Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

サマリー

エピジェネティックな分野に不慣れな研究者は、CUT&TagがChIPアッセイの非常に簡単な代替手段であることに気づくでしょう。CUT&Tagは、希少細胞集団と初代細胞集団のエピジェネティック研究に多大な恩恵をもたらし、非常に少数の細胞から高品質のデータを生成しました。このプロトコールでは、マウス後肢筋から単離したマウス筋芽細胞に対するH3K4me1 CUT&Tagアッセイの実施について説明します。

要約

このプロトコール論文は、Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tag)を使用して、クロマチン結合因子、ヒストンマーク、およびヒストンバリアントのゲノム位置をプロファイリングする方法の詳細を新しい研究者に提供することを目的としています。CUT&Tagプロトコールは、マウス筋芽細胞および新たに分離された筋幹細胞(MuSC)で非常に良好に機能します。Concanavalin-Aビーズで細胞を固定化できる限り、他の多くの細胞タイプに容易に適用できます。CUT&Tagと比較すると、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは時間のかかる実験です。ChIPアッセイでは、クロマチック材料を免疫沈降に使用する前に、クロマチンの前処理が必要です。架橋ChIP(X-ChIP)では、クロマチンの前処理には、クロマチンを断片化するための架橋と超音波処理が含まれます。ネイティブChIP(N-ChIP)の場合、断片化されたクロマチンは通常、Micrococcal nuclease(MNase)消化によって達成されます。超音波処理とMNase消化の両方がChIP実験にいくつかのバイアスをもたらします。CUT&Tagアッセイは、ChIPと比較してより少ないステップで終了し、必要な細胞数も大幅に少なくて済みますが、さまざまなゲノム位置の転写因子やヒストンマークに関するより偏りのない情報を提供します。CUT&Tagは、わずか5,000個の細胞で機能します。ChIPよりも感度が高く、バックグラウンドシグナルが低いため、研究者はシーケンシング後の数百万回の読み取りから信頼性の高いピークデータを取得することが期待できます。

概要

CUT&Tagアッセイは、^{ChIPs 1}の明らかな欠陥を補うために考案されました。ChIPの2つの大きな欠点は、1)クロマチンを断片化する際に生じるバイアスと、2)低い細胞数での作業ができないことです。X-ChIPアッセイは、クロマチンフラグメントを取得するために超音波処理またはMNase消化のいずれかに依存していますが、N-ChIPは主にMNase消化を使用してヌクレオソームを取得します。超音波処理は、プロモーター領域²のような弛緩したクロマチン位置に偏りを示しており、明らかに、MNase消化は弛緩したクロマチン繊維に対してもより効率的に機能します。また、MNaseの消化にもDNA配列依存的なバイアスが見られるとの報告もありました³。したがって、ChIPアッセイのインプット調製ステップでは、あらゆる種類のゲノム位置から完全にランダムな方法でクロマチンフラグメントを取得することは不可能です。さらに、ChIPアッセイは通常、CUT&Tagよりも高いバックグラウンドシグナルを生成し、ピークが^1,4,5である場所を強調するためにCUT&Tagよりも10倍以上のリードを必要とします。これが、ChIP実験がCUT&Tagよりもはるかに多くの細胞から始めなければならない理由を説明しています。細胞株を研究する際には、細胞株を繰り返し継代して非常に高い細胞数を達成できるため、これは問題になりません。しかし、ChIPアッセイは、希少なまたは貴重な初代細胞集団を研究するための強力なエピジェネティックなツールではないことは確かですが、初代細胞の方がより実用的で医学的な意味合いを持っていることは明らかです。

長くて複雑なChIP手順により、一部の研究者はこの手法を学んだり使用したりすることを思いとどまらせますが、人々は免疫細胞化学(ICC)や免疫蛍光(IF)などの簡単なアッセイに慣れています。CUT&Tagアッセイは、基本的にICCおよびIF実験のプロセスに似ていますが、試験管内でのみ行われます。CUT&Tagは、そもそも断片化されたクロマチンを必要とせず、代わりに、抗体結合¹のためにゲノムが無傷でなければなりません。ChIP実験の初日、研究者は通常、短いクロマチン片を抗体ビーズと混合する前に、ソニケーションまたはMNase消化で核から断片化されたクロマチンを調製するのに最大4時間を費やします^4,5。これとは対照的に、CUT&Tag法の初日の作業負荷は、細胞をConcanavalin-Aビーズに固定し、その後、細胞ビーズに一次抗体を添加することです。これには ~40 分¹ しか必要ありません。

特筆すべきは、Cleavage Under TargetsおよびRelease Using Nuclease(CUT&RUN)がCUT&Tagの重要な代替手段であることです。CUT&RUNは、CUT&Tagと同様の動作メカニズムに基づいて設立されました。CUT&Tagでは、抗体がpA/G-Tn5トランスポゼースをすべての場所に誘導し、酵素がそれぞれクロマチンの一部を切り取り、その間にライブラリ作製アダプターでタグを付けますが、CUT&RUNでは、pA/G-Tn5の役割は、ジョブの切断部分のみを実行するpA/G-MNaseによって果たされます⁶。そのため、CUT&Tagと比較すると、CUT&RUNでは、pA/G-MNaseで断片化されたDNA断片^7,8にライブラリー作製アダプターを接着する追加工程が必要になります。CUT&TagとCUT&RUNは類似性が高いため、CUT&Tagに精通した研究者は、CUT&RUNを上手に行うことに容易に適応することができます。ただし、CUT&TagとCUT&RUNには若干の違いがあります。CUT&RUNのプロトコルでは、通常、洗浄ステップで物理濃度の塩 (~150 mM) を使用しますが、CUT&Tagでは、300-Dig洗浄バッファーの塩分が多く含まれています。したがって、CUT&Tagは、ヒストンマーク/バリアントまたは転写因子をプロファイリングする際にバックグラウンドを制御するのが得意で、これらのタンパク質は^DNA1に直接かつ強力に結合します。CUT&Tagは、DNAに直接結合せず、クロマチンに対して弱い親和性を示すクロマチン関連因子をプロファイリングする際に問題に遭遇する可能性があります。CUT&Tagの高塩分洗浄ステップでは、クロマチン関連因子が取り除かれ、最終出力にシグナルが生成されない可能性があります。CUT&Tagを使用して非ヒストン/非転写因子タンパク質9をプロファイリングできる成功例もあります^が、弱く結合したクロマチン関連タンパク質のプロファイリングには、CUT&TagよりもCUT&RUNをお勧めします。

哺乳類が成体に達した後も、その骨格筋組織にはまだ筋幹細胞が含まれています。筋肉損傷の間、これらの幹細胞は活性化され、細胞数の拡大および分化を受けて損傷した筋線維^{を再生することができる10}。これらの幹細胞は、筋幹細胞/衛星細胞(MuSC)として知られています。MuSCは動物から単離された後、または筋肉の損傷によって活性化された後、増殖を開始し、筋芽細胞になります。

マウス骨格筋消化物からMuSCを得るために、Vcam1(Cd106)、Cd34、α7-インテグリン(Itga7)などのMuSC表面マーカーを個々に、または組み合わせて使用して、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)¹¹中にMuSCを濃縮することがよくあります。Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ は、おそらく>95%の純粋なMuSCを得るための最良のマーカーの組み合わせであることが示されています¹²。FACSは、新鮮な筋肉が消化された直後に純粋なMuSCを分離することができます。しかし、実験デザインが純粋なMuSCを分離する必要がない場合、プレプレーティングはFACSよりも費用対効果が高く、>90%の純粋な筋芽細胞(MuSC子孫)を得ることができます。

マウスから新たに単離されたMuSCは、ウシ胎児血清(FBS)を添加したハムのF10培地では効率的に増殖しません。MuSCの細胞数をより多く増やし、十分な筋芽細胞を得るためには、FBSの代わりにウシ成長血清(BGS)を使用すべきである。しかし、BGSが利用できない場合は、ハムのF10フル培地(約20%のFBSを含む)を等量のT細胞条件付き培地と混合して、筋芽細胞の増殖を劇的に促進することができる¹³。したがって、このプロトコルでは、T細胞培地コンディショニングMuSC培地の調製についても説明します。

最も重要なことは、このプロトコールは、マウス後肢筋から単離されたマウス筋芽細胞に対してH3K4me1 CUT&Tagアッセイを実施する完全な例を提供することです。このプロトコルは、他の細胞タイプやヒストンマーク、ヒストンバリアントにも適用され、読者は、研究する特定のヒストンマークやバリアントの濃縮に基づいて、自分のケースの細胞数や抗体量を最適化するだけでよいことにご注意ください。

CUT&TagまたはCUT&RUNで使用するには、Tn5またはMNaseをプロテインAまたはプロテインGと融合させて、pA-Tn5、pG-Tn5、pA-MNase、またはpG-MNaseを生成する必要があります。明らかに、プロテインAとプロテインGの両方をこれらの酵素に同時に融合させて、pA/G-Tn5またはpA/G-MNaseを生成することができるようです。プロテインAとプロテインGは、異なる種由来のIgGに対して異なる親和性を示します。したがって、プロテインAとプロテインGを酵素に融合させることで、この問題を克服し、酵素を複数の生物種の抗体と適合させることができます。

プロトコル

この原稿で提示されている方法はすべて、広州研究所の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。この原稿の代表的な結果を得るために使用したマウスは、広州研究所の動物管理委員会のガイドラインに従って飼育および維持されました。

1. マウス後肢筋からの筋芽細胞の分離(マウス1匹を使用した例)

1. 氷酢酸をddH₂Oで0.02 Mに希釈し、オートクレーブします。
2. コラーゲン(ラットの尾由来)を0.02 M酢酸で0.1 mg/mLに希釈します。
3. このコラーゲン溶液を培養皿に加え、皿の底を37°Cの細胞インキュベーターで一晩コーティングします。
4. 使用前にコラーゲン溶液を取り除き、1x PBSで皿を2回洗ってください。コラーゲン溶液は8〜10回再利用できます。
5. 生後8〜12週のマウスを犠牲にします。(老齢マウスは、MuSCと筋芽球の収量が乏しい。
6. マウスからすべての後肢筋を分離し、10cmの皿に入れます。
7. 1x PBS(ペニシリン/ストレプトマイシンを含む)を使用して、筋肉を4回すすぎます。.すすぐたびに、常に筋肉を新しいプレートに移します。
8. 最後のすすぎ後、PBSを取り除き、ハサミで筋肉を細かく刻みます。
9. ジスパーゼII(1.1 U/mL)およびコラゲナーゼII(830 U/mL)を含む1x PBSを6 mL加えて、ミンチした筋肉を消化すると、消化は~1.5時間持続します。
10. 消化を行うには、ミンチした筋肉を37°Cのウォーターバスのチューブに移すか、ミンチした筋肉を直接皿に入れて37°Cの_CO2 細胞インキュベーターに入れます。
11. 細胞インキュベーターを使用して消化する場合は、15〜30分ごとに皿を揺らして消化をよく混ぜます。
    注:ディスパーゼIIは、最初にDMEM培地(血清なし)で11 U/mLストックとして作成し、コラゲナーゼIIは1x PBSで10,000 U/mLストックとして作成する必要があります。
12. 消化が完了したら、10 mLのプラスチック製ピペットを使用して、消化した組織を数回上下に洗い流し、消化混合物を完全に均質化します。
13. 10 mLのMuSC/筋芽細胞増殖培地を加えて、消化を遅らせます。MuSC/筋芽細胞増殖培地の調製に関する詳細は、セクション2でご覧いただけます。
14. 混合物を70μmのストレーナに通します。1x PBSを使用して消化プレートをすすぎ、このPBSをストレーナーにも通して、消化プレート内のすべての細胞を収集します。
15. 350 x g で10分間遠心分離し、上清を真空で廃棄します。
16. 細胞ペレットを20 mLの1x PBSで再懸濁し、細胞を40 μmストレーナに通します。
17. 350 x g で5分間遠心分離し、上清を真空で除去します。
18. 20 mLのMuSC/筋芽細胞増殖培地を使用して細胞を再懸濁し、10 cmの正常なプラスチックプレートに細胞を播種します。この間、MuSCはプレートの底部に付着できず、主にメディア内で浮遊したままになります。
    注:これはプラスチックプレートへの最初のプレメッキです。
19. 1.5時間後、プレートを短時間揺さぶり、液体をコラーゲンでコーティングした2つの10cmディッシュに移し、各ディッシュには10mLの培養物が含まれています。これで、MuSCはコラーゲンでコーティングされたプレートに付着して成長します。2日後にメディアを交換してください。コラーゲンコーティングされたプレートは、このセクションのステップ1〜4のように調製されます。
20. 別の日の後、細胞を継代します:培地を取り除き、細胞を1x PBSで一度洗浄し、細胞をトリプシンします。
21. MuSC/筋芽細胞増殖培地を使用して、細胞をプレートから洗い流し、細胞を新しいプラスチックプレートに移し、細胞インキュベーターで40分間インキュベートします。
    注:これはプラスチックプレートへの2回目のプレメッキです。
22. 培養物を新しいプラスチックプレートに注ぎ、細胞インキュベーターでさらに20分間インキュベートします。
    注:これはプラスチックプレートへの3回目のプレメッキです。
23. 次に、プレート内の上清をコラーゲンでコーティングした10cmの皿8つに分割し、細胞を継代培養します。ここでの通過率は2:8(1:4)です。上記のプレメッキを3回行った後、筋芽細胞は純度90%以上に達することがあります。したがって、この時点以降、筋芽細胞をさらに通過する際に事前にプレートする必要がなくなります。

2. MuSC/筋芽細胞増殖培地の調製(マウス5体から調製した例)

1. 若くて健康な野生型マウス5匹を犠牲にし、脾臓を分離し、1x PBS(ペニシリン/ストレプトマイシンを含む)で脾臓を1回すすいでください。
2. ハサミを使用して、脾臓の暗い部分/斑点がある場合はそれを取り除きます。脾臓のほとんどが黒くなっている場合は、脾臓を捨ててください。
3. 5つの脾臓すべてを50 mLチューブの上部にある40 μmストレーナーに入れます。
4. 滅菌済みの1mLシリンジパッケージを開封し、プランジャーを引き出し、バレルを廃棄します。
5. 40μmのストレーナでゴム栓を持ち、プランジャーのサムレストを使用して脾臓組織を粉砕し、単一細胞に解離します。シリンジパッケージを引き裂くときは、プランジャーの親指レストに触れて汚染しないように注意してください。
6. 脾臓を粉砕しながら、時々1x PBSを使用して、解離した脾臓細胞をストレーナーの下の50mLチューブに洗い流します。
7. すべての脾臓細胞がストレーナーを介して50 mLチューブにフラッシュされた後、チューブを500 x g で10分間遠心分離します。
8. 1 mLの1x Red blood cell lysis bufferを使用して、ペレットを再懸濁します。赤血球を~1分間溶解します。
   注:10倍赤血球溶解バッファーは、ddH₂Oに155 mM NH₄Cl、10 mM NaHCO₃、および1 mM EDTA二ナトリウム塩を含んでおり、滅菌するためにフィルターを滅菌し、オートクレーブしないでください。使用前にddH₂Oから1xで希釈してください。
9. 50mLのチューブに1x PBSを充填し、赤血球の溶解プロセスを停止します。
10. 細胞懸濁液を40μmストレーナで再度濾し、500 x g で10分間遠心分離します。
11. 2 mLのRPMI-1640フル培地(10% FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地)で細胞を非常に穏やかにピペッティングして再懸濁します。
12. RPMI-1640フルメディアをチューブに追加し、よく混ぜます。細胞懸濁液を10個のT75培養フラスコに分配します。各T75培養フラスコの最終培養量は20 mLである必要があります。
13. 各T75培養フラスコにConcanavalin-Aストック10 μLを加え、よく混ぜ合わせます。コンカナバリン-Aは、T細胞の増殖を活性化します。
    注:Concanavalin-Aストックは4 mg / mLで、Concanavalin-Aを1x PBSに溶解して調製します。.ここではConcanavalin-A自体を使用しており、後からCUT&Tagアッセイで使用されるConcanavalin-Aビーズと混同しないでください。
14. 48時間後、各T75フラスコにさらに20 mLのRPMI-1640フル培地を補充して、合計容量が最大40 mLになるようにします。
15. さらに24時間後、各T75フラスコにすべての培養物を回収し、600 x g で3分間遠心分離します。
16. 上清はT細胞条件付き培地であり、-20°Cから-80°Cで最大2ヶ月間保存できます。脾臓細胞ペレットを廃棄します。使用前に、T細胞コンディショナル培地を解凍し、さらに0.22μmフィルターを使用して培地を滅菌します。
17. Ham's F10をフル培地にするには、100 mLのFBS、300 μLのbFGFストック、および6 mLのペニシリン/ストレプトマイシンを500 mLのHam's F10培地に加えます。
    注:bFGFストックは5 μg/mLで、bFGFをハムのF10培地に溶解して調製します。
18. Ham's F10フル培地を上記のろ過済みT細胞条件付き培地と1:1の比率で混合し、MuSC/筋芽細胞増殖培地を作製します。

3. 筋芽細胞を用いたCUT&Tag(3つのCUT&Tag反応の例)

1. 主要試薬の調製
   1. pA/G-Tn5トランスポゼースを細菌培養物から社内で精製し、公開された方法¹⁴を使用します。この酵素は、ライブラリ作成DNAアダプターがマウントされるまで、その機能的な形に到達しません。最も重要なことは、pA/G-Tn5が多くの供給元から市販されていることです。
   2. アダプターを作るためのオリゴを 表1に示します。具体的には、Oligo-RevをOligo-AおよびOligo-Bとアニールして、それに応じて二本鎖Adaptor-AとAdaptor-Bを作製します。アダプターを作るためのアニーリングの詳細は、他の場所で見つけることができます¹⁴。
   3. Adaptor-AおよびAdaptor-BをpA/G-Tn5トランスポザーゼと室温(RT)で2時間インキュベートします。その後、このトランスポゼースは機能的な形を取ります。この原稿の次のセクションでは、pA/G-Tn5の機能型をpA/G-Tn5aと呼びます。
      注:pA/G-Tn5が自社製ではなく購入された場合は、購入した商品がアダプター付き(つまり、すぐに使用できる)でpA/G-Tn5が取り付けられているのか、それともpA/G-Tn5酵素自体なのかを明確にしてください。酵素だけの場合は、上記の2つのアダプターを調製し、pA/G-Tn5にマウントしてから、最終的にこの酵素をCUT&Tagに使用してください。
   4. Binding buffer、Wash buffer、Dig-wash buffer、300-Dig buffer、および Tagmentation バッファーのレシピについては、Kaya-Okur et ^al.1 も参照してください。
   5. 20 mM HEPES pH 7.5、10 mM KCl、1 mM CaCl₂、および1 mM MnCl₂を含む結合バッファーを調製します。
   6. 20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、および1x Protease inhibitorカクテルを含むWashバッファーを調製します。
   7. ジギトニンをDMSOの濃縮ストックとして作製し、ジギトニンをWash bufferに0.5 mg/mLの濃度で添加してDig-wash bufferを調製します。
   8. Dig-washバッファーにEDTAを2 mMの濃度に、BSAを0.1%の濃度に添加して、抗体バッファーを調製します。
   9. 20 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl、0.5 mM Spermidine、1x Protease inhibitor カクテル、および0.1-0.5 mg/mLジギトニンを含む300-Digバッファーを調製します。
   10. 300-Digバッファーに10 mM MgCl₂を添加して、Tagmentationバッファーを調製します。MgCl₂ は、pA/G-Tn5aの酵素活性を活性化することができます。
       注:その他の材料の情報は、 Table of Materials ファイルに記載されています。
2. Concanavalin-Aビーズの活性化
   1. 1.5 mLの遠心チューブで、Concanavalin-A Beads 30 μL (反応ごとに10 μL) をBinding buffer 300 μLに混合します。よく混ぜるために数回反転させます。チューブを磁気ラックに置きます。液体が透明になったら、上清を取り除きます。
   2. チューブをマグネティックラックから取り出し、チューブに300 μLのBinding bufferを加えてよく混合し、8-PCRチューブストライプの3つのチューブに均等に分割します。各チューブを1つのCUT&Tag反応で指定します。
   3. 8-PCRチューブストライプを磁気ラックに置き、液体が透明になるまで待ちます。
   4. 上清を吸引し、チューブを磁気ラックから取り外します。各チューブに10 μLのBinding bufferを加え、よく混合します。調製したビーズを氷上または4°Cに置き、細胞が進行する準備ができるまで待ちます。
3. Concanavalin-Aビーズへの細胞の結合
   1. 培養マウス筋芽細胞をプレートからトリプシンし、細胞をRT 1x PBSで一度洗浄し、最終的にRTの洗浄バッファーに細胞を再懸濁します。トリプシン過剰化は、Concanavalin-Aビーズに対する細胞膜の親和性を損なう可能性があるため、避けてください。
   2. Washバッファー中の細胞密度を約7 x 10⁵ 細胞/mLに調整し、100 μLの細胞懸濁液に約70,000個の細胞が含まれ、1回のCUT&Tag反応に十分な量になるようにします。
   3. 100 μLの細胞懸濁液を、調製済みのConcanavalin-Aビーズ10 μLがすでに含まれている8-PCRチューブストライプの各チューブにピペットで移します。よく混合し、「シーソーモーション」シェーカーでRTで10分間インキュベートします。
   4. 8-PCR チューブストライプを磁気ラックに取り付けます。それがきれいになるまで待ってから、上清を取り除きます。
   5. Concanavalin-Aビーズが効率的に細胞を隔離したかどうかを評価するには、顕微鏡で上清をチェックして、上清に残っている細胞の数を確認します。Concanavalin-Aビーズ結合ステップの後、上清中にはほとんど細胞が観察されないか、まったく観察されません。
4. 細胞を一次抗体でインキュベート
   1. 各サンプルについて、1 μL の H3K4me1 抗体を 50 μL の抗体バッファーに希釈し、希釈した抗体を各サンプルチューブに加えます。チューブを数回反転させて、希釈した抗体とビーズをよく混合します。サンプルをシーソーモーションシェーカーに載せて、4°Cで一晩インキュベートします。
      注:Steven Henikoff¹博士が述べたように、すべてのCUT&TagアッセイでIgGネガティブコントロールを使用する必要はありませんでした。ChIPと比較して、CUT&Tagアッセイはバックグラウンドシグナルがはるかに低いか、まったくありません。したがって、IgGを使用して「ネガティブコントロール」のCUT&Tagアッセイを行っても、有用な情報は得られません。一方、CUT&Tagでバリデーションされた抗体を用いてポジティブコントロールを行うことは、CUT&Tagアッセイが機能したかどうかを評価するために重要です。
5. 二次抗体による細胞のインキュベーション
   1. 翌日の朝、サンプルを磁気ラックに置き、サンプルがクリアされるまで待ちます。
   2. 一次抗体である上清を取り除きます。ビーズを洗う必要はありません。希釈した(1:100)二次抗体50 μLを各サンプルチューブに直接加えます。
      注:二次抗体は、Dig-washバッファーで1:100の比率で希釈します。pA/G-Tn5aの認識をより効率的に行うためには、二次抗体をHRP、ビオチン、フルオロフォアなどの分子やグループと結合させないでください。
   3. よく混合し、RTで「シーソーモーション」シェーカーで1時間インキュベートします。
   4. サンプルを磁気ラックに戻し、サンプルがクリアされるまで待ってから、上清を捨てます。
   5. 各チューブに200 μLのDig-washバッファーを加え、数回反転させて過剰な抗体を洗い流します。
   6. 磁気ラックに戻し、それがクリアになるまで待ってから、上清を取り除きます。この洗浄をさらに2回繰り返して、余分な未結合の抗体を完全に除去します。
6. pA/G-Tn5aによる細胞のインキュベーション
   1. 最後の洗浄後、サンプルを磁気ラックに置き、サンプルがクリアになるまで待ってから、チューブ内のすべての液体を取り除きます。各サンプルチューブについて、pA/G-Tn5aを含む300-Digバッファー100 μLを0.04 μMで加え、よく混合し、シーソーモーションシェーカーでRTで1時間インキュベートします。
   2. マグネティックラックを装着します。サンプルがクリアになるまで待ってから、上清を取り除きます。
   3. 各サンプルに200 μLの300-Digバッファーを加え、よく混合し、シェーカーに載せてサンプルを室温で3分間洗浄します。
   4. マグネティックラックを装着します。サンプルがクリアになるまで待ってから、上清を取り除きます。この洗浄をさらに2回繰り返して、余分なpA / G-Tn5aを取り除き、バックグラウンドを下げます。
7. ゲノムの切断とタグ付け
   1. 最後の洗浄後、サンプルを磁気ラックに置き、液体をチューブから完全にピペートします。各サンプルに、50 μLのTagmentationバッファーを加えます。よく混合し、PCR装置で37°Cで1時間インキュベートします。PCR装置の蓋加熱機能は使用しないでください。
      注:オプションで、次のゲノムDNA精製ステップ中に材料が摩耗するため、一部のスパイクインDNAをタグメンテーションバッファーに追加して、スパイクインが最終シーケンシング結果に表示され、データの正規化に使用できます。スパイクインDNAを調製し、使用する方法は、他の場所で見出すことができる¹⁴。
8. 全ゲノムDNA精製
   1. タグメンテーション後、各サンプルにさらに150 μLのタグメンテーションバッファーを加えます。これで、総容量は200μLになりました。
   2. 次に、各サンプルについて、0.5 M EDTAを10 μL、10% SDSを3 μL、20 mg/mL Proteinase K.ボルテックスを2.5 μL加えてよく混合し、55^°Cで2時間インキュベートします。
   3. 各サンプルを1.5 mLの遠心チューブで200 μLのフェノール/クロロホルムにピペットで移し、ボルテックスで10秒間静置します。18,000 x g で5分間遠心分離します。最上層を新しい1.5 mL遠心分離チューブに移します。
   4. 各チューブに200μLのクロロホルムを加え、10秒間ボルテックスします。18,000 x g で5分間遠心分離します。
   5. 最上層を新しい1.5 mL遠心チューブに吸引します。次に、各サンプルについて、550 μLの100%エタノールを加えて、DNAを-80°Cで1時間沈殿させます。DNAペレットをよりよく視覚化するには、20 mg/mLグリコーゲン1 μLを添加します。
   6. 最高速度(>18,000 x g)で15分間遠心分離し、DNAをペレット化します。
   7. 上清を慎重に注ぎ、グリコーゲン/ DNAペレットを75%エタノールで一度洗浄し、再び最高速度で5分間遠心分離します。
   8. 75%エタノールを取り出し、グリコーゲン/DNAペレットを21 μLのddH₂Oで再懸濁します。
9. ライブラリの調製とシーケンシング
   1. ライブラリ調製 PCR をセットアップします。一緒にシーケンシングするサンプルをインデックス化するには、サンプルごとに異なるN7XX IlluminaプライマーとユニバーサルN5XX Illuminaプライマーを使用します。12個を超えるサンプルをインデックス化する場合は、異なるN5XX Illuminaプライマーも必要になります。イルミナは12個のN7XXプライマーと8個のN5XXプライマーを提供しているため、N7XXとN5XXの組み合わせの総数は12 x 8 = 96です。PCR反応のセットアップを 表2に示します。
   2. ライブラリ調製PCRにおけるPCRサイクル番号は、CUT&Tagアッセイで使用した細胞数で大まかに判断してください。通常、50,000-100,000個の細胞を用いたCUT&Tagアッセイでは、9-12サイクルで十分であり、10,000-50,000個の細胞数であれば最大14サイクルかかる場合があります。PCRプログラムを 表3に示します。
      注:ほとんどのCUT&Tagアッセイでは、抗体が適切に機能していれば、PCRサイクル番号が9〜14であれば、常にシーケンシングに有用なライブラリーが生成されます。優れたライブラリーは、通常、濃度が 10-50 ng/μL (Qubit アッセイで決定)、容量が 20-30 μL です。それどころか、抗体が効率的かつ特異的に機能しなかった場合、サイクル数を増やすだけでは実験を救うことはできません。サイクル数が多すぎると、結果にまったくメリットがなく、代わりにPCRの重複が増え、後でデータ解析が複雑になります。
   3. 市販のDNA精製/サイズ選択ビーズを使用して、ライブラリDNAを精製し、望ましいサイズのDNAを選択します。
   4. 精製したライブラリーの少量のアリコートを水で希釈し、ChIP-qPCR実験と同様に、遺伝子座特異的プライマーを用いたqPCRに使用して濃縮度を確認します。ライブラリのシーケンシングを行う前に、CUT&Tag が機能しているかどうかを判断するのに役立ちます。
   5. 製造元の指示に従って、シーケンシングとデータ解析を実行します。
      注:CUT&Tagキットは、いくつかの企業から市販されており、その一例がTable of Materials ファイルに記載されています。

結果

Concanavalin-Aビーズに細胞を結合する前に、顕微鏡で細胞懸濁液を確認してください。したがって、Concanavalin-Aビーズで細胞をインキュベートした後、サンプルチューブを磁気ラックに置き、上清を顕微鏡で再度観察する必要があります。これは、Concanavalin-Aビーズによって細胞がどれだけ効率的に捕捉されたかを評価するためです。7 x 10⁵ 細胞/mLを含む洗浄バッファーは、顕微鏡下で 図1A のようになります。対照的に、 図1B は、Concanavalin-Aビーズ結合後の上清を示しており、ビーズがすべての細胞を取り除いています。Concanavalin-Aビーズが細胞を効率的に捕捉していなかったら、CUT&Tagの次のステップに進む意味はありません。洗浄バッファーは、Concanavalin-Aビーズへの細胞膜の結合を廃止する可能性があるため、血清含有量やEDTA/EGTAを含んではいけません。しかし、ウシ血清アルブミンは、細胞へのコンカナバリン-Aの結合を妨げません。

PCRでCUT&Tagライブラリを作製した後、ライブラリの少量アリコート(3-4 μL)を1.2-1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、ライブラリが良好かどうかを試験することができます。 図2 は、H3K4me1 CUT&Tagライブラリの成功例を示しています。ヒストンマークまたはヒストンバリアントCUT&Tagでは、切断されたユニットの大部分は明らかにモノヌクレオソームですが、2つのヌクレオソームを一緒に切り取ることもできます。3つのヌクレオソームが切断され、全部でタグ付けされることは非常にまれです。したがって、モノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム、および非常に少ないトリヌクレオソームを含むヌクレオソームアレイは、ヒストンマークCUT&Tagライブラリの電気泳動で観察されるべきです。ヌクレオソームには147 bpのDNAが含まれていますが、Tn5トランスポザースとライブラリーPCRによってシーケンシングアダプターを追加すると、 図2に示すように、CUT&タグ付きモノヌクレオソームの合計サイズは300 bpになるはずです。

CUT&Tagライブラリのハイスループットシーケンシングに費用をかける前に、別の品質管理方法として、遺伝子座特異的プライマーを用いたqPCRを実施します。これは、ChIP-qPCRを実行するのと同じです。また、CUT&Tag qPCRの遺伝子座特異的プライマーは、ChIP-qPCRプライマーと同じ原理に基づいて設計されています。図3は、Myod1遺伝子座上のさまざまな位置のqPCR増幅を示しています。Myod1は、筋形成中の骨格筋の系統を決定するマスター転写因子であるMyoDをコードしています¹⁵。図3に示すように、H3K4me1はMyod1遺伝子座のコアエンハンサー(CER)と遠位調節領域(DRR)で高度に濃縮されています。CERとDRRは、Myod1¹⁶の非常に確立されたエンハンサー領域です。これは、H3K4me1が特に委託されたエンハン^サー17をマークするという十分に文書化された表現型と一致しています。さらに、図3は、活性プロモーターの近位領域のヌクレオソームが通常H3K4me1ではなくH3K4me3¹⁸で修飾されるため、H3K4me1レベルが近位調節領域(PRR)で非常に低いことを示しています。これらの評価された遺伝子座のすべてのプライマーペアは以前に発表されており^19,20、配列は表4にあります。通常、特定の遺伝子座に対するライブラリDNA電気泳動とqPCRによる品質管理を行った後、研究者は自信を持ってシーケンシングを進めることができます。

図1:Washバッファーに再懸濁した筋芽細胞。 (A)Concanavalin-Aビーズ結合前と(B)結合後の顕微鏡図。パネルBは、Concanavalin-Aビーズインキュベーション後の懸濁液中に細胞がほとんど残っていないことを示しており、細胞がビーズによって効率的に捕捉されたことを示しています。パネルBの小さな粒子は、過剰なConcanavalin-Aビーズである可能性が高いです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:CUT&Tagライブラリの電気泳動。 3つの独立したH3K4me1 CUT&Tagアッセイを実施し、それぞれをIlluminaプライマーとPCRを使用してシーケンシングライブラリにしました。各H3K4me1 CUT&Tagは、70,000個のマウス筋芽細胞を使用しました。ライブラリには、主にタグ付きモノヌクレオソームが含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Myod1遺伝子座上の異なる位置のqPCR増幅。 qPCRは、マウス筋芽細胞では、H3K4me1マークがMyod1遺伝子のエンハンサー領域で高度に濃縮されていることを示しており、これは発表された結論と一致しています。CERおよびDRRは、Myod1プロモーターの上流に位置するMyod1のエンハンサーとして公開されています。PRRにはH3K4me1の蓄積がなく、これは活性プロモーターが主にH3K4me3でマークされているという事実とも一致していることに注意してください。濃縮度は、サンプル「Repeat 1」の「gene desert」上のH3K4me1の濃縮度に正規化して計算した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

名前	シーケンス (5'-3'):
オリゴレブ	phos-CTGTCTCTTATACACATCT
オリゴエー	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTGTATAAGAGACAG
オリゴB	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

表1:アダプターAおよびアダプターBをpA/G-Tn5トランスポザーゼにマウントするためのオリゴ配列。

端数	容積
CUT&Tag反応後の精製ゲノムDNA	21μL
N5XXプライマー(10μM)	2 μL
N7XXプライマー(10 μM)	2 μL
NEBNext High-Fidelity 2× PCR マスターミックス	25μL
	合計 50 μL

表2:Illuminaインデックスプライマーを用いたCUT&Tagライブラリー調製のためのPCRセットアップ。 DNAポリメラーゼミックスなどのライブラリPCR試薬を含む市販のCUT&Tagキットを使用する場合は、そのキットの特定のマニュアルに従ってライブラリPCRをセットアップしてください。

歩	温度	時間	サイクル番号
1	72 °C	3分間	1
2	95 °C	3分間	1
3	98 °C	10秒	9歳から14歳まで
4	60 °C	5 秒後、ステップ 3 に進みます
5	72 °C	1分間	1
6	4 °C	持つ	該当なし

表3:Illuminaインデックスプライマーを用いたCUT&Tagライブラリ調製のためのPCRプログラム。

場所	プライマー配列 (5'-3')
CERの	対象:GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	リビジョン:CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	対象:TGC、CCA、GA、GA、ATC AT
	改訂:TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	対象:GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	改訂:ATG、CCA、CTA、TGC、AAT、CCA、CA
災害リスク軽減	対象:TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	改訂:CTG、GAC、CTG、TGG、CCT、CTT、AC、
PRRの	対象:GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	改訂:GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1の	対象:CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	改訂:CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2の	対象:GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	改訂:GTT、GCA、CTA、CAC、AGC、ATG、CCT G
IgHエンハンサー	対象:ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	改訂:CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
ジーン砂漠	対象:TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	改訂:GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

表4: Myod1 遺伝子のさまざまな位置でH3K4me1濃縮をテストするための遺伝子座特異的プライマー。

ディスカッション

特定のCUT&Tag反応に必要な特定の細胞数は、試験対象のヒストンマーク/バリアントまたはクロマチン結合タンパク質の濃縮に完全に依存しています。通常、H3K4me1、H3K4me3、H3K27acなどの非常に濃縮されたヒストンマークの場合、1回のCUT&Tag反応には25,000-50,000個の筋芽細胞で十分です。ただし、一部のまれなクロマチン結合タンパク質は、最大250,000個の細胞を必要とする場合があります。CUT&Tagアッセイで使用される細胞番号は重要であり、適切に処理しないと通常、アッセイの失敗の原因となります。CUT&Tag反応に過剰な数の細胞を使用することは、特に非常に濃縮されたヒストンマークを試験する場合に有害です。細胞が多すぎると、各細胞に割り当てられた抗体が不十分になります。CUT&Tagは、非常に低いセル番号で機能するだけでなく、実際にはシングルセルレベル¹で適用できます。

何よりも、高い親和性と特異性を持つ信頼性とバリデーションされた抗体を使用することが、CUT&Tagアッセイを成功させるための鍵となります。ChIP、免疫沈降(IP)、IFアッセイと同様に、CUT&Tagにも自然に折りたたまれた抗原を認識できる抗体が必要です¹。対照的に、ウェスタンブロットで弛緩したペプチドのみを認識する抗体は、CUT&Tagでは厳重に避けるべきです。

細胞数の最適化や、免疫蛍光法でバリデーションされた抗体、または十分に引用された抗体を使用しても、CUT&Tagアッセイのシグナル不良の問題を解決できない場合は、目的のタンパク質がDNAに弱く結合するクロマチン関連タンパク質なのか、それともDNAに直接結合しないのかを調べてください。この場合は、前述のように、CUT&Tag の代わりに CUT&RUN を使用するように切り替えます。あるいは、0.5%パラホルムアルデヒドに5分間浸漬する(その後、0.1 Mグリシンに10分間急冷する)などのわずかな固定法も、試験する価値のある方法かもしれません。しかし、CUT&Tagアッセイで固定を実践したことはなく、CUT&Tagを実行する前に細胞を固定する必要にさえ遭遇したことがないため、架橋についてこれ以上のコメントはできません。

CUT&Tagプロトコルのバージョンによっては、一次抗体のインキュベーションステップにRT(2時間)と4°C(一晩)の両方で適切な結果が得られると主張している場合があることを理解しています²¹。ただし、RTを2時間使用するのではなく、4°C(一晩)を使用することを強くお勧めします。一方、インキュベーション時間を一晩以上延長することもお勧めしません。

感度、バックグラウンドコントロール、研究者が扱う複雑さの度合いの点で、CUT&TagはChIPアッセイよりも優れています。ChIPと比較してCUT&Tagにいくつかの欠点があるとすれば、唯一の欠点は、CUT&Tagプロトコルには、ChIPアッセイで「インプット」を使用するような内部標準化方法が含まれていない^{ことです1。}そのため、CUT&Tagを使用してサンプル間のピーク高さを比較する場合、研究者はまずサンプル間の細胞数を均等にする必要があります。また、技術的なレプリケートを含めることも重要です。

このプロトコールは、マウス筋芽細胞におけるCUT&Tagの実施について、この細胞タイプにおけるH3K4me1 CUT&Tagの成功例を提供することで、詳細を示しています。ここで説明する方法は、新たに単離されたMuSCに何も変更せずに直接適用できます。さらに、ヒストンマーク、ヒストンバリアント、または他の細胞タイプの転写因子に関するCUT&Tag実験も、このプロトコルに従って実施することができます。筋管または筋線維の場合、最初に核を単離し、次に筋核に対してCUT&Tagを実行できます。これを行うと、このCUT&Tagプロトコルで細胞が処理されるのと同じように核を治療できます。筋管と筋線維は多核細胞であり、筋管や筋線維をConcanavalin-Aビーズに直接結合できるかどうかは検証していませんが、これは可能かもしれません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
bFGF	のR&D Systems	233-FB-025
コラーゲン	コーニング	354236
コラゲナーゼ II	ワージントン	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A ビーズ	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17105041
ウシ胎児血清	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1抗体	abcam	ab8895
ハムのF10培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11550043
Hyperactive Universal CUT&Illumina用タグアッセイキット	Vazyme	TD903	このキットは、
1.5 mL EPチューブ用磁気ラック	Qualityard	QYM06
8-PCRチューブストライプ用磁気ラック	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	ライブラリ作成用PCR反応
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	使用前にアダプターを取り付ける必要があります
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C11875500BT
二次抗体 (モルモット抗ウサギ IgG)	抗体-オンライン	ABIN101961
スペルミジン	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 イルミナ用	Vazyme	TD202	このキットは、Illumina N7XXおよびN5XXプライマーを提供します
VAHTS DNAクリーンビーズ	Vazyme	N411	Ampure XPビーズの代わりに使用できます。CUT&を精製できますライブラリにタグを付け、サイズごとにDNAフラグメントを選択