意識のあるラットにおける鎖骨下静脈採血

Summary

ここでは、麻酔なしでラットの迅速、安全、反復採血を可能にする効果的なラット制限法と鎖骨下静脈穿刺法の組み合わせを紹介します。

Abstract

ラットから繰り返し血液サンプルを取得するための確立された方法はいくつかあり、最も一般的に採用されている方法は、麻酔なしの側尾静脈サンプリングと麻酔による頸静脈サンプリングです。しかし、これらの方法のほとんどは、補助具や麻酔器具を必要とし、採血や血液サンプルの質の悪さという点で困難を伴うことがあります。さらに、これらの採血方法は、多数のラットに対して採血を繰り返す必要がある場合、多大な時間と人的資源を消費します。この研究は、麻酔をかけていないラットで、熟練した 1 人の個人で繰り返し採血する技術を提示します。鎖骨下静脈に穴を開けることで、非常に満足のいく血液サンプルを得ることができます。この方法は、ラットの拘束から採血完了までの時間の中央値で、95%という驚異的な全体的な成功率を示しました。また、指定範囲内で連続採血を行っても、ラットに害を及ぼすことはありません。この方法は、特に大規模な薬物動態研究において、採血のために推進する価値があります。

Introduction

ラットは最も一般的な実験動物の1つであり、血液サンプルを取得する方法はたくさんあります。最終段階での1回の採血を含む実験では、心臓穿刺または腹部大^動脈採血によって十分な量の血液を得ることができます1。ただし、一部の研究では、特に薬物動態および毒物学の研究において、薬物の吸収、分布、および代謝を決定するために繰り返し採血する必要がある、定期的な血液分析または生化学的分析のためにラットからの繰り返しの採血が必要です²。

現在、ラットからの採血には尾静脈採血が最も一般的な方法であるが、麻酔を必要としないにもかかわらず、この方法は繰り返し採取が困難な場合があり、採取される血液の量は比較的少ない^3,4。また、伏在静脈や陰茎静脈から採血はできるが、得られる血液の量は限られており、麻酔が必要である^1,5。さらに、顎下静脈神経叢、舌下静脈、頸静脈、鎖骨下静脈から採取された血液サンプルは、より高品質のサンプルを提供しますが、通常、麻酔または複数の個人の支援が必要です1,6,7,8,9。最後に、眼窩後洞/運河採血は麻酔を必要とするだけでなく、ラットに傷害やストレスを与える可能性^{もある9。}

通常、主要な静脈から得られる血液サンプルの品質は、一般的に^{最高水準です}1。現在、いくつかの研究では、頸静脈を通る連続マイクロサンプリングがラットの毒物学的研究に非常に適した方法であることがわかりましたが、この方法は通常、頸静脈カテーテル検査を必要とします10,11,12。したがって、外科的介入なしに動物研究の3R原則に従って高品質の血液サンプルを取得する方法を探求する価値があります。本研究の目的は、ラットの鎖骨下静脈から効率的に血液を抽出する方法を提示することである。この技術により、麻酔を必要とせずに1人で満足のいくサンプルを迅速に採取することができます。

Protocol

この研究は、実験動物のケアと使用のためのガイドの第8版で概説されているガイドラインを順守しています¹³。この研究は、蘭州大学第二病院の倫理委員会から承認を受け、ARRIVEガイドライン2.0¹⁴に準拠して文書化されました。生後12〜16週齢の健康なWistarラット12匹(体重290〜330gの雄6匹と体重250〜280gの雌6匹)を、実際の実験の3日前に蘭州大学のGLP動物研究所に収容しました。使用したラットケージは、545mm×395mm×200mmのR5型で、オートクレーブ処理された寝具が備え付けられていました。すべてのラットには、餌と水の両方への無制限のアクセスが与えられました。実験室は平均湿度25%、平均気温24°C、昼と夜を交互に繰り返す光のサイクル(午前7:00/午後7:00)を維持しました。研究の結論として、すべての動物はイソフルランの過剰摂取を使用して人道的に安楽死させられました。この研究で使用した材料と機器に関する包括的な情報については、 材料表を参照してください。

1. サンプルサイズの計算と動物の選択

1. リソース方程式法¹⁵ を選択し、式(1)を使用して動物サンプルサイズを推定します。
   E = 動物の総数 − グループの総数 (1)
   ここで 、E は分散分析の自由度(ANOVA)で、範囲は10から20です。
   注:この研究では、12匹の動物を2つのグループ A と B に分けました(グループごとに3匹のオスと3匹のメス)。
2. この研究の主な結果は、1 人の個人による反復採血の成功率と時間消費として定義します。
3. 副次的評価項目を、ラットの体重、食物および水の摂取量、ならびに有害事象(鎖骨骨折、皮下血腫、気胸、死亡率など)の発生率の変化として定義する。
4. 採血の成功を次の基準を満たすものとして定義します:i)1回の採血で3回未満の穿刺。ii)合計時間(ラットの拘束から採血の完了まで)が5分を超えない。iii)透明な血漿を得ながら目標とする血液量を達成する。これらの基準からの逸脱は、サンプリングの失敗と見なします。

2.動物の拘束と採血

注:グループ A および B ラットの血液サンプルは、少なくとも100個の血液サンプルを採取した2人の経験豊富な研究者によって収集されました。血液サンプルは、4日間にわたって合計96回、両方のグループのラットから収集されました。この採血方法は、ラットに麻酔や追加の拘束装置を必要としません。ただし、熟練した取り扱い技術が必要です。

1. 採血前日(1日目)の午前8:00に、餌と水の重さを量る間、各ラットを個別のケージに割り当てます。次に、測定値を知らされていない別の研究者に、ラットの体重、食物消費量、および水分摂取量を1日目以降毎日午前8:00に記録してもらいます。
2. このプロトコルに従うには、まず毎日午前10:00に採血し、次に午後10:00に採血し、両側の鎖骨下静脈から交互に0.15 mLの血液を採取します。
   注:採血する血液の量は、最低体重のラットが1週間以内に耐えられる最大量によって決定されました。
3. シリンジをヘパリンナトリウム(25 U/mL)で洗浄し、注射部位をアルコールで消毒します。
4. ネズミの背中の皮膚を優しく撫でたり、首を繰り返しつまんだりして、ネズミがリラックスできるようにします(ビデオ1)。
5. 利き手ではない方の手の親指と人差し指を使って、ラットの首の皮膚をしっかりとつかみ、持ち上げます(図1A および ビデオ1)。
6. 利き手からの協調で、利き手でない方の手の残りの3本の指と手のひらを使ってラットの背中の皮膚を固定し、前肢を固定します(図1B、C、ビデオ2)。
   注意: ネズミが抵抗したり、もがいたりする場合は、この手順を数回繰り返して、ネズミが取り扱いに慣れるのを助けることができます。採血を成功させるには、次の手順が重要です。
7. 利き手ではない方の手の人差し指を使って、ラットの頭の皮膚をそっと押し下げ、他の指と手のひらで肩関節を外側に回転させます。この間、利き手を使ってラットの肩関節を完全に伸ばします(図1D-Fおよびビデオ2)。
8. 利き手ではない方の手でラットをしっかりと握り、ラットの頭と体を一直線に揃えます(図1G、H)。次に、利き手を使用して鎖骨の位置を特定し、穿刺部位を確認します(図1I、 ビデオ2、 およびビデオ3)。
   注:ラットを剃る必要はありません。 図1では、鎖骨と穿刺位置をより大きく見せるためだけにシェービングを行いました。ラット、特にラット>350gを拘束する場合、ラットを固い表面に足を乗せると、体重を支えるのに役立ちます。さらに、拘束具は、血液を採取しながら各ラットの呼吸数を監視して、拘束がきつすぎて呼吸困難を引き起こしないようにする必要があります。.
9. 利き手で注射器をラットの体と平行に持ち、針先を上向きにし、注射器の目盛りを実験者に向け、ラットの体の正中線に対して約15°の角度を維持します。鎖骨の切り欠きの0.5cm下(鎖骨と胸骨の近位3分の1の接合部)に針を挿入し、針がラットの体と平行になるようにします(図1J および ビデオ3)。
   注意: 血管に穴を開けたり、隣接する血管に不注意で損傷を与えたりしないように、針の挿入角度と深さに特に注意を払う必要があります。
10. シリンジを静かに少し引いて陰圧を作り、多くの場合、血管に入ったときに突破口の触知的な感覚を伴います(特に最初の採血中に顕著です)。.この位置を維持し、必要に応じて一定の速度で0.1〜1.0 mLの血液を採取します^(1週間あたり約4〜5.3 mL / kgの血液1のIACUCガイドラインに従います)(図1K および ビデオ3)。
11. 穿刺時に血液がない場合は、針の角度と深さを静かに調整するか、シリンジを静かに回転させてみてください(ビデオ3)。同じ側で3回連続して試みても失敗した場合は、すべての出血を止めてから、反対側に切り替えて穿刺します。
    注:ラットが不快感のために苦労するのを防ぐために、皮膚を素早く穿刺することをお勧めします。
12. 止血のために綿棒を塗布し、ラットをケージに戻します(ビデオ4)。
13. 実験要件に従って血液サンプルを処理します。

3.血液サンプル処理

1. シリンジ針は鋭利な容器に廃棄します。.採取した血液を、ヘパリンで洗い流した1.5 mLの微量遠心チューブに移します。チューブを遠心分離機に入れ、4°C、1,200 x gに設定し、10分間遠心分離してプラズマを分離します。1.0 mLのパスツールピペットを使用して血清を清潔な微量遠心チューブに移し、-80°Cで保存します。
   注意: 圧力による溶血を防ぐため、必要に応じて針先を取り外してください。血漿吸引中は、チューブの底から血球を採取しないでください。時折、注射器の表面にネズミの毛皮が集まることがあります。毛皮がチューブに入らないように注意してください。

4. 統計解析

1. すべてのデータを平均±標準偏差として提示し、分散の均一性を検定します。
2. フィッシャーの正確確率検定を使用して、グループ間の成功率を比較します。
3. 2標本の独立した t検定を使用して、2つのグループ間の全体の平均を比較します。
4. 分散分析(ANOVA)を使用して、採血時間、体重、食物摂取量、水消費量などの連続測定を行います。 P < 0.05 を統計的に有意であると考えてください。

Results

高品質のプラズマ試料は、 図2Aに示すように、淡黄色の色相、透明度、透明度を示し、赤みを帯びたり凝固したりすることはありません。 図2B は、不適切な処置の結果としての溶血(左側)または凝固(右側)をそれぞれ示しています。4日間に96回の採血セッションを行った場合、グループ A と B の平均採血時間は、それぞれ119.87±33.62秒、123.28±30.96秒でした。2群間の日次採血時間に有意差はなかった(t = 0.66、 P = 0.54、 表1)。最短の個人採血時間は、それぞれ78秒と89秒でした。.

1回の採血を成功させるのに必要な平均試行回数は、グループAで1.21回、Bグループで1.17回であった。2群間で試行回数に有意差はなかった(t...

Discussion

ラットでは、尾静脈採血が最も一般的な採血方法であるが、麻酔薬の影響を受ける可能性があり、尾静脈のサイズが小さいため、1回で採取できる血液量が限られ、採^血期間が長くなります^4,5。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-タンデム質量分析(MS/MS)システムとラット尾静脈のキャピラリーマイクロサンプリング(CMS)を組み合わせることで、ラットで使用される血液の量を減らすことができます¹¹が、すべての施設にこの高価な装置が装備されているわけではありません。球後神経叢/副鼻腔からの採血は、ラットに不安や痛みを引き起こすことが多く、不適切な操作はラットの視力と健康を損なうことさえあります。したがって、この方法はラット⁹の採血には推奨されない。

鎖骨下静脈は、ラットの大胸筋と三角筋の間に位置し、内鎖骨の3分の1で頸静脈に流れ込みます(図4<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75%生理食塩水	甘粛省Fuzheng製薬技術有限公司	——	調製したヘパリンナトリウム溶液
パスツールピペット 1mL	バイオシャープ	BS-XG-01-NS	採血
用シリンジ 1mL (26G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	採血
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	血液の保存と収集
75% 医療用アルコール	山東 Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	ラット採血場所の消毒
遠心分離機の管のホール	ダーBiosharp	BS-05/15-SM60	（mdash;—
電子スケール	上海PUCHUN測定器械Co.、株式会社	JE1002
パリンナトリウム注射	河北長山生化学薬品有限公司	——	シリンジとEPチューブをすすぎ、生理食塩水で25 U/mLに希釈します
低温遠心分離機	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	血清の分離