半水耕栽培の根滲出液プロファイリングのための汎用性の高いガラスジャーシステム

人口密度の高い土壌の中では、根圏は炭素が豊富なニッチを提示します。植物の根は、最大20%の同化炭素の滲出によって形成され、常在する土壌微生物叢とは異なる微生物群集を保有しています1,2,3,4,5,6。研究者が根関連微生物の有益な機能とそれに伴う持続可能な農業の可能性を活用するにつれて⁷、根圏効果と呼ばれることが多いこの観察は、ますます科学的な取り組みの焦点となっています。しかし、これまでのところ、根圏効果の原動力であると提案されている微生物と植物の間の化学的対話は十分に理解されていないままであり、したがって、農業における信頼性の高い微生物ソリューションの開発のためのメカニズムの理解は限られています^8,9,10。

代謝産物が土壌粒子に容易に吸収され、微生物群集によって急速に転覆する土壌環境における根の滲出液の解読は、特にモデル植物のシロイヌナズナ¹¹のような細かい根系を持つ植物種では簡単ではありません。 これが、ほとんどの研究で、根の滲出液が水耕栽培システムからサンプリングされる理由です。これらの小宇宙では、植物の地上部は、カスタマイズされた植物ホルダーや、メッシュ、寒天、ガラスビーズなどのより控えめな素材によって所定の位置に保持されます。使用される容器は、マルチウェルプレート上のペトリ皿から、曝気フィルター付きまたはエアレーションフィルターなしのさまざまなカスタムおよび業務用ボックスまで多岐にわたります^{12、13、14、15、16、17、18、19}。システムによって、植物の成長条件は大きく異なり、多かれ少なかれ自然条件を反映します。

ここでは、実験的に適応性があり、再現性の高い結果を生み出すガラスベースの半水耕栽培システムを紹介します。組み立てと使用は簡単で、一般的に入手可能な材料に基づいています。このシステムは、ガラスビーズを充填したガラス瓶をベースにしており、ガラス器具の再利用可能な性質と低結合性を利用しています(図1)。ビーズは、成長する植物を物理的にサポートし、機械的インピーダンスをシミュレートし、水耕栽培のセットアップ^19,20,21と比較して、より土壌のような根の構造に貢献します。微生物を接種すると、ガラスビーズはバクテリアが付着する表面になります。

ガラス瓶は無菌状態を維持するために閉じることができ、システムは十分なヘッドスペースと空気循環を可能にするように設計されており、湿度が飽和した環境を回避します。瓶は、さまざまな植物種の長期成長に適しており、さまざまなサイズの瓶を使用してスケールアップおよびスケールダウンできます。ここでは、C3およびC4の草、双子葉植物、およびマメ科植物をカバーする6つの植物種のアプリケーションが示されています。その中には、モデル種 A.thaliana (双子葉植物)、 Brachypodium distachyon (C3単子葉植物)、 Medicago truncatula (マメ科植物)、 およびSolanum lycopersicum (トマト、双子葉植物)、 Triticum aestivum (小麦、C3単子葉植物)、 およびSorghum bicolor (ソルガム、C4単子葉植物)などの作物種があります。提示されたプロトコルには、システムの実験セットアップ、6つの植物種の種子滅菌と発芽、瓶への苗の移植、さまざまな成長培地、微生物の接種、根の滲出液サンプリング、および分析のための滲出液処理が含まれます。

1.苗の準備:種子の表面殺菌

注:種子の表面滅菌とそれに続くすべてのステップは、特に断りのない限り、無菌状態で行う必要があります。ステップ1.1から1.4は、 A.thaliana 種子の表面殺菌に特有です。他の植物種では、チューブサイズ(種子の数と種子サイズに応じて)、溶液中の時間、および滅菌溶液に別のバリエーションがあります(表1)。

1. 微量遠心チューブ(最大20mgの種子)に種子を加え、種子を70%エタノールで覆います。
   注意: エタノールは可燃性です。直火の近くで使用しないでください。
2. 閉じた微量遠心チューブをシェーカーに15分間移動させ、種子が穏やかに攪拌されるように回転を設定します。
3. ピペットで70%エタノールを慎重に除去し、100%エタノールと交換します。手順 1.2 を繰り返します。
4. 100%エタノールを除去し、微量遠心チューブの蓋を無菌空気流で開いたままにして種子を乾燥させます。
5. 種子が乾いたら、チューブをはじくか、滅菌鉗子を使用して、0.7%の植物寒天を含む0.5x Murashige and Skoog(MS)培地に均等に広げます。寒天プレートを閉じ、1.25cmのマイクロポアテープで密封します。
6. プレートを増殖チャンバーの棚に水平に置きます(16時間明るい/8時間暗い、22°C昼/18°C夜、150-160μmol ^{m-2 s-1})。

2.苗の準備:発芽した種子を新鮮なプレートに移す

注:次の手順は A.thaliana に固有であり、他の種には必要ありません。

1. 発芽後、苗木を上から約3 cmのところに直線的に配置して、5〜6本の苗木を0.5x MS培地で新しい0.7%植物寒天プレートに移します( 図2Dのロゼットの位置を参照)。
2. 寒天プレートを1.25cmのミクロポアテープで密封し、発芽後15〜18日で苗木を瓶に移す準備が整うまで、成長チャンバー内で垂直に成長させます(図2D)。

3.水耕栽培システムの準備:ジャーのセットアップ

1. 清潔なジャーごとに150 mLの清潔な5 mmガラスビーズを加え、蓋をして閉じます(図1A)。
   注:このプロトコルでは、5mmのガラスビーズがほとんどの種²²に適していますが、ビーズのサイズは必要に応じて調整できます。
2. 蓋とジャーの接合部とオートクレーブを覆うのに十分な量のアルミホイルを密閉瓶の上に置きます(121°Cで20分間)(図1B)。
3. 植物を移す準備ができるまで、準備した瓶に蓋をしておきます(表2)。

4.水耕栽培システムの準備:苗の追加

1. 苗木を瓶に移す準備ができたら(表2)、滅菌ベンチで瓶のアルミホイルと蓋を取り外します。
2. 瓶にバクテリアを接種する場合は、手順4.3に進む前に次の手順を実行します。それ以外の場合は、手順 4.2 をスキップします。
   1. 滅菌接種ループを使用して、寒天プレート上の純粋な細菌培養物から単一コロニーをピックし、750 μLの滅菌10 mM MgCl₂に懸濁します。溶液が濁るまで繰り返します。
   2. オプション:懸濁液を750 μLの滅菌10 mM MgCl₂ で1,000 × g および室温で5分間遠心分離して3回洗浄し、続いて上清を除去し、750 μLの10 mM MgCl₂でペレットを再懸濁します。
   3. オプション:複数の異なる細菌種を接種する場合は、先に進む前に、ステップ4.2.1〜4.2.2で調製した単一菌株の懸濁液を等しい比率で混合します。
   4. 0.5x MS培地(pH 5.7〜5.9、KOHで調整)または別の増殖培地(ステップ4.3を参照)で、波長600 nm(OD₆₀₀)での光学濃度を0.2〜0.4に調整します。_OD600 を再度測定し、溶液が正しく希釈されたかどうかを確認します。
      注意:KOHは腐食性です。手袋と白衣を着用してください。
   5. 懸濁液をさらに同じ培地でOD₆₀₀ 0.002-0.004に希釈します(1:100希釈)。
      注:最終的な細胞密度は、使用する細菌株によって異なりますが、私たちの経験では、この接種物は約3〜6〜10⁵ 細胞^mL-1×対応します。
   6. 瓶あたり35 mLの最終希釈液を加えます。35 mLの滅菌増殖培地をコントロールジャーに加えます。根が乾燥しないように、植物を移す前にビーズをかき混ぜて0.5倍のMS培地で均一にコーティングします。手順 4.4 に進みます。
3. 各瓶に 35 mL の 0.5x MS 培地を加えます(pH 5.7 〜 5.9、KOH で調整)。根が乾燥しないように、植物を移す前にビーズをかき混ぜて0.5倍のMS培地で均一にコーティングします。
   注:増殖培地は、例えば、栄養素の除去、塩ストレスを誘発するための浸透圧物質の添加、または異なるpH値または増殖培地の使用によって変更することができる。注意:KOHは腐食性です。手袋と白衣を着用してください。
4. ガラスビーズの間に根系を置いて、3〜5本の A.thaliana 植物を瓶に入れます。
   注:瓶あたりの植物の数は、他の種では異なります(表2)。
5. 滅菌鉗子またはスプーンでビーズを動かして根を覆い、葉を培地から持ち上げます(図1C)。
   注意: 根を壊したり、植物にストレスを与えたりしないように、植物とビーズを慎重に動かしてください。
6. ジャーの上部に1.25cmのマイクロポアテープを2枚貼り、蓋をそっと上に置きます(図1D-F)。
   注意: 空気交換を妨げないように、蓋を押し下げないでください。
7. 蓋とジャーの間の隙間を2.5cmのマイクロポアテープで覆い、空気交換を可能にしながら無菌性を維持し、ジャーを増殖チャンバーに入れます(図1G、H)。
8. 実験条件ごとに4〜8個の瓶を、生物学的な問題と予想される変動性に応じて設定します。
9. 実験系の代謝物の背景を説明するために、生物学的ネガティブコントロール(植物のない瓶など)を必ず含めてください。ネガティブコントロールには、実験的処理(例:四重化)と同じ反復数を設定します。
10. 増殖期間を延長する場合は、増殖培地を毎週交換します:残りの増殖培地を25 mLの容量式ピペットで取り出し、35 mLの新しい培地を加えます。

5.根の滲出液の収集

1. 植物が希望の年齢に達したら、滅菌ベンチの2.5cmのマイクロポアテープと蓋をはがします。
   注:私たちの成長条件における A.thaliana の場合、発芽後21日は開花開始前の成熟した栄養段階を表します。栄養発達の段階は植物種に固有であり、成長期間のタイミングは植物種によって異なります。このタイミングは、リサーチクエスチョンに応じて変更できます。
2. 無菌試験では、20 μLの増殖培地を分注し、LB寒天プレートにピペットで移します。
   1. 接種したジャーの場合、100 μLの増殖培地を分注して、コロニー形成ユニット(CFU)カウントに使用します(例:希釈系列²³)。
      注:私たちの経験では、細菌密度は増殖培地の10^{5-10 8} 生細胞^mL-1の範囲です。
3. 根の損傷を避けるために、25 mLの容量測定用ピペットでできるだけ多くの増殖培地を除去します。
4. 葉が濡れないように、瓶の壁に沿ってピペッティングして50 mLの収集培地(例:20 mM酢酸アンモニウム、HClで調整したpH 5.7-5.9)を加えます。蓋付きの瓶を閉じ、滲出液の収集の所望の時間、無菌状態でインキュベートします。時間的制約のある実験では、2 時間が適切な収集ウィンドウです。
   注意:HClは腐食性です。手袋と白衣を着用してください。根滲出液の収集時間が長い場合は、蓋をテープで再度包み、ジャーを成長チャンバーに移動します。
5. 2時間後、所望の量の収集培地をチューブに移します(例:濃縮滲出液を用いたアッセイまたは分析の場合は50 mL、直接使用の場合は2 mL)。採取した根滲出液は、さらなる処理または分析が行われるまで-80°Cで保存してください。
   1. 接種済みジャーを使用する場合は、採取した滲出液を5,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離し、分析には上清のみを使用します。あるいは、0.22 μmまたは0.45 μmのフィルターで滲出液をフィルター滅菌します。
6. 実験が時系列の一部である場合は、瓶から残りのすべての収集培地を取り除き、35 mL の 0.5 x MS 培地を追加します。瓶を成長チャンバーに戻す前に、蓋と2.5cmのテープを交換してください。
7. 根を測定し、1つの瓶にすべての植物の新しい重量を撃ち、後で根の滲出液を植物の重量で正規化します。
   注:必要に応じて、植物組織を追加でサンプリングできます。

6. 質量分析のための根滲出液の処理

1. 分析方法に応じて、根の滲出液を凍結乾燥して濃縮し、収集培地を除去します(液体がなくなるまで0.37 mbarで-80°C)。分析の準備が整うまで-80°Cで保存してください。
   注:ここに示すデータは、精密質量四重極飛行時間型装置でのフローインジェクション TOF-MS 分析で生成したものです。
2. 分析装置に注入する前に、凍結乾燥した滲出液を再構成するか、未処理の根滲出液を根の新鮮な重量に応じて収集培地で希釈します。
   注:収集媒体は、質量分析計と互換性があるように選択されました。ただし、分析方法によっては、注入前に脱塩ステップが必要になる場合があります。

ここで紹介する実験系は、根の滲出プロファイルを変化させる実験的および環境的要因の制御を可能にします。A . thaliana の生育を、異なる照明条件、植物の年齢、植物密度を2つの異なる実験室で比較しました(図3)。植物は実験室全体で健康に見えました(図3A、B)。短日条件(10時間光 vs 16時間光、 図3)では、長日条件と比較して根の質量が多くなりました(図3C、D)。同様に、長日条件で栽培されたすべての植物の総根量は、短日条件よりも小さかった(図3C)。全体として、瓶内および瓶間の増殖のばらつきは、実験室間で低かった。

ガラス瓶システムは、さまざまな植物種や発達段階に対応しています。根滲出液分析のエンドポイントは通常21日であり、実験条件では、多くの植物種は繁殖段階に移行する前に成熟した栄養段階にあります(図4A-E)。植物は、根系に目に見える損傷を与えることなく、実験システムから簡単に取り除くことができます。したがって、組織の重量を決定したり、下流の分析に組織を使用したりすることは簡単です。シュートの重さが最も高かったのは小麦で、次いでソルガムとトマトでした。根の重さが最も高かったのはソルガムで、次いで小麦とM. truncatulaでした。根とシュートの比率は種によって異なります。全体として、組織重量は100mgから800mgの間で変化した。

根滲出液の採取を可能にする実験システムの中心的な側面は、定義された環境で植物と微生物の相互作用を研究するための微生物の制御された接種です。提示された実験系は、繰り返し操作しても無菌状態を保つことができ( 図5の「コントロール」条件を参照)、バクテリアを添加して長期間維持することができます。33日齢の A. thaliana にOD600 0.004の共生細菌の混合物を接種したところ、細菌は実験の全期間である12日間持続しました(図5)。コロニー形成単位は、成長培地中で100倍に増加し、根にもコロニーを形成しました(図5C)。接種した植物の表現型は、不妊植物の表現型と区別がつかなかった(図5A、B)。

提示された実験システムは、多くの実験条件で滲出液の収集を可能にします。ここでは、酢酸アンモニウムまたは同じ植物から水中で連続して採取した A. thaliana Col-0 の滲出プロファイルを示します(図 6A)。滲出液は分析まで-80°Cで保存し、根元重量で正規化し、質量分析で分析しました。植物を含む瓶のサンプルを、実験対照(植物を含まない瓶)に対してろ過しました。2,163 の代謝物のうち、436 の代謝物はバックグラウンドより上のシグナルを示し(20.16%)、分析のために保持されました。これらのうち、416(95%)の化合物は、実験条件間で明確な存在量を示しました。しかし、26の代謝産物はいかなる種類の化合物にも起因することができず、したがって定義されていません。.ほとんどの代謝物(406または98%)は、水で採取された滲出液でより豊富でした。.最初に酢酸アンモニウムで、後で水中で滲出液を連続的に収集すると、代謝シグナルが時間の経過とともに希釈される可能性があるため、滲出液プロファイルに影響を与える可能性があります。しかし、第2の時点として採取された水中の滲出シグナルがほぼ独占的に高いことは、この仮説を支持しません:純水中での滲出液の収集は、植物に浸透圧ショックを引き起こす可能性が高く、増殖溶液と等モルの収集溶媒と比較して代謝物の存在量が増加します(20 mM酢酸アンモニウムは0.5倍MS培地に対して等モルです)。両方の増殖条件で同定された化合物の化学クラスを調査したところ、化合物の大部分は有機酸および誘導体(28.6%)であり、次いで有機酸素化合物(18%)、有機複素環式化合物(14.2%)、脂質(13.2%)であることが示されました。代謝産物のごく一部のみがフェニルプロパノイドとポリケチド(8.7%)およびベンゼノイド(6%)に属しています。.有機窒素化合物、ヌクレオシド、有機硫黄化合物、アルカロイド、リグナン、および関連化合物は、分類された化合物の2%から0.5%を占めています(図6B)。ここに描かれる代謝産物の分布は、他のタイプの根滲出液収集システム24を用いて既に公表されているデータに対応する。

図1:ガラス瓶のセットアップ。 (A)ガラスビーズの入った瓶。(B)オートクレーブ滅菌の準備ができているガラスビーズの入った瓶。(C)瓶の中の苗木(上面図)。(D)1.25cmのマイクロポアテープを貼った瓶(上面図)の中の苗。(E)1.25cmのマイクロポアテープを貼った瓶の中の苗木(側面図)。(F)1.25cmのミクロポアテープと蓋付きの瓶に入った苗木(側面図)。(G)1.25cmのマイクロポアテープ、蓋、および2.5cmのマイクロポアテープを備えた瓶(側面図)に苗木を入れた完全なジャーセットアップ。(H)ジャーのセットアップを完了します(上面図)。(I)生後21日で収穫の準備ができている植物(上面図)。ジャーサイズ:高さ147mm×直径100mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:0.5x MurashigeおよびSkoog培地寒天プレートの表面滅菌した苗木を、成長チャンバーで 。 (A) シロイヌナズ ナ(6日齢)、(B) Brachypodium distachyon (6日齢)、(C) Medicago truncatula (6日齢)、(D) A. thaliana (18日齢)。寒天プレートサイズ 120 mm x 120 mm. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:シ ロイヌナズ ナCol-0植物を瓶で短日光および長日光条件下で栽培。 (A)短日条件(10時間光/14時間暗、220μmol m-2 s-1 光強度、21°C昼/18°C夜)で栽培された33日齢の植物3本が入った瓶、および(B)長日条件(16時間明るい/8時間の暗時間、 150-160 μmol m-2 s-1 光強度、昼22°C/夜間18°C)。(C)1つの瓶のすべての植物と(D)単一の植物の根の重さ。** t検定の有意値(p < 0.05)を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:無菌ガラス瓶システムのセットアップにおける21日目の系統発生的に異なる5種。(A)モデル単子葉植物 Brachypodium distachyon、(B)モデルマメ科植物 Medicago truncatula、(C)ダイコット Solanum lycopersicum (トマト)、(D)ダイコ ットソルガムバイカラー、(E)単子葉植物 Triticum aestivum (コムギ)。(F)ガラス瓶で栽培された種の根と新芽の新鮮な重量。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:シ ロイヌナズナ Col-0(33日齢)を短日条件で増殖させたもの。 (A)無菌セットアップで、または(B)共生細菌のコンソーシアムを12日間接種します。(C)増殖基質(左)および根(右)の無菌(対照)および接種瓶用のコロニー形成ユニット。無菌対照条件ではN = 4瓶、接種条件ではn = 8瓶。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:21日齢の A. thaliana Col-0の明確な根滲出液プロファイル。 滲出液を滅菌 20 mM 酢酸アンモニウム(pH 5.7)で 2 時間回収し、続いて滅菌ろ過脱イオン水で 2 時間回収しました。代謝物は、直接注入を用いた質量分析によって検出しました。(A)バックグラウンドレベル以上で検出された 436 の代謝物の主成分分析(植物のある瓶と植物のない瓶の比較)。PC: 分散量が説明された主成分。青:水で採取した滲出液、黄色:酢酸アンモニウムで採取した滲出液。(B)実験条件(テューキー検定)で有意に異なる416の代謝物の円グラフを、スーパークラス(https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/)に従って色付けした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:複数種の表面種子滅菌方法。*エタノールと漂白剤の間と最後にろ過された脱イオン水で4〜5回洗浄します。漂白後3〜6時間インキュベートし、30分ごとにろ過された脱イオン水と交換します。

表2:さまざまな植物種の瓶に移すための苗木の年齢(日数)と瓶あたりの植物の数。

著者には開示すべき利益相反はありません。