マウス上顎矯正モデルの確立

サマリー

ここでは、マウスの上顎モデルで操作された管理可能な歯列矯正の歯の移動プロトコルを段階的に説明します。各ステップの明確な説明と視覚的なデモンストレーションにより、研究者はこのモデルを習得し、いくつかの変更を加えて実験ニーズに適用できます。

要約

マウスの上顎矯正モデルを確立するための再現性のあるプロトコルがないため、機械的負荷に関連する骨リモデリングを分析するための実行可能なツールを研究者に提供するために、信頼性が高く再現性のあるプロトコルを提示します。この調査では、さまざまな種類の概略図、操作写真、およびビデオに加えて、詳細なフローチャートを提示します。このプロトコールを成体ワイドタイプのC57/B6Jマウス11匹で実施し、術後3日目、8日目、14日目にサンプルを採取した。マイクロCTと病理組織学的データは、このプロトコルを使用した骨のリモデリングと相まって歯の動きの成功を証明しています。さらに、3日目、8日目、14日目のマイクロCTの結果から、骨モデリングを準備段階、骨吸収段階、骨形成段階の3段階に分けました。これらの段階は、さまざまな段階に関心のある研究者がサンプル収集時間を合理的に設定するのに役立つと期待されています。このプロトコルは、骨リモデリングの再生分析を実施するためのツールを研究者に提供することができます。

概要

骨は、個体の生涯を通じてそのサイズ、形状、および特性を適応させる、非常に活性な再建組織です^1,2。ホルモン、老化、栄養、その他の生物学的または生化学的要因³に加えて、機械的負荷が最も決定的な要因であるという考えは、一般的に受け入れられています^4,5。異常な機械的負荷を伴う状況下では、骨吸収と骨形成の不均衡が異常な骨リモデリングと骨障害につながる可能性があります。長期間の安静時や宇宙飛行時の微小重力下での廃用性骨粗鬆症や骨量減少などの骨疾患は、異常な^{機械的負荷と}密接な関係がある^6,7,8。

機械的負荷は、伸展治療や矯正治療などの骨関連疾患の治療にも使用されています。気晴らし治療は、頭蓋骨癒合症や下顎形成不全などの発達疾患で使用されてきましたが^9,10、矯正治療は、異常な歯の位置や不正咬合を矯正するために広く使用されています¹¹。矯正治療の核心は、機械的負荷の管理でもあります。骨組織が機械的負荷を受けると、骨吸収とそれに続く骨形成の結合によって高度に調整された骨リモデリングプロセスが誘発され、歯列矯正の目的を達成するために歯を動かすことができる^12,13。

矯正治療は臨床に広く応用されていますが、機械的負荷の生物学的影響に関する知識が限られているため、矯正治療の結果は制御できません。これらの限界を克服するために、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ブタなどのいくつかの動物モデルが確立され、機械的負荷による骨リモデリングの根本的なメカニズムが調査されています(表1)^{14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32}。犬、猿、豚などの大型動物は、矯正手術において小動物よりもいくつかの利点があり、より人間に近い歯と歯列を持っているため、外科的処置を人間で再現しやすいです。さらに、広い視野は、手術の困難さを軽減し、様々な歯列矯正スキームを適用することを可能にすることができる^33,34。しかし、大型動物は入手が難しく、サンプルサイズに課題があり、倫理的な制約を受ける³⁵。さらに、日常的な抽出手順と複雑な機器により、実験の実行が困難になり、大型動物が使用されることはめったにありません。

このような状況下では、主に歯列矯正モデルを確立するためにげっ歯類が使用されます。これらのモデルの中で、ラットとウサギはマウスと比較して操作の難易度が低く、歯の移動スキームが多くなっています。しかしながら、マウスモデルには、多数の遺伝子改変マウスが利用可能であるという独自の利点があり、これは、根底にあるメカニズムを調査するために特に重要である³⁶。ただし、マウスモデルはサイズが小さいため、操作が最も難しいモデルです。現在の方法を見直すと、第1大臼歯を近心方向に動かすことが、歯列矯正モデルの唯一の実用的な方法です。主に歯コイルスプリングとゴムバンドを動かすために2つの装置が使用されます。ゴムバンドを使うのは簡単ですが、歯列矯正の力が大きく変動するため、安定した結果を得ることが難しくなります。

Xu et ^al.15 は、下顎骨にコイルスプリングを備えたマウスモデルを確立しました。しかし、下顎骨の可動性と舌の閉塞性のために、上顎骨の手術は、術中および術後の両方の考慮事項において常に最初の選択肢です。Taddei et ^al.16 は、10年前にマウスの上顎骨に関するより詳細なプロトコルを記述しており、より視覚的で明瞭な詳細を追加する必要があります。要約すると、このプロトコルは、研究者が標準化された方法でモデリング方法を習得し、異なる研究間の比較評価を可能にするために、マウス上顎モデルにおける詳細な歯列矯正歯の移動プロトコルを体系的に記述しています。

プロトコル

この研究の動物手順は、四川大学西中国口腔病学院の倫理委員会(WCHSIRB-D-2017-041)によってレビューおよび承認されました。この研究では、成体C57BL/6マウスを使用しました( 資料表を参照)。このプロトコルは、骨吸収と骨形成のカップリングによって高度に調整された骨リモデリングプロセスが誘発される近心運動のために、右上顎第一大臼歯(M1)に機械的負荷を追加します(図1)。

1.術前の準備

1. 手術用品
   1. 手術用の手術用品は、手術用プラットフォーム(図2A)、ファスナー(図2B)、手術器具(図2C および 補足図S1)、歯列矯正用品(図2C)、歯科修復用品(図2D)です。
      注:カスタマイズされたコイルスプリングはカスタムメイドで、10mmまで伸ばすと10cNの力を発揮します。
2. 殺菌
   1. 手術器具はオートクレーブ滅菌し、すべての手術器具は紫外線を30分以上照射して滅菌します。
3. 麻酔
   1. 腹腔内注射によりケタミン(100 mg / kg)とジアゼパム(5 mg / kg)を投与してマウスを麻酔します。.
   2. 目の乾燥を避けるために、綿棒でネズミの目に獣医の軟膏を塗ります。
   3. 足の指を鉗子でつまんでもマウスが反応しない場合にのみ手術を進めてください。

2.外科的プロセス

1. 麻酔をかけたマウスの手足を仰臥位で広げ、粘着テープを使用して手術台にテープで固定します。
2. 頭の上の両側に27Gの針を固定し、腋窩の下の両側に別の27Gの針を固定します。
3. 上記の2本の針と上切歯に輪ゴムを巻き、別の2本の針と下切歯にもう1本の輪ゴムを巻き付けます。針の位置を変えて、口の開き具合と向きをコントロールします(図3A)。
   注意: 歯列矯正の歯の移動手術では、ブクニネーターが完全に締まる前に、口を最大限に開いたままにしてください。舌を非手術側に向かって引っ張って、術野を露出させ、虚血を防ぐ必要があります。
4. 3cmの304ステンレス鋼線の1.5mmの端を曲げ、湾曲した眼科用ピンセットでM1と上顎第2大臼歯(M2)の間の近接スペースに曲げた端を押し込みます(図3B)。結紮線の口蓋端が口蓋側から見えたら、長さの半分程度まで引き出し、特注コイルスプリングの一端に通します。
5. スプリングが歯にしっかりと固定されるまで、上顎M1の近心方向に結紮ワイヤーの両端で四角い結び目を作ります(図3C)。余分なワイヤーを差し引きます。
6. 同様に、2本目の3cm304ステンレス鋼線をコイルスプリングのもう一方の端に通します。
7. 切歯の表面を綿球できれいにして乾かします。これらすべての表面に綿棒で接着剤を塗布し、光硬化させます。
8. 2本目のステンレス鋼線を上顎切歯の間の近接スペースに押し込み、唇方向にスリップノットを結びます(図3D)。余分なワイヤーを差し引き、残りのワイヤーを歯の表面に近づけます。
9. 光硬化樹脂を注入して、結び目と切歯を覆います。樹脂を光硬化させます(図3E)。

3. 術後管理

1. 手術後、術後鎮痛のためにマウスに0.05 mg/kgのブプレノルフィンを腹腔内に注射する。
2. 麻酔をかけたマウスを37°Cのサーモスタット電気毛布の上に置きます。歩行で意識を取り戻したマウスは、別の飼育ケージに戻します。
3. 手術後の切歯の機能が制限されているため、通常の硬い飼料を柔らかい食事のみに置き換えてください。
4. 矯正器具は毎日チェックしてください。検査中に、バネの変形、バネの緩み、デバイスの脱落など、歯列矯正力の伝導に影響を与える状態が観察された場合は、マウスを実験から除外する必要があります。
5. 実験の比較可能性を維持するために、術後毎日マウスの体重を評価します。術前体重の30%を超える体重減少を示すマウスは、実験から除外する必要があります。

結果

成体雄マウス11匹(C57/BL6、生後3ヶ月)にOTM手術を行いました。彼らは、術後3日目、8日目、および14日目の結果のために安楽死させました。これらの実験では、右上顎側が操作側、左上顎側が対照側です。マイクロCTでは、術後3日目、8日目、14日目にそれぞれ30μm、70μm、110μmと、M1とM2の間の距離が時間的に連続的に増加していることが示されました(図4)。低密度の歯根膜は、機械的負荷の結果として、根の遠位側で広がり、近心側で狭くなりました(図5)。また、歯根膜は連続しており、どの歯根にも吸収は発生していませんでした。これらの結果は、このプロトコルでM1を物理的に移動させることが実現可能で安全であることを証明しています。

さらに、M1の根で囲まれた骨領域を 図6に示すパラメータで解析しました。8日目の手術側の骨量と骨塩密度の割合は、対照側と比較して有意な減少を示しました(

ディスカッション

本論文では、マウス上顎モデルにおける最も単純な歯列矯正の歯の移動プロトコルを段階的に記述し、機械的負荷による骨リモデリングの潜在的なメカニズムを研究しようとしました。骨リモデリングの研究とは別に、この方法の他のいくつかの主流のアプリケーションがあります:1)歯列矯正の歯の動きの加速に関する方法論的研究。2)歯列矯正学の歯根吸収に関する研究3)歯列矯正の歯の動きと痛みの生物学的メカニズム。4)トランスジェニックモデルに関する研究

下顎伸展骨形成³⁷などの他の機械的負荷関連治療と比較して、歯列矯正の歯の移動は、創傷や出血のない最も単純で穏やかな方法です。さらに、マウスモデルには、より少ない時間とコストで操作が簡単であるという利点があります³⁸。上顎モデルは、手術中に広い視野と安定した固定を提供し、手術後の舌からの器具への干渉を最小限に抑えることができる¹⁴。

ここで確立したモデルに基づいて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
実験モデル: Mouse Lines
C57/B6J	ジェムファーマテック実験動物会社	C57/B6J
<>Critical Commercial Assays
ヘマトキシリンおよびエオシン染色キット	バイオシャープ	BL700B
マッソン's トリクローム染色キット	Solarbio	G1340
Instruments
27 G 針	成都 Xinjin Shifeng 医療機器 &インスツルメンツ株式会社	SB1-074(IV)
接着剤	ミネソタ鉱業製造株式会社	41282
コルクボード	DELIグループ株式会社	8705
コットンボールHaishi	Hainuo Group Co.,  Ltd.
コットンスティック	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R
カスタマイズされたコイルスプリング	成都Mingxingスプリング株式会社	1109-02
鉗子	成都Shifeng株式会社	none
光硬化型流体樹脂	Shofu Dental Trading (SHANGHAI) Co., Ltd.
ライトキュ	ラーLiang Ya Dental Equipment Co., Ltd.	LY-A180
医療用粘着テープ	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd. (ハイシ・ハイヌオ・グループ・カンパニー)	0008-2014
医療用不織布	河南亜都工業株式会社
ニードルホルダー	成都Shifeng有限公司	none
輪ゴム	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	32X1
外科用ハサミ	Chengdu Shifeng Co.、Ltd.	なし
ピンセット	成都Shifeng株式会社	何一つ

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