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方法論記事

磁気アルキメデス戦略を用いた細胞パターニング

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DOI:

10.3791/66063

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2024年2月2日

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology of The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2State Key Laboratory of Transvascular Implantation Devices, 3Cardiovascular Key Laboratory of Zhejiang Province

この記事について

サマリー

このプロトコルは磁気Archimedesの効果に基づいて方法に区分するインクなし、ラベルなし、基質独立者、高スループットのセルを記述する。

要約

細胞パターニングは、細胞の位置を正確に制御することができ、細胞の挙動を研究する上で独自の利点をもたらします。このプロトコルでは、磁気Archimedes (Magアーチ)の効果に基づいて細胞のパターニングの作戦はもたらされる。このアプローチにより、インク材料や標識粒子を使用せずに細胞分布を正確に制御できます。常磁性試薬を導入して細胞培養培地の磁化率を高めることにより、細胞は磁石によって反発され、マイクロ流体基板の下に配置された磁石セットと相補的なパターンに配列されます。

本稿では、Mag-Archベースの戦略を用いた細胞パターニングの詳細な手順を説明します。単一細胞タイプおよび共培養実験用の複数細胞タイプをパターニングする方法が提供されています。さらに、細胞パターニング用のチャネルを含むマイクロ流体デバイスを作製するための包括的な手順も提供します。並列メソッドを使用してこの機能を実現することは困難ですが、簡素化された費用対効果の高い方法で実行できます。Mag-Archベースの細胞パターニングを採用することで、研究者は in vitro 研究のための強力なツールを手に入れることができます。

概要

細胞パターニングは、 in vitro 研究のための直感的で強力な技術へと進化しています1。培養プレート内の細胞位置を操作することで、細胞遊走2、生体模倣的多細胞共培養3、オルガノイドアセンブリ4、生体材料研究5など、さまざまな実験のためのソリューションを提供します。ほとんどの場合、インクフリー、ラベルフリーの方法は、操作が簡単で、その後の調査のための細胞生存率が高いため、細胞パターニングに好まれます。

マグアーチ効果は、常磁性液体中の反磁性体が弱い磁場の領域に向かって移動する傾向がある物理現象である6。生細胞は自然に反磁性であるが、細胞培養培地は、造影剤として核磁気共鳴画像法で一般的に静脈内投与されるガドペンテテートジメグルミン(Gd-DTPA)などの可溶性常磁性元素を添加することにより、常磁性にすることができる7。その結果、細胞は周囲の常磁性媒質に反発され、磁場の弱い領域に移動することが予想される8。パターン化された磁場は、ネオジム磁石のセットを使用して簡単に生成できます。理想的には、セルパターンは磁石パターンと反対に組み立てられます。技術的には、唯一の追加試薬であるGd-DTPAが細胞外環境に残り、細胞に結合しないため、これはラベルフリー法として定義されています。したがって、その後の細胞培養への潜在的な影響は、培地を交換することによって容易に回避することができる。他の方法1,3,9,10と比較して、Mag-Archベースの戦略は、細胞を肯定的に標識するためにバイオインク成分や特定の粒子の塗布を必要としません。さらに、細胞接着のために複数の基質上で作用することが示されており、ハイスループットな細胞パターニングが可能である4。

本稿では、Mag-Archベースの手法を用いたセルパターニングの詳細なプロトコールについて、デバイスの作製からセルパターンの調整までを網羅しています。今回実証したパターン以外にも、磁石やGd-DTPA溶液を用いて様々なセルパターンを簡単に作成することができます。さらに、複雑な共培養パターンを組み立て、密閉されたマイクロ流体チップ内の細胞を操作するためのプロトコルも提供されます。

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プロトコル

1. マグネットセットの組み立て

  1. ストリップパターン用のマグネットセットを組み立てます。
    1. 図1Aに示すように、平らな長方形の磁石を選択します。今回使用した長方形磁石の寸法は、1.5mm×10mm×35mm(厚さ×高さ×長さ)です(材料表参照)。磁石の厚さによって、セルストライプ間のギャップが決まります。
    2. 厚さ2mmのシリコンプレート( 材料表を参照)を2mm×8mm×30mmの長方形にカットします。これらのシリコンプレートの後者の2つの寸法が、上記の長方形の磁石の寸法よりもわずかに小さいことを確認して、アセンブリを最適化します。シリコンプレートの厚さによって、セルストライプの幅が決まります。
    3. 図1Aに示すように、長方形の磁石とシリコンプレートを層ごとに組み立てます。各マグネットセットは、4つのマグネットと3つのシリコンプレートで構成されています。固有の引力によって磁石セットが自動的に揃うように、隣接する各磁石の極が反対であることを確認してください。
    4. 使用前に磁石を滅菌してください。
      注意: マグネットセットを純水で洗浄してから、75%エタノールに10分間浸すことをお勧めします。これらのマグネットセットの全体寸法は、12 mm × 10 mm × 35 mm で、標準的な 6 ウェル細胞培養プレートに適合するように設計されています。
  2. ドットアレイパターン用のマグネットセットを組み立てる
    1. 図1Bに示すように、小型の円筒形磁石を選択します。本実証に用いた円筒形磁石の寸法は、Φ1.5mm×10mm(直径×高さ)で、軸方向に磁化されています。
    2. 図1Bに示すように円筒形の磁石を組み立てます。各磁石セットが、6×6グリッドに配置された36個の円筒形磁石で構成されていることを確認します。また、固有の引力により磁石セットが自動的に整列できるように、隣接する各磁石の極が反対であることを確認してください。
    3. 使用前に、手順1.1.4と同じ手順に従って磁石を滅菌してください。これらのマグネットセットの全体寸法は、9 mm × 10 mm × 9 mm で、標準的な 6 ウェル細胞培養プレートに適合するように設計されています。

2. スライドガラス上での細胞パターニング

  1. 細胞培養装置を準備します。
    1. 厚さ2mmのシリコンプレートを使用して、シリコンモールドを作成します。パンチャーを使用して、プレートに1cm×1cmの長方形の穴を開けます。 図25Cに示すように、穴の周りのシリコンプレートをトリミングして、穴を中央に持つ丸い型(直径= 1 mm)を作成します。
    2. 超音波洗浄機を使用してシリコンモールドを完全に洗浄します。金型を純水で10分間洗浄し、さらに10分間水を75%エタノールに置き換えて滅菌します。最後に、金型を滅菌ボックスに入れて65°Cで60分間乾燥させます。
    3. 図1Cに示すように、滅菌したシリコン型をΦ25mmの丸いガラスセルスライドに取り付け、シリコンがガラスに付着するようにそっと押します。得られた細胞培養デバイスは、ガラスの下面と200μLの培養キャビティを有することになる。デバイスの寸法はΦ25mm×2.15mmで、標準的な6ウェル細胞培養プレートに適しています。
      注:上記の細胞培養デバイスは、共焦点ディッシュなど、下面が0.5mmより薄い他のシャーレと交換できます。
    4. マグネットセットを6ウェルプレートに置きます。操作のしやすさから非磁性ピンセットをお勧めします。
      注:以降のすべてのステップは、この時点から細胞パターンの観察まで無菌条件下で実行する必要があります。
    5. 細胞培養装置を、6ウェルプレートのウェルにセットされた磁石の上に置きます。細胞培養装置が水平に配置され、下側がマグネットセットに密着していることを確認してください。
  2. Gd-DTPAを含む細胞培養培地を調製します
    1. 市販のGd-DTPA注入液( 材料表を参照)を、通常500 mMの濃度で調製します。30 μL の Gd-DTPA 注入液を 470 μL の完全細胞培養培地に添加して注入を希釈し、目標濃度を 30 mM にします。
      注:地域の規制と入手可能性に応じて、同じ目標濃度の他のガドリニウムベースの造影剤(GBCA)でも同様の結果が得られる可能性があります11。
  3. セルパターンを作成します。
    1. パターニング用の細胞を採取します。このデモンストレーションでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC、 材料表を参照)をパターニングに使用しました(図2)。細胞を200 x g (室温)で5分間遠心分離して懸濁液から回収し、Gd-DTPA含有培地に再懸濁します。細胞密度を数えます。
    2. 細胞密度を約2~2~105細胞/ mLに調整し×Gd-DTPA含有培地で使用します。細胞懸濁液を静かに混合し、各細胞培養型のキャビティに200μLを加えて、つばのある完全な液面を作成します。
    3. プレートを細胞培養インキュベーターに慎重に移し、細胞が基質によく付着するまで3〜6時間インキュベートします。細胞パターンの組み立てに干渉しないように、インキュベーターのドアをバタンと閉めないでください。接着率の低い細胞の場合、GBCAによる一晩の処理は一般的に安全です12。
    4. 細胞パターニングは、細胞が細胞培養装置のキャビティの底部に付着した時点で完了したとみなされます。Gd-DTPA含有培地を完全培養培地と交換します。
    5. マグネットセットから細胞培養装置を取り出します。細胞パターンをすぐに観察するか、デバイスを新しい培養プレートに移してさらに培養することができます。

3. 磁石横向きの共培養パターニング:可動テンプレートの作製

注:以下の手順は、Mag-Archベースのセルパターニングを活用し、より多くのアプリケーションの可能性を探るために提示されています。

  1. ステップ1とステップ2に従って、ストライプセルパターニング用のデバイスを準備します。ただし、細胞密度を1 × 105 cells/mLに減らし、磁石を分離するシリコンプレートをより薄いものに交換して、各ストライプセルパターンを薄くします。
    メモ: これにより、複数のセルをストライプパターンで配置するのに十分な領域が確保されます。参考までに、磁石の分離には2mmではなく1mmのシリコンプレートを使用することをお勧めします。
  2. 手順2.2-2.3に示すように、最初のタイプのセルをパターン化します。このステップでは、細胞の接着にも3〜6時間かかります。
    注:共培養システム内の異なる細胞タイプを区別するために、ユーザーはパターニングの前にDiI、DiDなどの蛍光色素、またはセルトラッカー(CMTPX、CMFDA、CMACなど)で細胞を標識することができます。例えば、DiIおよびDiD染色の場合、FBSフリー培地1 mLに対して1 μLの原液(10 mM)( 材料表を参照)を添加し、よく混合してワーキング溶液を得ます。培養液を作業溶液と交換して、接着細胞を覆います。30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄した後、細胞回収に進みます。
  3. 最初のタイプの細胞をパターニングした後、 図3Aiiに示すように、細胞培養デバイスを下の磁石から右に1mm移動させます。
  4. スライドガラスを200μLのPBSで2回静かに洗浄します。スライドを乾かさないでください。
  5. 手順2.2-2.3で示したのと同じ方法で、2番目のタイプのセルをパターン化します。
  6. 図3Aiiiに示すように、細胞培養装置を下の磁石から1mm右に移動し、再度200μLのPBSでスライドガラスを洗浄します。手順2.2-2.3で示したのと同じ方法で、3番目のタイプのセルをパターン化します。
  7. すべての種類の細胞をパターニングした後、200 μLのPBSでスライドガラスを2回穏やかに洗浄し、完全な細胞培養培地と交換します。
  8. マグネットセットから細胞培養装置を取り出します。その後、細胞パターンを観察したり、デバイスを新しい培養プレートに移してさらに培養したりできます。

4. Gd-DTPA濃度調整による共培養パターニング

注:GBCAは、使用濃度(≤75 mM)での細胞接着またはその後の増殖に大きな影響を与えません。さらに、細胞パターンはGd-DTPAの濃度の影響を受け、濃度が高いほど細胞パターンが小さくなったり薄くなったりします。このように、Gd-DTPAの濃度を調整するだけで共培養系を作ることができる。この例では、同心円状配列のパターニングを示します。

  1. ステップ2.2-2.3に示すように、ステップ1.2のミニチュア円筒形磁石を使用して、最初のタイプのセルをパターン化します。細胞を回収する前に、DiI、DiD、またはセルトラッカー(ステップ3を参照)などの蛍光色素で細胞を標識し、共培養システム内のさまざまな細胞タイプを区別します。
    注:高濃度のGd-DTPA(30 mMではなく50 mM)とより低い細胞密度(約1×〜105 cells/mL)が必要です。
  2. 最初のセルアレイをパターニングした後、200 μLのPBSでスライドガラスを2回静かに洗浄します。スライドを乾燥させないでください。
  3. 前と同じ手順に従って、2 番目のタイプのセルをパターン化します。転位を防ぐために、スライドガラスを磁石上で比較的動かないようにしてください。スライドガラスの下面には、マグネットセットをはめ込むための中空のあるシリコンプレートを取り付けることをお勧めします。
    注: ここでは、図 3B に示すように、2 番目のセルパターンが 1 番目のセルパターンよりも大きくなることが予想されるように、Gd-DTPA の濃度を低くする必要があります(30 mM ではなく 20 mM)。
  4. すべてのタイプの細胞をパターニングした後、200 μLのPBSでスライドガラスを2回穏やかに洗浄し、培地を完全な細胞培養培地と交換します。
  5. マグネットセットから細胞培養装置を取り出します。その後、細胞パターンを観察したり、デバイスを新しい培養プレートに移してさらに培養したりできます。

5. マイクロ流体チップにおける細胞パターニング

注:Mag-Archベースの方法は、以前の研究8で密閉された狭いチャンバーで機能することが実証されています。これは、マイクロ流体チャネルにおけるドットアレイのパターニングの例です。

  1. マイクロ流体チップの作製
    1. 図4Aに示すように、24 mm×50 mm × 8 mmの長方形のキャビティを含む40 mm×75 mm×20 mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)金型(材料表を参照)をカスタマイズします。
    2. 厚さ0.5mmのシリコンプレートを平らにします。図4A、Bに示すように、15 mm×20 mm×0.5 mmの長方形の空洞を持ち、入口側と出口側の両方に三角形の緩衝領域がある流体チャネルの形状に従ってシリコンプレートを切断します。
    3. 40mm×75mmの長方形のガラス板をカスタマイズします。ガラス板をエアプラズマで30秒間洗浄します。
    4. エアプラズマ洗浄後すぐに、ガラス板を市販の付着防止緩衝液0.5mL( 材料表参照)で覆い、風乾させます。ガラス板を一度エタノールで洗い、自然乾燥させます。
    5. 図5.1.2で準備したシリコンプレートをガラス板の真ん中にしっかりと取り付けます( 図4A)。
    6. 製造元の指示に従ってポリジメチルシロキサン(PDMS)プレポリマーを調製します( 材料表を参照)。各PDMSチップについて、10 gの塩基成分と1 gの硬化剤を50 mLの遠心チューブに秤量します。
    7. 小さな気泡がコロイド中に均一に分布するまで、ガラス攪拌棒で薬剤を完全に混合します。混合には、コロイドの量にもよりますが、5〜10分かかります。コロイドプレポリマーを500 x g (室温)で1分間遠心分離し、気泡を除去します。
    8. ~10 mLのプレポリマーをキャビティにゆっくりと流し込み、PTFEモールドに充填します。
    9. 金型を真空リザーバーに慎重に配置し、プレポリマーが流れ出ないように水平に保ちます。
    10. 真空ポンプでプレポリマーに残留気泡を除去します。掃除機には120〜180分かかります。
    11. 必要に応じて、さらにプレポリマーを流し込んで、金型キャビティをさらに充填します。さらに60分間掃除機をかけます。
    12. 図4Biに示すように、シリカ側をキャビティに向け、PTFEモールドをガラス板で慎重に覆います。
    13. すべての気泡が排除されていることを確認します。金型を60°Cの乾燥オーブンに移し、プレポリマーを一晩固化させます。
    14. オーブンから型を取り出します。冷却後、固化したPDMSカバーを慎重に離型します。Φ1mmのニードルパンチャーで入口と出口を作成します。
    15. 手順2.1.2に従って、PDMSカバーと24mm×50mmのカバースライドを洗浄します。
      注意: 滅菌状態で次の手順に進みます。
    16. PDMSカバーとカバースライドを取り付けて、高さ約~500μmの流路を含むマイクロ流体チップを作成します。底面は~0.15 mmのガラスカバースライドで構成し、Mag-Archベースの戦略で細胞のパターニングを可能にする必要があります。
  2. 市販の滅菌アダプタをマイクロ流体チップ8の入口と出口の両方に組み立てる。
  3. 2%(w/v、PBSに溶解)のゼラチンコーティング緩衝液を調製します。オートクレーブ滅菌により緩衝液を滅菌します。
  4. ゼラチンコーティングバッファーを、1 mLシリンジを使用してインレットアダプター を介して チップに注入します。気泡が発生した場合は、追加のコーティングバッファーで洗い流してください。
  5. チップを10cmの細胞培養皿に入れます。乾燥を防ぐために、皿の底の周りに1 mLのPBSを加えます。皿を細胞培養インキュベーターに移します。コーティングには30分かかります。
  6. 2 mLのGd含有培地(30 mM)でコーティングバッファーをインレット から 洗い流します。
  7. 30 mM Gd-DTPAを含む細胞懸濁液1 mLを1 mLシリンジで静かに注入します。
  8. ステップ2.2-2.3で示したように、ステップ1.2のミニチュア円筒形磁石を使用してセルをパターン化します。
    注:ただし、 図4Ciに示すように、マグネットセットをスライドガラスの下面に取り付ける中空のあるシリコンプレートを取り付けることをお勧めします。
  9. パターニング後、Gd-DTPA含有培地を1 mLの完全培地で1 mLのシリンジで洗い流し、穏やかにリフレッシュします。
    注:マイクロ流体工学におけるセルパターニングのプロセスは、ステップ5.7〜5.9で約180分かかり、これは標準的なスライドガラスのセルパターニングと同様です。
  10. 顕微鏡でパターンを定量化します。必要に応じて、マイクロ流体チップを循環培養装置に接続して、さらに培養します。
    注:我々の経験では、細胞は、細胞インキュベーター8内の新鮮な培地の連続的な流れをマイクロ流体工学に提供する単純なマイクロポンプベースのデバイスによって支持された場合、少なくとも72時間増殖することができる。

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結果

矩形(1.5mm×10mm×35mm)と円筒形(Φ1.5m×10mm)の磁石を選定し、セルパターンをデモンストレーションとして作成しました。ユーザーは、磁石のサイズや形状を変更したり、さまざまなセルパターンを作成したりできる柔軟性があります。図1A、Bでは、磁石を組み立て、磁極を青(南)と赤(北)で明確に示しています。この構成では、図2に示すように、磁石は互いに横方向に引き合い、整列します。図1C、Dは、細胞培養装置の構造および細胞パターニング手順を示す。

図2は、モノタイプのセルパターンを示しています。GFP標識HUVECを蛍光顕微鏡での観察に利用しました。セルは、対応する磁石セットを使用してストライプおよびドットアレイパターンに編成されました。スライドガラスに急速に接着するH...

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ディスカッション

Mag-Archベースのセルパターニングは、ほとんどの生物医学ラボにユーザーフレンドリーなソリューションを提供します。この方法は、インクフリー、ラベルフリー、基板非依存、およびハイスループットパターニングの能力8,13の特性と並行して進歩します。モノタイプのセルパターニングでは、ワンステップでセルをパターニングします。この手順は、培地をリフレッシュするだけで終了します。

これまでの研究では、磁性粒子を使用して細胞を標識し、磁石で引き付けて正確なパターンを形成していました14,15。しかし、細胞上に磁性粒子が存在することで、細胞の挙動に及ぼす潜在的な影響が懸念されました。Mag-Archベースの細胞パターニングは、細胞外液体を細胞ではなく常磁性に変えるという逆の戦略を取ります。この戦略により、培地をリフレッシュすることで、余分な常磁性試薬の除去がはるか...

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開示事項

著者は競合する金銭的利害関係を持っていません。

謝辞

本研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2021YFA1101100)、中国国家自然科学基金会(32000971)、中央大学基礎研究費(No.2021FZZX001-42)、浙江大学上海高等研究院星月夜科学基金(助成金番号.SN-ZJU-SIAS-004)です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
A2780 卵巣がん細胞ProcellCL-0013
細胞培養培地 (DMEM、高グルコース)Gibco11995040
カバースライドCitotest Scientific80340-3610マイクロ流体工学の作製用。寸法:24 mm×50 mm
DiDMedChemExpress (MCE) HY-D1028赤色蛍光(例:640 nm)による細胞の標識用DiI
MedChemExpress (MCE) HY-D0083 オレンジ色蛍光(例:550 nm)による細胞の標識に
ウシ胎児血清(FBS)バイオチャネルBC-SE-FBS07
ドペンテテートジメグルミン(GD-DTPA)北京北瑜製薬 
H10860002 ゼラチンシグマ アルドリッチV900863
ガラスセルスライドシトテスト・サイエンティフィック80346-2510直径:25 mm; 厚さ:0.19-0.22 mm
ガラスプレートPURESHI金物店マイクロ流体工学の製作に。寸法:40 mm×75 mm
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)ServicebioSTCC12103G-1
ネオジム-鉄-ホウ素磁石 (N52)Lalaci
無毒ガラス板コーティング (ゲルスリック溶液)ロンザ1049286マイクロ流体を製造する際の離型便宜のために
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)ServicebioG4200
プラズマクリーナーSANHOPTTPT-2S
ポリジメチルシロキサン(PDMS)キットDOWSILSYLGARD 184 シリコーンエラストマーキットマイクロ流体の製造用
ポリテトラフルオロエチレン(PFTE)金型PURESHI金物店カスタマイズ、マイクロ流体工学の製造用
シリコンプレートPURESHI金物店
平滑筋セル(SMC)プロセルCL-0517
超音波洗浄機サピーンCSA-02
ガ オンラインで

参考文献

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