し、1000 mbarの圧力を使用してデバイスを充填します。ガラス面を上にして治具をマスクアライナーに入れ、ND33フィルターを用いて1100mJの用量で露光する。
8. 露光後、六角レンチを使用して治具を分解し、構造化されたOSTE層を持つCOCスライドをPDMS金型から慎重に取り外します。
9. 構造化されたOSTE層をトップチャネルアセンブリと組み合わせて、最上層と最下層の設計が互いに整列し、OSTE最下層がメンブレンと接触するようにします。
10. デザインをモールドインプレース治具に挿入し、ブルドッグクリップを使用して、デバイスに1.6kPaの圧力を均等に加えます。治具を60°Cのオーブンに一晩入れます。
    注意: クリップの配置が不均一な場合、ボンディングが不均一になる可能性があります。

5. デバイス評価

1. 接着後、顕微鏡でデバイスを目視評価し、チャネルの変形やボンディングの失敗などの視覚的欠陥がないか確認します。
2. 0.02 μmのろ過された脱イオン水を30 mbarの圧力でチャネルに通すことにより、欠陥のないデバイスをテストします。流路とルアーポートの漏れと水流を観察します。
   注意: 漏れを検出できず、チャネルの流れが途切れない場合、デバイスはさらなる実験に使用可能と見なされます。

6.デバイスのセットアップ

1. 2本の5 mLシリンジに20 mLのろ過3%H₂O₂ を充填し、シリンジポンプに取り付けます(必要な距離の移動矢印を使用し、シリンジを挿入し、トップバーで所定の位置に固定します)。
   注意！H₂O₂を取り扱うときは常に注意してください。白衣、保護ゴム手袋、目の保護具を着用してください。
2. 長さ14cmの内径800μmのPTFEチューブをシリンジニードルでシリンジに接続し、ルアーコネクタで装置の入口に接続します。
3. 長さ20cm、内径200μmのポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブをコンセントに接続します。
4. PEEKチューブのもう一方の端を廃液容器に接続します。セットアップを 図 3 に示します。
5. 各インレットの流速500 μL/minでシリンジポンプを始動します(装置画面: 設定>システムセット >シリンジ (メーカー:医療用シリンジ、シリンジ:5 mL)> 戻る ボタン> パラメータ (選択:注入、 繰り返し:1、 容量:1.5 mL、 流量:500 μL/分) >戻る ボタン >戻る ボタン)。フロースルーを廃液容器に回収します。
6. 新しい 5 mL シリンジ 2 本に 20 nm ろ過 70% エタノール 2 mL を充填します。
7. 前のシリンジをエタノール充填シリンジと交換し、手順6.5で説明したのと同じパラメータを使用してシリンジポンプを始動します。
8. 新しい 5 mL シリンジを使用し、5 mL の 20 nm ろ過リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填します。
9. 前のシリンジをPBS充填シリンジと交換し、手順6.1を繰り返して4 mLのPBSでデバイスを洗い流します。および6.5。
   メモ: セットアップユーティリティのパラメータを 容量:4 mLに変更してください(機器画面: 設定>パラメータ >(選択: 容量:4 mL)。
10. デバイスからチューブを抜き、ルアープラグで各入口と出口を閉じます。
    注意: PBSをデバイス内に残し、閉じる前にマイクロピペットを使用して各入口と出口にPBSを追加して、空気を閉じ込めないようにします。
11. デバイスを室温(RT)の暗い場所に一晩放置します。
12. 翌日、PBS を充填したデバイスを 4 mL の 20 nm ろ過 PBS で洗い流します(ステップ 6.8 を参照)。
13. 両方の出口からフロースルーの最後の 1 mL を 2 mL のタンパク質低結合チューブに回収し、デバイスによって導入された粒子のブランクとして 4 °C で保存します。
14. PBSで満たされたシリンジを取り外し、空気で満たされた新しい5 mLシリンジと交換します。
15. すべての液体がデバイスとチューブから排出されるまで、4 mLの空気でデバイスをパージします。

7.標準化されたラテックスビーズによるデバイステスト

1. 1.0 μmのポリスチレンと0.1 μmのカルボン酸ビーズを使用して、標準化されたビーズサンプルを調製します。15 mL チューブに、1.0 μm ポリスチレンビーズ標準試料 500 μL、0.1 μm カルボン酸ビーズ標準試料 1 μL、ろ過済み PBS 9499 μL を加えます(1.0 および 0.1 μm ビーズ混合液の最終濃度は、それぞれ 5 × 108 ビーズ/mL、3.6 × 1010 ビーズ/mLとなります)。
2. ビーズサンプルを30秒間ボルテックスし、使用しない間は+4°Cで保存します。
3. 新しい 5 mL シリンジ 1 本に 1.5 mL の標準化ビーズ混合物を充填し、もう 1 本に 1.5 mL の 20 nm ろ過 PBS を充填します。
4. 以前に取り付けたシリンジを取り外し、ビーズ混合シリンジを最初のインレットチューブに取り付け、もう1つを2番目のインレットチューブに取り付けます。
5. 廃液容器を取り外し、各出口チューブに少なくとも5本の0.5 mL微量遠心チューブを準備します。
6. シリンジポンプシステムの起動パラメータを 容量:1 mLに変更します。 流量:250 μL/分
   注:ユーザーのニーズに応じて、250μL/min、200μL/min、150μL/min、100μL/min、50μL/minなどの異なる流速を設定できます。望ましい結果に最も有利な速度を選択するための予備調査が推奨されます。
7. シリンジポンプを始動し、流出物(各微量遠心チューブに5〜6滴)を収集します。
   メモ: 同じデバイスを複数回使用する場合は、手順 6.8 の説明に従ってデバイスをフラッシュし、すべてのコネクタ、プラグ、および針を交換します。使用済みのコネクタ、プラグ、ニードルを 20 nm ろ過した 70% エタノールに 30 分以上浸けて洗浄します。次に、すべての部品を20 nmろ過脱イオン水を含むチューブに移し、チューブを十分に振とうし、20 mLのろ過脱イオン水を含むシャーレに移します。シャーレをシェーカーの上に100rpmで30分以上置いてから、乾燥したシャーレで(少なくとも12時間)乾燥させてから再利用します。

8.尿サンプルによるデバイステスト

1. 手順6.1〜6.15の説明に従ってデバイスを準備します。
2. 尿滅菌容器を使用してドナーごとに100 mLの朝の尿を採取し、採取から2時間以内に処理のために検査室に送達します。
3. 各尿サンプルを2本の50 mLチューブに分離し、室温で2'000 x g で15分間遠心分離します。
4. 上澄み液を回収し、ペレットを廃棄します。
5. 上清を10'000 x g で30分間遠心分離し、大きな粒子や細胞の破片を取り除きます。
6. 上澄み液を回収し、ペレットを廃棄します。
7. 6.6の説明に従ってデバイスを洗浄します。
8. 5 mL シリンジを、サンプル入口用に調製した尿サンプルを充填した 20 mL シリンジに交換し、バッファー入口用に 20 mL の 20 mL ろ過済み DEPC-PBS を充填した別の 20 mL シリンジに変更します。シリンジポンプの設定を BDPlastipakに変更します。 シリンジ:cc; 容量:20 mL; 流量:250 μL/分(最適流量)、ステップ 6.2 で説明したとおり。シリンジポンプを始動し、各出口から別々の50 mLチューブにフロースルーを回収します。
9. 100,000 分子量のカットオフ濃縮チューブを使用して、各フロースルーを 4 °C で 3,000 x g でそれぞれ 100 μL まで個別に濃縮します。
10. 濃縮液を0.5 mLの微量遠心チューブに移します。
11. 濃縮したサンプルを30秒間ボルテックスしてから、10秒間回転させます。
12. チューブあたり25 μLのサンプルを移してサンプルを分注し、標識し、-80°Cで凍結して長期保存します。

9. コンディショニング培地を用いたデバイス試験

1. 手順6.1〜6.15の説明に従ってデバイスを準備します。
2. Bajo-Santosらによると、37°Cの5%_CO2 加湿環境で細胞を総数が1億に達するまで培養し²⁰ 、細胞を100mLの無血清培地中の単一のT175懸濁フラスコに2%B-27血清代替サプリメントを添加し、5%_CO2 加湿環境で37°Cでさらに48時間培養します。
3. 細胞懸濁液を回収し、室温で300 x g で5分間遠心分離して細胞を取り除きます。
4. 上清を回収し、3,000 x g 、+4°Cで30分間遠心分離し、大きな粒子や細胞の破片を取り除きます。
5. 上清を回収し、分離が起こるまで+4°Cで保存しますが、3時間以内で保存します。
6. 5 mLシリンジを、サンプル入口用に調製した馴化培地を充填し、バッファー入口用に20 mLの20 nmろ過PBSを充填した20 mLシリンジと交換します。
7. 手順7.8の説明に従って、ポンプ場で設定を行います。
8. シリンジポンプを始動し、各出口からのフロースルーを別々の50 mLチューブに集めます。
9. 分子量 100,000 本のカットオフ濃縮チューブを使用して、+4 °C で 3,000 x g でそれぞれ 150 μL になるまで、各フロースルーを個別に濃縮します。
10. 濃縮液を0.5 mLの微量遠心チューブに移します。
11. ボルテックス濃縮サンプルを 30 秒間。
12. 濃縮サンプルを10秒間スピンします。
13. チューブあたり25 μLのサンプルを移してサンプルを分注し、標識し、-80°Cで凍結して長期保存します。

10. 超遠心分離によるEVの分離

1. 固定角ローターを備えた遠心分離機を使用して、20 mLの尿または馴化細胞培地を100,000 x g で+4°Cで70分間遠心分離します。
2. 上清を廃棄し、20 mLの20 nmろ過PBSにペレットを再懸濁します。
3. 10.1で説明したように、再び遠心分離機にかけます。
4. 上清を廃棄し、12 mLの20 nmろ過PBSにペレットを再懸濁します。
5. スイングローターを使用して、100,000 x g で+4°Cで70分間遠心分離します。
6. 上澄みを捨てます。
   注意: 今回は上澄みを捨てるときは注意してください。ピペットで行うことをお勧めします。
7. ペレットを100 μLの20 nmろ過PBSに再懸濁します。
8. サンプルを分注し、EVの特性評価のために設定12に進みます。それ以外の場合は、さらに使用するまで-80°Cで保管してください。

11. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いたEVの単離

1. 100 kDaの分子量カットオフ(MWCO)遠心フィルターユニットを使用して、3,000 x g 、+4°C、15分間、20 mLの尿またはコンディショニングした細胞培地を500 μLに濃縮します。
2. 濃縮液を SEC カラム(負荷量 35 nm 範囲)に移します。
3. 20 nmろ過したPBSをカラムに流し込み、0.5 mLのフラクションを15個回収します。
4. メーカーの指示に従って、動的光散乱(DLS)システムを使用してフラクションを分析します。
5. 選択した分数をプールします。減衰器が11未満で、全粒子の30%以上が40 nmより大きいフラクションを選択してください。
6. 3 kDa分子量カットオフ(MWCO)遠心フィルターユニットを使用して、14,000 x g 、+4°C、15分間、選択したフラクションを100 μLに濃縮します。
7. サンプルを分注し、EVの特性評価のためにセクション12に進みます。それ以外の場合は、さらに使用するまで-80°Cで保管してください。

12. EVの特性評価

1. 特性評価するサンプルを冷凍庫から取り出し、ゆっくりと解凍します(アイスブロック上または+4°C)。
2. ナノ粒子トラッキング分析(NTA)を実行して、粒度分布と粒子量を決定します¹³。高親和性T細胞膜タンパク質4(TIM-4)ダブルサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法(dsELISA)¹⁴ を実施して、サンプル中のEVの存在を確認します。

13. 国税庁

1. 融解したEVサンプルを30秒間ボルテックスし、10秒間スピンした後、20 mLの微量遠心チューブに20 nmでろ過したPBSを1 μLから999 μL移し、1000倍に希釈します。希釈に使用した余分なPBSを1 mL保存して、粒子が含まれていないことを確認します。測定まですべてを+4°Cで保管してください。
   注:使用前にPBSを0.02 nmフィルターでろ過してください。
2. EVサンプルまたはブランクを30秒間ボルテックスし、シリンジを使用してモジュールに挿入します。モジュールに約 0.7 mL のサンプルを充填し、装置に入れます。
3. 製造元の指示に従って、ナノ粒子分析装置を使用してサンプルを測定します。

14. EVマーカーのdsELISA

1. 1 μg/mL の TIM4-Fc タンパク質の溶液を調製します。100 μL の溶液を必要な各ウェルに移して 96 ウェル ELISA プレートのウェルをコーティングし、+4 °C で 200 RPM で振とうしながら一晩インキュベートします。
2. 翌日、洗浄液(1x TBS + 0.05% Tween20 + 2 mM CaCl₂)を調製します。
3. 各ウェルのすべての液体を捨てます。200μLの洗浄液を添加し、室温で200RPMで5分間振とうし、廃棄して各ウェルを洗浄する。この手順を 2 回繰り返します。
4. ブロッキング溶液(1x TBS + 0.05% Tween20 + 1% ウシ血清アルブミン。各ウェルにブロッキング溶液200 μLを添加し、200 RPMで振とうしながら室温で1時間インキュベートします。
5. ステップ14.3の説明に従って、各ウェルを洗浄します。
6. 220 μLのサンプル希釈液を洗浄バッファーに調製します(最適なEV濃度は2.7 × 10⁵ EV/μL)。ウェルあたり 100 μL の希釈サンプルを添加し、2 回繰り返します。200 RPMで振とうしながら、室温で90分間インキュベートします。
7. ステップ14.3の説明に従って、各ウェルを洗浄します。
8. 対応する抗体を100 μLずつ各ウェルに添加します。EVと汚染物質を確認するために適切なEVマーカーを使用する⁴.200 RPMで振とうしながら、室温で2時間インキュベートします。注:二次抗体を使用する場合は、手順14.7〜14.8を繰り返します。ただし、二次抗体のインキュベーション期間は1時間に短縮してください。
9. ステップ14.3の説明に従って、各ウェルを洗浄します。
10. 100 μLの西洋ワサビペルオキシダーゼ基質を各ウェルに加え、プレートを1分間混合し、室温で30分間インキュベートします。
11. 各ウェルに1 M H₂SO₄ を添加して反応を停止します。
12. マイクロプレートリーダーを使用して、450 nmでの吸光度を測定します。

結果

我々は、二股A4F原理(図2B、C)に基づくハイスループットEV分離のために、ソフトリソグラフィー(図2A)を介して3Dプリントされた二重ネガティブモールド(図1)を使用してマイクロ流体デバイスを作製しました。このセットアップでは、図3に示すように、EVを自動隔離するためのポンプとフロースルーステーションが必要です。まず、デバイスの概念実証を評価するために、直径100nmおよび1000nmのポリスチレンビーズの混合物を調製して、それぞれ小胞および微細な細胞破片を表わした¹⁰。分岐流の有無にかかわらず、ビーズ混合物の流速を変えて実験を行い、線速度が分離効率に及ぼす影響を調べました。すべての実験において、小さなビーズの回収率は一貫しており、90%以上であり¹⁰、EVを回収できる可能性を示しています。

次に、最小限の前処理で複雑な生体液から大容量(>1 mL)のEVを分離するCOC-OSTEデバイスの可能性を評価および比較しました。そのため、10人の健康なドナーの尿(図4)と2つの異なる前立腺細胞株の細胞培地(図5)をテンプレートとして使用し、超遠心分離(UC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、およびA4Fマイクロ流体ベースのOSTE-COCデバイスの3つの異なる手順に従ってEVを同時に分離しました。単離後、粒子の総数とその粒度分布をナノ粒子追跡分析(NTA)を用いて評価した。平均して、OSTE-COCデバイスはUCと比較して生体液からの総粒子回収率が良好であることを示しましたが、統計的有意性は両方のポートからの粒子数を組み合わせた場合にのみ達成されました(図4A)。デバイスの性能を他のシステムと比較するには、R&Lコンセントを一緒に考慮する必要があります。 図4に示すように、LとRの出口を合わせた回収EVの性能は、UCとSECを凌駕しています。 これとは別に、Lポートは小さなEVフラクションを捕捉するように設計され、Rポートは同様のサイズの他の分子でより大きなEVフラクションを回収するように設計されています。興味深いことに、OSTE-COCデバイスのR-PORTを使用した回収率は、SECおよびUCのみの場合よりもわずかに高くなりました(図4A)。CD63の発現も同様のパターンを示しました(図4C)。この発見は、OSTE-COCデバイスがEV全体の回収においてより効果的であったことを示しています。異なる分析法間で同等の粒度分布が見られましたが、UC はより大きな粒度分布を示しました(図 4B)。

細胞培地培養でも同様の結果が観察されました。どちらのシナリオでも、両方のデバイスポートからのパーティクルの総回収率は、SEC または UC 分析法と比較して優れた性能を示しました( 図 5A、B を参照)。特に、PC3細胞由来のEVは、他の実験グループと比較して、L-PORT分布の均一性が高く、明確なサイズ分布を示しました(図5C、D)。さらに、CD63発現の解析により、COC-OSTEデバイスを使用してより高いEV回収率が達成されることが確認されました( 図5E、Fを参照)。本研究で検討したさまざまな方法論の単離特性を比較した要約を 表 1 に示します。

図1:3DP蛇行形のダブルネガティブモールドの寸法とアイソメトリックビュー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:COC-OSTEマイクロ流体デバイス。 (A)OSTE-COCデバイスを製造するためのさまざまな主要ステップのスキーム。(B)デバイスの動作原理。(C)完成したデバイスの画像。スケールバー:15mm。この図は、Priedols et ^al.10 および Bajo-Santos et ^al.20 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:デバイスの実験構成。 シリンジポンプは左側、OSTE-COCデバイスは中央、リカバリーステーションは右側にあります。この図は、Priedols et ^al.10 および Bajo-Santos et ^al.20 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:超遠心分離(UC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、およびCOC-OSTEデバイスを使用した10人のドナーからの尿中EVサイズ分布と粒子回収。 (A)ナノ粒子トラッキング分析(NTA)により各単離法から回収された粒子量。データは平均 +/- 標準偏差で表されます。*(p<0.05)で示される統計的有意性。(B)箱ひげ図は、NTAが評価したすべての尿サンプルの平均粒度分布を示し、ひげは最小値と最大値を示します。p値はUCとの比較から導き出され、****は高い統計的有意性(p<0.0001)を示しました。(C)ダブルサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法(dsELISA)を用いて評価した平均CD63量の中央値と範囲を、すべてのサンプルで計算しました。Lポート:左ポート。Rポート:右ポート。この図は、Bajo-Santos et ^al.20の許可を得て修正したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:PC3セルとLNCaPセルから分離したEVの特性評価。 (A)ナノ粒子トラッキング分析(NTA)を用いてPC3培地から回収した粒子量を平均+/-標準偏差で表したもの。(B)NTAを用いてLNCaP細胞培地から回収した粒子量は、平均+/-標準偏差で表されます。(C)PC3培養物由来のEVの粒度分布の中央値と範囲は、NTAによって決定されました。(D)レンジを有するLNCaP培養物から単離されたEVの中央値サイズ分布。(E)ダブルサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(dsELISA)を使用した、PC3細胞株由来EVの各単離法におけるCD63発現の中央値と範囲。(F)各単離法におけるdsELISAによるLNCaP由来EV CD63発現の中央値と範囲。UC:超遠心分離;SEC:サイズ排除クロマトグラフィー;Lポート:左ポート。Rポート:右ポート。この図は、Bajo-Santos et ^al.20の許可を得て修正したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

	UCの	秒	COC-OSTE(コックオステ)
処理時間/サンプル	++/+++	+++	+
スループット	++	+	+++
コスト/サンプル	+	+++	++
純度	+	+++	++
自動化	++	+	+++
EV歩留まり	++	++	+++
サイズ選択	+	++	++

表 1.3つの方式UC SEC、COC-OSTEデバイスによるEVの絶縁特性の比較 UC:超遠心分離;SEC:サイズ排除クロマトグラフィー。COC-OSTE:環状オレフィン共重合体-オフ-化学量論チオール-エン。+:低い;++:ミディアム;+++: 高。*デバイスによって異なります。

ディスカッション

今回紹介したマイクロ流体デバイスは、体液からEVを分離・抽出するための有望な方法を提供し、UCやSEC¹²などの既存のゴールドスタンダード法の重大な限界に対処します。UCとSECは、労働集約的で時間がかかり、歩留まりが低いことが知られているため、大量のEVが必要なハイスループットアプリケーションにはあまり適していません^21,22。対照的に、記載のマイクロ流体デバイスは、最小限のユーザー入力で最大20mLの相当量の体液を連続的に処理できるため、産業または臨床環境におけるゲームチェンジャーとなる可能性があります。このマイクロ流体デバイスの主な利点の1つは、EVアイソレーションを標準化し、手動ステップを必要とする従来の方法と比較して再現性を向上させることができることです。大量生産によってEV絶縁デバイス製造のばらつきを減らすことで、デバイスの性能をより適切に制御し、一貫性を持たせることができ、EVベースの治療や診断などのアプリケーションに不可欠です。さらに、このデバイスは、適切な基板の反応射出成形による大量生産との互換性により、スケーラビリティと幅広い採用の可能性がさらに高まります。

再現性と一貫した性能を確保するためには、チップの製造と実験での使用の両方において、広範で明確に定義されたプロトコルが必要です。このチップは、工業化を念頭に置いて設計されています。しかし、実験室環境でのデバイス製作では、気泡の発生を防ぎ、正確で堅牢な接合を確保し、実際の実験で予想されるよりも速い流速で徹底的なテストを行うことに注意を払う必要があります。この予防措置は、特に高流量でボンディングの失敗により漏れが発生しやすいため、COC-OSTEデバイスにとって特に重要です。さらに、OSTEは感光性材料であるため、デバイスの製造は、不必要な紫外線への曝露を避けるために黄色の光で行う必要があります。この技術はまだ初期段階にあるため、この新しい方法の標準化されたプロトコルはまだ確立されておらず、液体の粘度が私たちの結果に基づいてEVの分離効率に明らかに影響する可能性があるため、研究者はさまざまな流速で実験して特定のアプリケーションに最適な設定を特定する必要があります。これらのガイドラインに従い、標準化の課題に取り組むことで、EVアイソレーションのためのこのマイクロ流体デバイスの可能性は、さまざまな研究分野やアプリケーションにわたって完全に実現することができます。

マイクロ流体デバイスを使用したEV絶縁の方法では、性能を最適化するための広範な変更とトラブルシューティングが可能です。粒子分離を改善するために、研究者はより長いチャネル、異なる膜の空隙率と細孔密度、および変化した寸法を調べることができます。小さな粒子の出口に大きな粒子がたくさんある場合は、バッファーの入口速度を速くすると効果的ですが、大きな粒子の出口に小さな粒子が多数ある場合は、より長いチャネルまたは大きな細孔を持つメンブレンで実験することをお勧めします。粒子の吸収に対処するには、流速、表面改質、OSTE組成の調整、またはUV露光時間の変更が含まれます。不安定性や漏れが発生しているデバイスの場合、流速を下げ、適切な接着を確保することが重要なステップです。EVの損傷を最小限に抑えるために、研究者は流速を下げ、デバイスの滅菌後にPBSでより徹底的に洗浄し、より小さな膜孔または代替の金型設計技術と材料の使用を検討することができます。これらの調整により、マイクロ流体デバイスを微調整することができ、EV研究および関連分野での多様なアプリケーションの可能性を解き放ちます。さらに、デバイスの性能を最適化するために、密度や粘度の測定を含む上流のサンプル特性評価を組み込んで、流量パラメータを調整することができます。さらに、生体液の確立された非無菌性を考えると、サンプルの性質に特に重点を置く必要があります²³。したがって、臨床応用における投与前のサンプルの滅菌は十分に考慮されるべきです。

これらの課題にもかかわらず、マイクロ流体デバイスはさまざまな研究分野で大きな可能性を秘めています。大量の不均質なサンプルからEVを連続的に分離する能力により、自動化への扉が開かれ、ハイスループットアプリケーションが容易になり、さまざまなソースからのEVのより詳細な分析が可能になります。このマイクロ流体モジュールを中空糸細胞バイオリアクターカートリッジや高分解能フローサイトメーターなどのさまざまなデバイスに統合することで、EVアプリケーションをより業界に優しいものにし、ドラッグデリバリー、診断、化粧品などの分野でイノベーションを促進することができます⁴。全体として、このマイクロ流体デバイスは、EV研究の分野における重要な前進を表しており、EV絶縁のための効率的で標準化された方法を提供し、幅広い研究および産業環境で有望なアプリケーションを提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.1 &マイクロ;m カルボキシレート FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	ストック濃度: 3.6 x 1013 ビーズ/mL (LOTに依存)
0.5 mL 微量遠心チューブ	Starstedt	72.704
1 mL ルアーコーンシリンジ 針なしの単回使用	RAYS	TUB1ML
1.0 & micro;m ポリスチレン FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	ストック濃度: 1 x 1010 ビーズ/mL (LOTに依存)
10 mL 血清ピペット	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra 遠心フィルター	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind チューブ	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak
250 & マイクロ;m ID ポリエーテル エーテル ケトン管	ダーウィン マイクロ流体	CIL-1581
3 kDa MWCO 遠心フィルターユニット	メルク ミリポア、	UFC200324
5 mL 医療用注射器 針なし	安徽省 Hongyu Wuzhou 医療	159646
50 mL 円錐管	Sarstedt	62.547.254
70 Ti 固定角超遠心分離機ローター	ベックマン・コールター
800 & マイクロ;m ID ポリテトラフルオロエチレンチューブ	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding	Greiner Bio-One	655001	ELISA plate
B-27 Supplement (50x), 無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044
ウシ血清アルブミン	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas 顕微鏡スライドプラットフォーム	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas顕微鏡スライドプラットフォーム 2 x 16 Mini Luer	マイクロ流体チップショップ	10000387
Elveflow OB1 圧力コントローラー	Elvesys Group
ルアー コネクタ	Darwin Microfluidics	CS-10000095
マスクアライナー Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	ナノ粒子分析装置
光学顕微鏡 Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg 無料です。フィッシャーバイオ試薬。100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC メンブレン (孔径 50 nm、密度 11.8%)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
シャーレ、滅菌済み	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm カラム	Izon	SP5	SEC カラム
QSIL 216シリコーンエラストマーキット	PP&S
樹脂 タフ ブラック	Zortrax
SW40 Ti スイング 超遠心ローター	ベックマン・コールター	331301
シリンジ ポンプ	DK Infusetek	ISPLab002
T175 懸濁液フラスコ	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-FC タンパク質	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)	SigmaAldrich	T0440-100ML	西洋わさびペルオキシダーゼ基質
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
超遠心分離機 Optima L100XP	ベックマン・コールター
超音波洗浄ユニット P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
ユニバーサルマイクロプレート分光光度計	Bio-Tek instruments	71777-1
採尿カップ、150mL、滅菌	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 シリンジ フィルター	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		動的光散乱 (DLS) システム
Zortrax インクスパイア	Zortrax