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方法論記事

エンドソーム由来小胞の大量生産のための磁気分離支援高速均質化法

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DOI:

10.3791/66021

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2024年1月26日

 ,  , 
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

この記事について

サマリー

本稿では、天然の細胞外小胞(EV)の生物学的起源と構造、形態、タンパク質組成が類似する新しいタイプのエクソソーム模倣体(EM)として、エンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産のための磁気分離支援高速ホモジナイズ法について述べる。

要約

細胞外小胞(EV)は、生理学的および病理学的研究、疾患の診断、および治療において大きな注目を集めています。しかし、スケールアップ製造アプローチの欠如により、その臨床的翻訳は制限されてきました。そこで、本プロトコルは、従来の超遠心分離法の約100倍の収率を有するエンドソーム由来のナノベシクルを、エンドソーム由来のエキソソーム模倣体(EM)として大量生産するための磁気分離支援高速均質化法を提供する。この方法では、磁性ナノ粒子(MNP)がエンドサイトーシスを介して親細胞によって取り込まれ、その後エンドソーム内に蓄積されました。その後、MNPを充填したエンドソームを回収し、低張処理と磁気分離により精製した。高速ホモジナイザーを使用して、MNPをロードしたエンドソームを単分散ナノベシクルに分解しました。得られたエンドソーム由来の小胞は、ナノ粒子追跡分析、透過型電子顕微鏡、およびウェスタンブロッティングを特徴とする、同じ生物学的起源と構造を特徴としています。その形態とタンパク質組成は天然EVと類似しており、EMは臨床翻訳のためのネイティブEVの低コストで高収率の代替物として機能する可能性があることを示しています。

概要

細胞外小胞(EV)は、30〜150 nmのサイズ範囲でほぼすべての細胞から分泌される小さな小胞であり、豊富な生理活性物質を含んでいます。EVは、起源の細胞にもよりますが、高い不均一性を示し、親細胞に特異的な複数の成分を持っています1。EVは体液中に放出され、遠隔地に運ばれ、そこで標的細胞に取り込まれて作用し2、組織の修復、腫瘍の診断と治療、免疫調節のための幅広い生理活性分子や薬剤の送達に利用することができる3,4。しかし、体液中で同様の生物物理学的特性を持つ他の生物学的ナノ粒子(リポタンパク質など)やナノベシクル(非エンドソーム経路由来のEV)は、EVの単離と精製に必然的に影響を及ぼします。現在まで、超遠心分離は依然としてEV単離のゴールドスタンダードであり、スクロース密度勾配遠心分離、限外ろ過、ポリエチレングリコール沈殿、クロマトグラフィー、免疫磁気ビーズ単離などの他の分離法が開発されています5。EV治療薬の臨床翻訳と商業化を制限する現在のボトルネックは、EVの高度にスケーラブルで再現性の高い分離を可能にする分離技術の深刻な欠如です6、7、8。従来のEV単離技術(超遠心分離やサイズ排除クロマトグラフィーなど)は、収率が低い(1 x 107-1 x10 8/1 x 106細胞)、長い生産サイクル(24-48時間)、製品品質の再現性が低く、高価でエネルギー集約的な生産設備を必要とするため、EVに対する現在の臨床需要を満たすことができません6。

在来EVの合成代替品であるエクソソーム模倣体(EM)は、構造、機能、生産のスケーラビリティが非常に似ているため、重要な注目を集めています。EMの主な発生源は、連続切片化による親細胞全体の直接押し出しによるもので9,10、天然EVとしての強力な生物学的機能を示しています11,12。例えば、ヒト臍帯間葉系幹細胞(hUCMSC)に由来するEMは、天然のEVと同様の創傷治癒効果を発揮し、タンパク質組成が豊富である13。全細胞由来のEMはEVのような生物学的な複雑さを持っていますが、その主な欠点は、さまざまな細胞小器官や細胞破片によって必然的に汚染されるため、製品の不均一性です。さらに、タンパク質局在解析により、全細胞押出に由来するEMには、ミトコンドリアや小胞体由来の非EV特異的タンパク質が多数含まれていることが明らかになった13。さらに、EMを製造するためのほとんどの方法は、非常に時間とエネルギーを消費するプロセスである超遠心分離を必要とします14。エクソソームが細胞エンドソームのみに由来するという事実を考慮し、バイオエンジニアリングされたエンドソーム由来のナノベシクルは、全細胞押出法によって生成された確立された細胞膜由来のEMと比較して、エクソソームとEMの間の生物学的相同性をよりよく再現する可能性があるという仮説を立てました14。それにもかかわらず、エンドソーム由来のナノベシクルの製造は、実行可能なアプローチがないために困難です。

EVを無細胞治療の代替として、またナノスケールのドラッグデリバリーシステムとして、様々な疾患の治療に活用した臨床研究が行われています。例えば、骨髄間葉系幹細胞由来のEVは、COVID-19による重症肺炎の治療に使用され、有望な結果を達成しています。最近では、CD24タンパク質を搭載した遺伝子組み換えEVも、COVID-19患者の治療に強力な治療効果があることが実証されています15,16。しかし、EV療法の臨床的要件は、収量とコストが低いため、従来の分離方法ではまだ満たすことができません。本研究は、磁気分離支援高速均質化法によるエンドソーム由来ナノベシクルの大規模生産について報告する。MNPのエンドサイトーシス経路を利用して、MNPがロードされたエンドソームを磁気分離によって分離し、その後、高速ホモジナイズしてエンドソームを単分散ナノベシクルに製剤化します。このプロトコルによって収集されるエンドソームの種類は多様であるため、業界で適正製造基準(GMP)を確立するには、さらに詳細な研究が必要です。この新しいEM調製アプローチは、ネイティブEVと相同なナノベシクルを得るための時間効率(5分間の高速ホモジナイズ)です。これは、一般的にさまざまな細胞タイプに適用できる超遠心分離よりも、同じ量の細胞から指数関数的に多くの小胞を生成します。

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プロトコル

注:この方法の概略図を 図1に示します。

1. EMの準備と分離

  1. MNPの細胞内在化
    1. 細胞培養
      1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および5%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(P/S)を含むDMEM完全培地に、1×106ラット骨髄間葉系幹細胞(BMSC)、293T細胞、またはマウス卵巣上皮がん細胞(ID8)を懸濁します(6ウェルプレートあたり2 mL)。
      2. 細胞を37°C、5%CO2で一晩培養します。
        注:接着後の細胞数は約1×106であった。
    2. MNPのエンドサイトーシス
      1. 各 6 ウェルプレートの培地容量を 1 mL に減らします。10 nmのポリリジン修飾酸化鉄ナノ粒子(IONP)( 材料表を参照)と100 μg/1 × 106 細胞の濃度で細胞を共培養し、5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで12 時間インキュベートして、細胞がIONPを完全にエンドサイトースできるようにします。
  2. エンドソームの単離と均質化
    1. 細胞低張治療
      1. IONPを完全に取り込んだ細胞を0.5 mL/ウェルトリプシンで3分間消化し、1 mL/ウェル完全培地を添加して消化を終了します。
      2. 1000 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、遠心分離機で2回繰り返して、残留培地と吸収されていないIONPを洗い流します。
      3. 最後に、ペレットをあらかじめ調製した高張溶液(71.4 mM塩化カリウム、1.3 mMクエン酸ナトリウム、pH 7.2-7.4)に8 mLで15分間再懸濁します( 材料表を参照)。
    2. 低速ホモジナイズによるオルガネラの放出
      1. 低張溶液中の細胞懸濁液をガラス試験管に移し、ガラスホモジナイザー( 材料表参照)を使用して1000rpmで20回の衝撃で細胞小器官を放出します。
    3. エンドソームを得るための磁気分離
      1. ホモジナイズした細胞溶液1 mLを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、磁気分離器に1時間入れて、IONP負荷エンドソームを他の細胞小器官(核やミトコンドリアなど)や細胞破片から完全に分離します。
      2. 磁気フレーム( 材料表を参照)の隣にある微量遠心チューブの接触面、つまりIONPをロードしたエンドソームに茶色のペレットを回収します。微量遠心チューブ内の液体を廃棄し、3 mLのPBSを加えてエンドソームを再懸濁します。
  3. 高速均質化
    1. エンドソームを含む溶液を、液量が3〜10mLの15mL遠心チューブに移します。
    2. 高速ホモジナイザーの 10 mm プローブ ( 材料表を参照) を遠心分離管の底部に触れずに伸ばします。画面下の 速度 ボタンを調整し、速度を140 x gに設定し、 時間ボタンを調整して5分の 時間 を設定してから、 OK ボタンを押します。
    3. スタートボタンを押して、サンプルの下にアイスボックスを置いた後、均質化を実行します。
  4. EMの磁気選別
    1. 高速ホモジナイズで得られたナノベシクルを含む溶液を1.5mLの微量遠心チューブに移し、磁気分離器に1時間入れます。
    2. 必要なEMを含む液体を収集します。遊離IONPとIONP負荷EMを吸着した磁気フレームの隣のチューブの表面に触れないように注意してください。

2. EM特性評価(図2および図3)

  1. 動的光散乱(DLS)解析
    1. 壁に沿って 1 mL の EM サンプル(20 μg/mL)をキュベットに注入し、DLS 装置の装置サンプルスロットに入れます( 材料表を参照)。
    2. DLSソフトウェアを開き、[ 粒子サイズテスト]を選択して、テストを開始します。
    3. BCAタンパク質アッセイキット( 材料表を参照)を使用してタンパク質濃度を測定します。
  2. ナノ粒子トラッキング分析(NTA)
    1. EM を PBS で 1 × 107-1 × 108 粒子/mL の溶液に希釈し、1 mL シリンジを使用して 500-1000 μL/分の流速で NTA 装置のチャンバーに注入します ( 材料表を参照)。
    2. 488のレーザーチャンネルを開き、ソフトウェアインターフェースのEMの数が100〜300以内で、ブラウン運動していることを確認します。
    3. メーカーのプロトコルに従って、適切なSOP(EV-488)を選択し、機器の感度がEM検出に適していることを確認してください。
  3. 透過型電子顕微鏡(TEM)
    1. EM(1 mg/mL)を等量の 5% グルタルアルデヒドで 30 分間固定し、BCA タンパク質アッセイキットで EM の濃度を 1 mg/mL として定量します。
    2. 銅メッシュのカーボン側にEMを10μL滴下し、10分後にろ紙で余分な液体を取り除きます。PBS10 μLを加え、すぐにろ紙でブロットします。これを2回繰り返して、余分なグルタルアルデヒドを取り除きます。
    3. 酢酸ウラニル造影剤5μLを滴下し、1分間ネガティブ染色した後、余分な造影剤を除去します。脱イオン水で3回洗浄し、室温(RT)で乾燥させます。
    4. 加速電圧100kVのTEMで画像を記録します。
  4. ウェスタンブロッティング
    1. 100 μLの細胞溶解バッファーと50倍プロテアーゼ阻害剤カクテル5 μLをサンプルに加えます( 材料表を参照)。ピペットガンで穏やかに混ぜ、30分間氷の上に置きます。
    2. 溶液を1000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、BCAタンパク質アッセイキットで上清のタンパク質濃度を定量し、回収します。
    3. 上清100 μLを25 μLの5xタンパク質ローディングバッファーと混合し、95°Cで10分間加熱します。
    4. 予備成形されたゲルの指示に従ってゲルを調製する。1ウェルあたり15 μgのタンパク質をロードし、80 Vでゲル電気泳動を行い、サンプルが分離ゲルに流れるのを待ち、100 Vに変更してから、タンパク質を100 Vのニトロセルロースメンブレンに移し、氷浴下で60分間泳動します。
    5. 非EV特異的マーカー(カルネキシン)およびEVバイオマーカー(アネキシンおよびCD63)をウェスタンブロッティングで検出します( 材料表を参照)。
      注:抗体は、メーカーの推奨に従って希釈されています。

3. in vitro EM機能検出

  1. EMのラベリング
    1. 1 μL の PKH26 と 250 μL の希釈液 C(1:250)を混合して、2 倍染色溶液 (4 × 10-6 M) を調製します ( 材料表を参照)。
    2. 250 μL の EM (1 mg/mL) を 2 倍染色液 250 μL と混合し、ピペッティングガンですばやくブローします。
    3. 遠心分離管を静かに反転させながら、室温で2〜5分間インキュベートします。
    4. 等量の血清または1%ウシ血清タンパク質を添加し、1分間インキュベートして消化を終了します。
    5. 1000 KD限外ろ過チューブで3000 x g で30分間限外ろ過することにより、余分なPKH26を除去し、PBSを添加して3回繰り返します。残りの液体をPBSで500 μLに再懸濁し、0.22 μmフィルターでろ過します。
  2. 細胞取り込みアッセイ
    1. 細胞接種:10%FBSおよび5%P/Sを含むDMEM1 mLを含む35 mm共焦点皿に1×10 6個の細胞を 播種し、37°Cおよび5%CO2 で一晩インキュベートします。
    2. 0.22 μmの滅菌シリンジフィルターでEMをろ過し、潜在的な汚染を除去します。
    3. 細胞をPKH26標識EM(10,9粒子/mL)で8時間処理します。
    4. PBSで3回洗浄し、DAPI(10 ng/mL)を添加し、室温で10分間インキュベートします。
    5. 405 nmおよび561 nmのレーザーチャンネルを使用して、共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します( 材料表を参照)。

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結果

磁気分離支援高速均質化によるEM調製のワークフローを 図1に示します。細胞は10 nmのポリリジン修飾IONPを内在化し、エンドサイトーシスを介してエンドソームに特異的に蓄積されます(図3A)。ハイポトニックバッファーで処理され、ホモジナイズされた後、IONP負荷エンドソームは細胞から放出され、続いて磁気分離によって収集されます。単離されたエンドソームは、高速ホモジナイズによってさらに単分散ナノベシクル(EMとも呼ばれる)に再構成されます。複数の重要なパラメータ(均質化の速度や時間など)を調べて、最適なEM調製条件を特定しました(図2)。最後に、140 x g で 5 分間の均質化速度を、製造された EM の粒子径と収率を考慮して最適な条件として選択しました。遊離 IONP および IONP 負荷 EM は、最終的に 2 回目の磁気分離によって最終生成物溶液から除去され、IONP フリーの EM が得られます。この方法は、天然のEVと同じ生物...

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ディスカッション

無細胞治療とナノスケールのドラッグデリバリーシステムの代替物であるEVは、臨床上の期待にまだ応えられておらず、主な障害は、スケーラブルで再現性のある製造および精製方法の欠如です6。そのため、生物学的に複雑な性質を持つEV類似体として、様々な種類のEMが開発されている14。現在、最も一般的に使用されているEMの例は、細胞質膜由来のナノベシクルです。このようなナノベシクルの調製は、親細胞全体を直接押し出すことによって比較的容易かつ容易である17。しかし、細胞質膜由来のナノベシクルは、2つの欠点により、天然のEVを再現することができません:第一に、これらのナノベシクルの生物学的起源は、天然のEVと比較して異なる脂質とタンパク質の組成を含む細胞原形質膜に由来します。第二に、非EV細胞小器官や細胞破片からのタンパク質、核酸、脂質などの汚染は、EMの不均一性を必然的に引き起こします。この方法では、細胞をIONPとインキュベートし、磁気分離によってIONPをロードしたエンドソームを回収し、高速ホモジナイズによ...

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開示事項

D.W.とP.G.は、中国科学院基礎医学・がん研究所(IBMC)が出願した特許出願の共同発明者です。もう一人の著者は、利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

著者らは、中国科学院基礎医学・がん研究所(IBMC)の共用機器コア施設で機器が使用されていることを認めている。本研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC;82172598)、中国浙江省自然科学基金会(LZ22H310001)、中国浙江省衛生健康委員会の551健康人材育成プロジェクト、杭州市科学技術局農業社会発展研究プロジェクト(2022ZDSJ0474)、銭塘学際研究助成金の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アネキシン抗体ABclonalA11235Western blotting
BCA assay kitBeyotimeP0012タンパク質濃度アッセイ
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
CD63 antibodyABclonalA19023Western blotting
Western and IPBeyotimeP0013Westernブロッティング
遠心分離機BeckmanAllegra X-30R細胞遠心分離機
CO2インキュベーターサーモセルカルチャー
共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡NIKONA1 HD25蛍光写真
DMEM 基本 (1x)GIBCOC11995500BT細胞培養
動的光散乱 (DLS)マルバーンゼータサイザー ナノ ZS ZEN3600直径分析
電気ガラスホモジナイザーSCIENTZ(中国・寧波)DY89-II低速均質化
エクソソーム枯渇FBSシステム バイオサイエンスEXO-FBS-50A-1細胞培養
高速ホモジナイザーSCIENTZ(中国・寧波)XHF-DY高速均質化
磁気格子Tuohe Electromechanical Technology (上海、中国)NAMagnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-AldrichPKH26GL-1KTこのキットには、PKH26 細胞リンカーをエタノールおよび希釈剤 C
ポリリジン変性酸化鉄ナノ粒子 (IONPs)Zhongke Leiming Technology (中国、北京)Mag1100-10細胞培養
カリウム塩化物アラジン7447-40-7細胞高張治療
プロテアーゼ阻害剤BeyotimeP1030プロテイナーゼ阻害剤
エン酸ナトリウムアラジン7447-40-7細胞低張治療
透過型電子顕微鏡(TEM)日本電子JEM-2100plus形態画像
超遠心分離機ベックマンオプティマXPN-100エキソソーム遠心分離機
ゼータView ナノ粒子  トラッキングアナライザーParticle MetrixPMX120ナノ粒子トラッキング分析
カクテル ク

参考文献

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