方法論記事

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

DOI：

10.3791/66023

⸱

2023年11月10日

 ,  , 
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

極低温電子顕微鏡(クライオEM)グリッドに支持層を適用することで、粒子密度を高め、空気と水の界面との相互作用を制限し、ビーム誘起運動を低減し、粒子配向の分布を改善することができます。この論文では、クライオサンプル調製を改善するために、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの単層でコーティングするための堅牢なプロトコルについて説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

極低温電子顕微鏡(クライオEM)では、精製された高分子を穴あき炭素箔を含有するグリッドに塗布します。次に、分子を吸い取って余分な液体を除去し、約20〜100 nmの厚さのガラス質氷の層で急速に凍結し、幅約1 μmの箔穴に懸濁させます。得られた試料は、極低温透過型電子顕微鏡を用いて画像化され、適切なソフトウェアを用いて画像処理を行った後、原子分解能に近い構造を決定することができる。クライオ電子顕微鏡は広く採用されていますが、サンプル調製は依然としてクライオ電子顕微鏡ワークフローにおける深刻なボトルネックであり、ユーザーは懸濁したガラス質の氷の中でサンプルの挙動が悪いという課題に遭遇することがよくあります。最近では、グラフェンの単一の連続した層でクライオ電子顕微鏡グリッドを修飾する方法が開発されており、グラフェンは支持面として機能し、多くの場合、画像領域内の粒子密度を高め、粒子と空気-水界面の間の相互作用を減らすことができます。ここでは、グラフェンをクライオ電子顕微鏡グリッドに適用し、得られたグリッドの相対的な親水性を迅速に評価するための詳細なプロトコルを提供します。さらに、グラフェンの特徴的な回折パターンを可視化することでグラフェンの存在を確認するEM法についても述べる。最後に、比較的低濃度の純粋なサンプルを用いて、Cas9複合体の2.7 Åの分解能密度マップを迅速に再構築することにより、これらのグラフェン担体の有用性を実証します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子を可視化するために広く使用されている方法に進化しました1。直接電子検出 2,3,4、データ取得5、画像処理アルゴリズム 6,7,8,9,10 の進歩により、クライオ電子顕微鏡は、急速に増加する高分子の原子分解能に近い分解能の 3D 構造を生成できるようになりました 11.さらに、このアプローチの単一分子の性質を活用することにより、ユーザーは単一のサンプルから複数の構造を決定することができ12、13、14、15、生成されたデータを使用して不均一な構造アンサンブルを理解することの有望性を強調しています16、17。このような進歩にもかかわらず、クライオ試料グリッド調製のボトルネックは続いています。

クライオ電子顕微鏡による構造特性評価では、生体試料を水溶液に十分に分散させた後、ガラス固化と呼ばれるプロセスで瞬間凍結する必要があります18,19。目標は、通常はアモルファス炭素の層に切り込まれた等間隔の穴に懸濁したガラス化氷の均一な薄層に粒子を捕捉することです。このパターン化されたアモルファスカーボン箔は、銅または金の支持棒のメッシュを支持するTEMグリッドによって支持されています。標準的なワークフローでは、グリッドは、サンプルを塗布する前にグロー放電プラズマ処理を使用して親水性になります。余分な液体は濾紙で吸い取られ、タンパク質溶液が穴を横切って薄い液体膜を形成し、プランジ凍結中に容易にガラス化できます。一般的な課題には、空気水界面(AWI)への粒子の局在化とそれに続く変性20,21,22または好ましい配向の採用23,24,25、粒子の穴内への移動ではなく炭素箔への付着、および穴内の粒子のクラスタリングと凝集26が含まれます.不均一な氷の厚さも懸念事項です。厚い氷は、電子散乱の増加により顕微鏡写真のバックグラウンドノイズのレベルが高くなる可能性がありますが、極端に薄い氷はより大きな粒子を排除する可能性があります27。

これらの課題に対処するために、さまざまな薄いサポートフィルムを使用してグリッド表面をコーティングし、粒子をこれらのサポートに乗せ、理想的には空気と水の界面との相互作用を回避できるようにしています。グラフェン支持体は、部分的には、その高い機械的強度と、支持体層28によって付加されるバックグラウンド信号を低減する最小の散乱断面積と相まって、大きな有望性を示している。グラフェンは、バックグラウンドノイズへの寄与が最小限であることに加えて、顕著な電気伝導率と熱伝導率も示します29。グラフェンおよび酸化グラフェンでコーティングされたグリッドは、より高い粒子密度、より均一な粒子分布30、およびAWI22への局在の減少をもたらすことが示されている。さらに、グラフェンは、さらに次のように修飾することができる支持表面を提供する:1)官能基化31,32,33を通じてグリッド表面の物理化学的特性を調整する。または2)目的のタンパク質の親和性精製を促進する結合剤34,35,36。

本稿では、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェン30の単一の均一な層でコーティングするための既存の手順を変更しました。この変更は、歩留まりと再現性の向上を目的として、プロトコル全体でグリッド処理を最小限に抑えることを目的としています。さらに、プランジング前にグリッドを親水性にする際のさまざまなUV/オゾン処理の有効性を評価するためのアプローチについても説明します。グラフェンでコーティングされたグリッドを用いたクライオ電子顕微鏡サンプル調製のこのステップは重要であり、得られたグリッドの相対的な親水性を定量化する簡単な方法が有用であることがわかりました。このプロトコルを用いて、ガイドRNAおよび標的DNAとの複合体において、触媒的に不活性な 化膿菌 Cas9の高解像度3D再構成を生成することにより、構造決定にグラフェンコーティングされたグリッドを採用することの有用性を実証します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. CVDグラフェンの作製

  1. グラフェンエッチング液を以下のように調製する。
    1. 4.6 gの過硫酸アンモニウム(APS)を20 mLの分子グレードの水に50 mLのビーカーに溶解して1 Mの溶液にし、アルミホイルで覆います。APSを完全に溶解させながら、手順1.2に進みます。
  2. メタクリル酸メチル(MMA)コーティング用のCVDグラフェンの切片を調製します。CVDグラフェンの正方形の断面を慎重に切断します。正方形を清潔なペトリ皿内のカバーガラス(50 mm x 24 mm)に移し、スピンコーターへの輸送中にカバーします。
    注:18 mm x 18 mmの正方形は、25〜36個のグラフェンコーティングされたグリッドを生成する必要があります。

2. CVDグラフェンをMMAでコーティング

  1. スピンコーターの設定を、2,500rpmで60秒の高速スピンに設定します。CVDグラフェンを適切なサイズのチャックに慎重に配置します。
    注:理想的には、CVDグラフェンは、MMAが真空システムに入るのを防ぐために、選択したチャックの端に1〜2mm伸びます。
  2. Take/Absorbボタンを押して真空ポンプを作動させ、CVDグラフェンをチャックに固定します。CVDグラフェンスクエアの中心にMMAを塗布し、蓋を閉め、すぐにスタート/ストップボタンを押します。18 mm x 18 mm角のCVDグラフェンの場合、40 μLのMMAで十分です。
  3. 回転が止まったら、真空ポンプを外し、ピンセットでMMAコーティングされたCVDグラフェンを慎重に回収します。MMAコーティング面が下を向くようにCVDグラフェンを反転させ、ガラスカバーガラスに戻します。

3. グラフェン裏面のプラズマエッチング

  1. カバーガラス上のCVDグラフェンをグローディスチャージャーに転写し、フラットチップピンセットを使用して25 mAで30秒間グロー放電します。
  2. カバーガラス上のCVDグラフェンをペトリ皿に戻し、銅エッチングエリアへの輸送中にカバーします。MMAコーティングは、上面のグラフェン層をプラズマエッチングから保護します。

4. 格子サイズのMMAコーティングCVDグラフェンスクエアの切断

  1. 2組のピンセットを使用して、CVDグラフェンスクエアを支えます。CVDグラフェンの正方形の向きに注意し、ピンセットに取り付けている間はMMA側を上にしてください(CRITICAL)。
  2. CVDグラフェンを約3 mm x 3 mmの正方形に切断します。このステップでは、2組の逆作用鉗子を使用して、CVDグラフェンの正方形を右側を上にして所定の位置に固定し、3 mm x 3 mmの正方形の端を正方形の残りの部分から切断した後に保持します。

5. MMA被覆CVDグラフェンからの銅基板の溶解

  1. 3 mm x 3 mmの正方形をAPSソリューションに慎重に浮かべます。各正方形を解放する前に、APSソリューションの表面に接触してください。ビーカーを傾けて、各正方形を浅い角度で溶液に入れることができるようにします。これにより、正方形が沈み込まなくなります。
  2. ビーカーをアルミホイルで覆い、25°Cで一晩インキュベートします。

6. APSからのMMA/グラフェン膜の除去

  1. 寸法が12 mm x 50 mmのガラスカバーガラスを使用し、カバーガラスをAPSに垂直に静かに突っ込み、次にカバーガラスを横方向に動かして、浮遊するMMA/グラフェンスクエアに接するようにAPSからMMA/グラフェンスクエアを取り出します。
  2. カバーガラスを慎重に取り外し、取り外し時に正方形がカバーガラスの側面に完全に付着していることを確認してください。
  3. MMA/グラフェンスクエアを、分子グレードの水で満たされた清潔な50 mLビーカーに20分間移します。MMA/グラフェンの正方形を水に垂直に取り付けたカバーガラスを静かに沈め、水面との相互作用時に正方形がカバーガラスから外れるようにします。すべてのMMA/グラフェンスクエアについて繰り返します。

7. グラフェンのグリッドへの接着

  1. ネガティブアクションピンセットを使用して、カーボン側を浮遊するMMA/グラフェンの正方形に向けて、グリッドを垂直に水にそっと浸します。正方形に接触したら、グリッドを慎重に取り外し、取り外し時に正方形がグリッドのカーボン側に完全に付着していることを確認します。水に沈んだときのグリッドの横方向の動きを最小限に抑えて、グリッドの正方形の損傷を防ぎます(CRITICAL)。
  2. MMA /グラフェン面を上にしてきれいなカバーガラスにグリッドを置き、1〜2分間風乾します。カバーガラスグラフェン/MMAコーティングされたグリッドを、フラットチップピンセットを使用して130°Cに設定されたホットプレートに移します。
  3. ガラスペトリ皿の上部で覆い、20分間インキュベートします。火から下ろし、室温まで1〜2分間冷まします。
    注意: ペトリ皿の上部は非常に高温になるので注意してください。

8.MMAをアセトンで溶解する

  1. カバーガラス全体を15 mLのアセトンで満たされたペトリ皿に移します。30分間インキュベートします。
  2. 清潔なガラス製血清ピペットを使用して、グリッドをインキュベートしたアセトンを廃液容器に移します。清潔なガラス製血清ピペットを使用して、15 mLの新鮮なアセトンをペトリ皿に慎重に加えます。30分間インキュベートします。
  3. これらの洗浄手順を繰り返して、合計3回のアセトン洗浄を行います。

9. イソプロパノールによる残留アセトンの除去

  1. アセトンを 3 回洗浄した後、アセトンを除去し、清潔なガラス製血清ピペットを使用して 15 mL のイソプロパノールと交換します。20分間インキュベートします。
  2. イソプロパノール洗浄を合計4回繰り返す。イソプロパノールからグリッドを慎重に取り除き、ピンセットを使用して清潔なカバーガラスで風乾します。
    注意: イソプロパノールが残っていると、ピンセットからグリッドを解放するのが難しくなる可能性があります。グリッドをピンセットから外す前に、グリッドと清潔なカバーガラスを接触させることで、この問題を軽減できます。
  3. グラフェンでコーティングされたグリッドでカバーガラスを100°Cに設定されたホットプレートに10分間移し替えて、残留有機物を蒸発させます。室温まで冷却し、使用するまで真空下で保管してください。

10. グラフェン被覆グリッドのUV/オゾン処理

  1. 逆作用ピンセットを使用して、グラフェンでコーティングされた面を上にして、UV /オゾンクリーナーのクリーンな照明領域にグリッドをそっと配置します。
  2. 照明エリアをスライドさせて閉じ、マシンの電源を入れます。 タイムダイヤルを指定された処理時間まで回して、グリッドのUV /オゾン処理を開始します。
    注:処理期間は調整可能なパラメータであり、過剰な処理はグリッドを損傷する可能性があります。Han et al.30 は10分間のUV/オゾン処理を推奨しており、10分間の治療で十分であることもわかっています。この治療時間の調整に関するガイダンスについては、手順12を参照してください。.
  3. Koh et al.37 に記載されているプランジステップに従って、処理したグリッドにクライオ電子顕微鏡サンプルを直接プランジします。
    注:大気中の炭化水素は、UV /オゾン処理後にグリッド表面に蓄積し、グラフェン表面の疎水性を高める可能性があります38,39。これを回避するには、UV /オゾン処理されたグリッドをすぐにプランジしてください。例えば、UV/オゾンが6つのグリッドを処理し、それらの6つのグリッドを直ちにプランジし、次にUV/オゾンがグリッドの2番目のバッチを処理し、続いて2番目のバッチをプランジするなど、UV/オゾンをバッチで処理することが有利な場合があります。

11. 回折像の撮影

  1. 顕微鏡が平行照明を確立して適切に調整されていることを確認し、最終的な焦点ぼけを-0.2μmに設定します。
  2. 蛍光スクリーンを挿入すると、ビームが完全に停止します。回折モードに入ると、回折スポットがはっきりと可視化されます。
  3. CCDカメラで画像を取得し、画像解析ソフトで評価します。
    注:グラフェン単分子膜によって生成される最も容易に観察され識別可能な回折スポットは、空間周波数2.13 Åに対応する6つのスポットです。測定ツールを使用して、回折ビームの中心からこれらの回折スポットの1つまでの距離を逆数単位で推定します。特に 2.13 Å figure-protocol-1 0.47 Å-1 である。

12. グリッド親水性の評価

  1. イメージング設定を準備します。電話スタンド、卓上イメージング面、カメラ付き電話、ガラスカバーガラス、パラフィンフィルムを用意します。ここに示した画像は、提供された.stlファイルを使用して3Dプリントされた電話スタンドと卓上イメージング面を使用して取得され、より簡単に再現可能で定量化可能な接触角測定が得られました(補足図1A)。
  2. ガラスカバーガラスを平らな面に置き、1cm×1cm四方のパラフィンフィルムをカットして、ガラスカバーガラスの上に置きます。電話機を電話スタンドに置き、カメラがガラスのカバーガラスと面が合うように電話機の向きを合わせます。輪ゴムを使用して、電話機をこの位置に固定します(補足図1B)。サンプル写真を撮って、カメラがイメージング面に位置合わせされていることを確認します。
  3. グラフェンでコーティングされたグリッドのUV/オゾン処理の直後に、ガラスカバーガラスの正方形のパラフィンフィルムの上に単一のグリッドを配置します。グラフェン側が上を向いていることを確認します。2μLの水滴をピペットでグリッド面の中央に含め、すぐに撮影します。
    注:この手順を次の後に繰り返します:i)十分な治療期間を決定するために、UV /オゾン処理の望ましい間隔。またはii)UV /オゾン処理後の所望の時間間隔で、処理後、グリッド表面が親水性を維持する期間を測定します。
  4. 写真をImageJ43 にインポートし、接触角プラグインを使用して、写真から接触角を計算します。

13. dCas9複合体データセットの単粒子解析

注:このプロトコルで記述されているすべての画像処理は、cryoSPARCバージョン4.2.1を使用して実行されました。

  1. Patch Motion Correction ジョブと Patch CTF Estimation ジョブを使用してムービーを前処理します。ブロブピッカージョブを使用して、直径115 Åから135 Åの範囲の球状ブロブを使用してパーティクルピッキングを実行します。
  2. 正規化相関係数(NCC)と検出力のしきい値を使用して、顕微鏡写真から抽出ジョブを使用して粒子を抽出し、顕微鏡写真あたり約200〜300個の粒子を生成します。適切な閾値と結果として生じる粒子数は異なる場合があり、ユーザーは適切な条件を特定するために、さまざまな顕微鏡写真でピック品質を検査する必要があることに注意してください。
  3. Ab-initio 再構成ジョブを使用して、3 つのクラスを必要とするマルチクラスの初期再構成を実行します。3 つのクラスのうち 2 つには、表面汚染物質を含む非 Cas9 粒子が含まれている可能性があります。さらに処理するには、dCas9 に似たクラスを選択します。
    注:粒子スタックをさらに洗練させるために、マルチクラスAb-initio再構成または不均一次次性再構成の追加ラウンドを適用できます。
  4. 既定のパラメーターを選択する [不均一細分化] ジョブを使用して 3D 細分化を実行します。検証(FSC)ジョブとThreeDFSCジョブを使用して、最終的な3Dリファインメントのマップとマスクを使用して、再構成の解像度を推定します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで概説した装置(図1)とプロトコール(図2)を用いてグラフェン被覆クライオ電子顕微鏡グリッドの作製に成功すると、箔穴を覆うグラフェンの単層が得られ、その特徴的な回折パターンによって確認することができます。グラフェン表面へのタンパク質吸着を促進するために、UV/オゾン処理を使用して、酸素含有官能基を取り付けることで表面を親水性にすることができます。しかし、空気中の炭化水素汚染物質は、UV/オゾン処理後5分という早い時間でグラフェン表面に吸着し、この影響を打ち消す可能性があります38,39。重要なのは、UV/オゾン処理の期間と、処理からプランジまでの経過時間の両方がサンプルの品質に影響を与える可能性があることです。表面接触角に基づいてコーティングされたグリッドの親水性を評価する簡単な方法を使用して、これらの効果を実証します(図3、ステップ12を...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クライオ電子顕微鏡によるサンプル調製には多くの技術的課題が伴い、ほとんどのワークフローでは、脆弱なグリッドを損傷しないように細心の注意を払って手動で操作する必要があります。さらに、ガラス化に対するサンプルの適応性は予測不可能です。粒子は、空気と水の界面やグリッドを覆う固体支持箔と相互作用することが多く、非常に高いタンパク質濃度を適用しない限り、粒子が好ましい方向を向いたり、イメージングホールに入らなかったりする可能性があります24。穴の開いたクライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの連続単層で重ね合わせることは、顕微鏡写真上の粒子分布の改善、低濃度での粒子数の増加、および空気-水界面での相互作用によって引き起こされる好ましい配向の減少において非常に有望であることが示されている30。

クライオ電子顕微鏡グリッド用の既存のグラフェンコーティングプロトコルの限界は、コーティングプロセスに必要な広範な手動操作であり、品質を損ない、グリッド間のばらつきを増加させる可能性があります。この研究では、クラ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らに開示すべき矛盾はない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

標本は、MIT.nanoのクライオ電子顕微鏡施設で、Arnold and Mabel Beckman Foundationのおかげで得られた顕微鏡で準備され、画像化されました。接触角イメージングデバイスは、MIT Metropolis Maker Spaceでプリントされました。Nieng Yan氏とYimo Han氏の研究室、そしてMIT.nanoのスタッフには、この手法の採用を通じてサポートしてくださったことに感謝します。特に、Guanhui Gao博士とSarah Sterling博士の洞察に満ちた議論とフィードバックに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01-GM144542、5T32-GM007287、およびNSF-CAREER助成金2046778の支援を受けました。デイビス研究室での研究は、アルフレッド・P・スローン財団、ジェームズ・H・フェリー基金、MIT J-Clinic、ホワイトヘッド・ファミリーの支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
250 mL ビーカー (3x)Fisher02-555-25B
50 mL ビーカー (2x)Corning1000-50
Acetone FisherA949-4
アルミホイルFisher15-078-292
過硫酸アンモニウムFisher(I17874
カバースリップ 50 mm x 24 mmMattekPCS-1.5-5024
CVDグラフェングラフェンCVD-Cu-2x2
easiGlowディスチャージャーテッドペラ91000S
エタノールミリポアシグマ1.11727
フラットチップピンセット フィッシャー50-239-60
ガラスカッターグレインジャー21UE26
ガラスペトリプレートとカバー VWR75845-544
ガラス血清ピペットフィッシャー13-676-34D
グリッド収納ケースEMS71146-02
ホットプレートフィッシャー07-770-108
イソプロパノールシグマW292907
キムワイプフィッシャー06-666
ラボはさみ フィッシャー13-806-2
メチルメタクリレートEL-6 KayakuMMA M310006 0500L1GL
分子グレード水コーニング46-000-CM
ネガティブアクションピンセット (2x)Fisher50-242-78
P20 pipetteRainin17014392
P200 pipetteRainin17008652 
パラフィルムフィッシャー13-374-12
ピペットチップレイニン30389291
クォンティフォイルグリッド、穴あきカーボン EMSQ2100CR1
スピンコーター セットCasKW-4Aチャック付 SCA-19-23
ストレートエッジULINEH-6560
温度計 グレインジャー3LRD1
UV/オゾンクリーナー BioForceSKU:PC440
真空デシケータートーマスサイエンティフィック1159X11
ワットマン
スーパーマーケットペーパーVWR28297-216

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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