肺感染症に対する微生物学迅速オンサイト評価

サマリー

ここでのプロトコルは、スライド作成、染色、解釈の3つのステップを含む、迅速で標準化された微生物学的迅速オンサイト評価(M-ROSE)ワークフローを示しています。このプロトコルは、医師が迅速な臨床的決定を下すのに役立ちます。

要約

経験的抗感染症療法の迅速な開始は、原因不明の肺感染症を呈する患者にとって非常に重要です。画像取得は臨床現場では比較的簡単ですが、特異性がないため、疾患の根底にある病因を正確に特定するために、喀痰培養、気管支肺胞洗浄液培養、遺伝子シーケンシングなどの追加の時間のかかる検査が必要になることがよくあります。さらに、経験的抗感染症治療の限定的な有効性は、抗生物質の誤用に寄与する可能性があります。ROSE(Rapid On-Site Evaluation)スライドでの微生物バックグラウンドの解釈における最近の進歩により、臨床医は気管支鏡検査(肺胞洗浄、粘膜ブラッシング、組織クランプなど)を通じて迅速にサンプルを採取できるようになり、ベッドサイドでの染色と重要な微生物バックグラウンド情報を提供する解釈が容易になりました。その結果、標的を絞った抗感染症治療と個別化された薬物療法計画を開発するための基盤が確立されます。どの病原体が感染症を引き起こしているかをリアルタイムで理解することで、医師は抗生物質耐性の原因となる不必要な広域抗生物質を回避できます。呼吸器内科や集中治療室内で迅速かつ標準化されたM-ROSEワークフローを確立することは、医師が患者に対する正確な治療戦略を策定するのに大いに役立ち、これは臨床的に大きな意味を持ちます。

概要

ROSE(Rapid On-Site Evaluation)の技術は、肺疾患の処置の分野で採用されている非常に効率的な方法です。リアルタイムのサンプリングと診断介入を可能にし、即時の細胞学的分析^{を容易にします1}。この革新的なアプローチでは、組織標本の一部をスライドに刻印しながら、その完全性を維持します。ROSEの主な利点の1つは、特殊な顕微鏡技術を通じて臨床情報の迅速な解釈を容易にする能力にあります。これには、細胞形態の解析、分類、定量、構成比の決定、配置の評価、相関分析、バックグラウンドの評価、異物の同定が含まれます。このすべてのデータと患者の臨床情報を統合することにより、ROSEはサンプリングの妥当性を評価し、リアルタイムの介入手順と技術を導く上で極めて重要な役割を果たします²。

ROSEテクノロジーの子会社として、M-ROSEテクノロジーは、良性細胞と悪性細胞を区別するのではなく、主に標的病変の微生物学的背景を取得することに焦点を当てています^3,4。一方では、M-ROSEは、アスペルギルス属、クリプトコッカス、ニューモシスチス、カンジダ⁵などの病原体の顕微鏡的同定を可能にします。一方、呼吸器検体の品質の評価、感染性疾患と非感染性疾患の区別、感染と汚染の区別、感染の重症度と予後の評価において、重要な指針となる意味を持っています^6,7。たとえば、呼吸器標本内では、浸潤する炎症細胞と同一の形態を示す細菌が共存していることは、感染を示しています。逆に、上皮細胞を伴う複数の形態学的に多様な細菌の存在は、汚染を示唆しています。臨床情報を包括的に分析し、転帰を予測する能力により、M-ROSEは肺疾患の処置において非常に貴重なツールとなっています。

結論として、ROSEは、肺疾患の診断の効率と精度を大幅に向上させる重要な細胞学的キャリアとして機能します。その多面的な機能は、タイムリーな介入を確保し、リアルタイムのサンプリングと診断介入技術を通じて正確な診断を促進することにより、患者の転帰の改善に貢献します。ただし、これらの進歩は適格なサンプルの入手に依存していることに注意することが重要です。ここでは、スライド調製、染色技術、および解釈ガイドラインを網羅する標準化されたM-ROSEプロトコルを紹介します。このプロトコルは、臨床医が正確な評価と治療計画を確立するための貴重な参考資料として機能し、その後の標的検体の取り扱いに関する意思決定を容易にします。

プロトコル

この臨床試験は、重慶中医薬病院の承認委員会(No.2022-ky-31)によって承認されました。典型的なケースは、ニューモシスチス肺炎と診断された患者を含み、患者からインフォームドコンセントが得られました。

1. ROSEの機器と材料の要件

1. 機器: このプロトコルで使用される機器については、 材料の表 を参照してください file.
   注:専用の細胞顕微鏡とグラフィックイメージングシステムの利用が不可欠です(図1A)。
2. 材料の準備( 材料の表を参照)。
   1. 滅菌細胞培養スライド(細胞接着力が強い)、吸収紙、パウダーフリーのラテックス手袋、使い捨ての2.5-5 mLシリンジ針を調製し、取り扱いが簡単なように蓋が密封されたガラス染色ジャーにDiff Quik(DQ)染色溶液一式を入れます(図1)。

2. M-ROSEのワークフロー

1. 細胞学的スライドの調製
   注:スライドを準備する方法はたくさんありますが、以下は一般的に使用されるいくつかの準備方法です。
   1. ロールスライド
      注:このプロセス中に組織サンプルの損失を最小限に抑えるようにしてください。
      1. 容量が2.5〜5mLの使い捨てシリンジ針を使用して組織粒子を抽出します(図2A)。
      2. 直径約1cm、適度な厚さの円形の領域を、滅菌細胞診スライド上の染色された端(強い細胞付着を示す端)の内側から外側の3分の1セクションに広げます。
   2. ブラシスライド
      注:この方法は、従来の細胞ブラシ、汚染防止細胞ブラシ、または超微細細胞ブラシを使用して得られた標本、および喀痰や粘性のある体液などの半液体試料に適用できます。
      1. ブラシヘッドを伸ばし、滅菌細胞学的ガラススライド(スライドは強い細胞接着特性を有する)の遠位3分の1に適用して、適度な厚さで約2cm×1cmの長方形の領域を得る。
   3. スプレースライド
      1. 穿刺針を滅菌細胞診スライドの染色端の3分の1に配置し、細胞接着を強固にします。
      2. ピアス針の先端に空気圧をかけて内側から外側に差し込むと、直径約1cmの中厚の円形のエリアが形成されます。
2. 細胞学的スライド染色
   注:世界保健機関(WHO)は、Diffの色素⁵を使用したROSE細胞学的スライドの迅速な染色を推奨しています。Diff 染料は再利用できますが、何度も繰り返すことはできません。沈殿物がある場合は、使用後にろ過する必要があります。深すぎる染色は、メタノールまたはアルコールによって適切に脱色することができ、できれば染色しなくなります。染色が深すぎたり浅すぎたりする場合は、染色時間または作動液濃度を調整する必要があります。pH値は染色に一定の影響を及ぼし、スライドは清潔で酸やアルカリの汚染がない必要があります。Diff A溶液とDiff B溶液はどちらも揮発性であるため、使用後は密封して保管する必要があります。
   1. スライドをDiff A溶液に10〜30秒間浸漬し(図2B)、PBS色素浴ですすいで余分なDiff A溶液を取り除き、残っているバッファーを静かに振り落とします(図2C)。
   2. 次に、スライドをDiff B溶液に20〜40秒間浸漬します(図2E)。
   3. 最後に、水染色タンク(図2F)でスライドを清掃し、スライドの残留液を吸収紙(図2D)で吸光紙で拭き取り、染色を終了します。
      注:M-ROSEは、病原性微生物の直接可視化が可能で、呼吸器検体の品質評価を容易にするため、感染と非感染、感染と汚染の区別が可能となり、感染の重症度や予後評価の指針となります。ディスカッションセクションでは、実験手順を伴わないため、この側面について説明します。

結果

典型的なケースでは、63歳の男性が咳、発熱、胸の痛みを訴えて病院を受診しました。患者は以前にタンパク尿と浮腫を特徴とするネフローゼ症候群と診断され、プレドニゾンとタクロリムスによる治療を長期間受けていました。最初の検査所見では、白血球数が10.49 x 10⁹ / L、好中球数が8.87 x 10⁹ / L、全血C反応性タンパク質および(1-3)-β-D-グルカン濃度が155.81 mg / Lおよび249.7 pg / mLであることが示されました。胸部コンピューター断層撮影(CT)スキャンでは、びまん性、両側性、および中心的な位置ですりガラス状の混濁が示されました(図3A)。セフォペラゾンタゾバクタムによる最初の抗感染治療は効果がなく、彼の症状は心臓の疲労、息切れ、運動後の呼吸困難によって悪化しました。CT画像を重ねても有意な改善は見られませんでした(図3B)。その後、患者は人工呼吸器のために集中治療室(ICU)に移され、気管支鏡検査を受けました。フォーカスサンプリングは、仮想ナビゲーションのガイダンスの下でアクセスされ、3つの鉗子生検サンプルが収集されました(図4)。ROSEは組織の即時顕微鏡評価に利用可能であり、ニューモシスチス・ジロベシの診断が確認されました(図5A)。患者は直ちにスルファメトキサゾール(1.92g、q6h)による抗真菌治療を受けた。その後の染色(図5B-E)により、この診断が確認されました。しかし、CT画像を再度撮っても有意な改善は見られませんでした(図3C)。患者は、真菌感染症のためにカルボファンギン(70 mgの初日、その後毎日50 mg)、メチルプレドニゾロン(毎日80 mg)、および免疫グロブリン(毎日10 g)を投与されました。.症状はすぐに緩和され、患者はフォローアップ治療を続けました。

図1:機器と材料 (A)細胞顕微鏡とグラフィックイメージングシステム。(B)Diff Quik(DQ)染色液 A. (C)Diff Quik(DQ)染色液 B. (D)パウダーフリーのラテックス手袋。(E)無菌細胞培養スライド。(F)使い捨ての2.5〜5mLシリンジ針。(G)吸収紙。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:M-ROSEのワークフロー (A)スライドの印刷(B)スライドをDiff A溶液に10〜30秒間浸します。(C)スライドをPBS染料浴ですすぎ、余分なDiff A溶液を取り除きます。(D)スライドに残った液体を吸水紙で拭き取ります。(E)スライドをDiff B溶液に20〜40秒間浸します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:胸部CT画像 (A)入院時。(B) ICUへの移管当日(C)スルファメトキサゾールの治療後 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。.

図4:VBNによる右肺下葉の後基底部の局在化。(B)右中気管支。(C)右肺の下葉の気管支の後基底部。(D)VBNの3Dマップ。(E) 胸部CTの冠状図 (F) 胸部CTの軸線図 (G) 胸部CTの矢状図 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5:さまざまな染色法におけるニューモシスチスの外観を記録した写真。 (A) ROSE 100 x 10;白い矢印:子嚢胞子を含む嚢胞。(B)ヘマトキシリンとエオシン(H-E)、60 x 10。(C)アルシアンブルー、60 x 10。(D)ギエムザ、40 x 10。(E)ヘキサミンシルバー、20 x 10。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

インターベンショナル呼吸器学は、現代の呼吸器疾患の貴重な分野です。特に、肺疾患の診断に広く使用されています^8,9。近年、肺悪性腫瘍の有病率の増加、下気道での薬剤耐性病原体感染の増加、不可解で重篤な呼吸器疾患の診断の要求の要求により、診断的インターベンション呼吸器学が盛んになっています10,11,12.インターベンション診断の効率は、病巣領域のサイズと解剖学的位置、合併症率と生検部位の数、基礎疾患などの要因に依存し、多くの高度な技術と施設の臨床使用を促進します¹³。ROSEは注目を浴び、インターベンショナル呼吸器科の診断のための「リアルタイム付随技術」として急速に登場しました。

ROSEは、穿刺、生検、ブラッシングなどの処置中の検体満足度の迅速な評価、予備診断、および優先順位付けのために設計されています。これは、その後の技術進歩^14,15,16,17を導くためのフィードバックを提供します。ROSEの一部門であるM-ROSEは、組織細胞の悪性腫瘍を評価するのではなく、主に微生物の背景を評価することに焦点を当てています⁵。M-ROSE法は、診断ツールではなく迅速な評価技術であるため、その診断効果を誇張してはなりません。その臨床応用は、主に次の側面を包含する:特定の病原性微生物の視覚的識別、感染と汚染の区別、および感染と非感染の区別⁷。

急速染色後、組織の細胞核は紫がかった赤色の色合いを示し、細胞質は青紫色を示しました。細菌と真菌は青色に見え、その結果、組織細胞と病原体との間に明確なコントラストが生じました⁷。M-ROSEは、細菌や真菌の同定において一定の能力を示すことができる。具体的には、アスペルギルス属、クリプトコッカス、ニューモシスチス・ジロベシ、およびその他の真菌に対して高い陽性率を示します^3,18。ただし、体積と直径が小さい病原体や細胞内病原体を認識することに関しては、制限があります。病気の診断は、病原性微生物の顕微鏡的同定だけに頼るのではなく、患者の基本状態、臨床症状、画像検査、およびその他の要因を含む包括的な評価に基づいていることを強調することが重要です。

また、M-ROSEは、肺胞洗浄液サンプルの品質評価など、感染や汚染の特定にもメリットがあります。条件が許す限り、ベッドサイドで遠心分離と染色による洗浄液の評価を行うことができます。肺胞洗浄液の適格なサンプルは、低倍率顕微鏡下での全細胞(赤血球を除く)に占める扁平上皮細胞の割合が1%未満、円柱上皮細胞が5%未満、赤血球が10%未満であることを示しています(外傷または出血に関連する要因を除く)¹⁹。細胞診の背景を顕微鏡で調べることで、タイムリーな評価を行うことができます。

さらに、M-ROSEは感染した病変と非感染した病変を区別するのに役立ちます⁵。感染した病変では、炎症細胞による好中球、マクロファージ、リンパ球の浸潤がよく見られ、好中球の食作用が時折観察されます。逆に、非感染病変は通常、炎症性細胞浸潤を欠いています。

ここで紹介するプロトコルは、M-ROSEの動作プロセスを示しています。微生物学的背景の解釈を通じて、予備診断を下したり、鑑別診断を絞り込んだりすることができます。私たちの調査結果が示唆するように、PCPの診断にはニューモシスチス・ジロベシの確認された証拠が必要であり、症状のある高リスク患者であっても、臨床症状や画像診断に基づくべきではありません。子嚢および栄養形態の顕微鏡的同定は、最も直感的な証拠です。診断効率は、主に試料の染色方法によって決まります。歴史的に、Wright's-Giemsa、ヘキサアミン銀、トルイジンブルーなどの従来の染色剤はPCPに使用できますが、時間がかかり、感度が低くなります。この場合、PCPの即時診断は、ROSEを使用して患者がICUに移送された初日に確認されました。Diff-quickは、明確な構造、シャープなコントラスト、およびアスカスの容易な同定を特徴とするニューモシスチスの同定においてその利点を示しています(図5A)。

民族医学の応用においても、ROSEは大きな価値を持っています。例えば、化膿性疾患では、臨床医は、微^{生物学的背景5}内で主に好中球が優勢な多様な炎症細胞を特定することができる。その結果、スイカズラ、タンポポ、パトリアなど、これらの症状の潜在的な治療法として、熱除去および解毒特性を持つ薬物を選択できます。

ROSEはインターベンショナル呼吸器科で選択する必要のない追加プログラムであるため、ROSEを実施すると人件費と経済費が増加することになります。ROSEを定期的に使用すべきかどうかは議論の余地があります。経済性の面では、時間と人件費が懸念されています。主な追加の労働力ニーズは評価者です。ROSEの評価は、細胞検査技師、病理医、または臨床医が行うことができます。細胞検査士は、ROSE手術の最も可能性の高い人員です。ただし、臨床診療では、臨床医が役割を置き換えますが、一定のトレーニング基準^{が必要になる場合があります15}。以前の研究では、トレーニングプログラムが臨床医によって実行される妥当性評価の精度を向上させ、交絡変数を排除するのに役立つ可能性があることが示されました²⁰。また、M-ROSEは形態学的診断技術として、結果報告に主観的な要素があります。臨床医は、追加の臨床情報に基づいて包括的な評価を行う必要があります。

適切な設備と訓練を受けた専門家がいる病院は、困難な呼吸器系重篤な疾患の早期評価を容易にし、臨床治療を効果的に導くことができるため、呼吸器科またはICUでROSE手順の実施を検討することをお勧めします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞顕微鏡	オリンパス株式会社	CX43
Diff Quik(DQ) 染色液	Besso Biotechnology Co. Ltd	G1541
使い捨て2.5-5mLシリンジ針	山東省朱製薬集団	20183150304
パウダーフリーラテックス手袋	河南亜都工業株式会社	20182140728
無菌細胞文化スライド済	南Preret産業貿易有限公司	7101