CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

Summary

CRISPR関連のプロトコルがますます有用で利用しやすくなるにつれて、特定の実験条件下では依然として合併症や障害が発生する可能性があります。このプロトコールでは、CRISPR/Cas9を使用した受容体相互作用セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK1/RIP1)ノックアウトヒト細胞株の作製を概説し、このプロセスで遭遇する可能性のある課題を強調しています。

Abstract

このプロトコールは、ヒト単球U937細胞株のCRISPR/Cas9を使用して RIP1 遺伝子をノックアウトする手順を概説しています。この方法では、指定されたガイドRNAプラスミドとレンチウイルスパッケージングプラスミドを利用して、RIP1遺伝子ノックアウトを達成します。このプロトコールは、従来のCRISPR法の課題と改善に対処し、将来の細胞死研究のための複製を可能にします。得られた変異細胞は、機能的なRIP1タンパク質が役割を果たす細胞死の機構的変化を調べるために使用できます。生存率アッセイでは、ネクロプトーシス導入後のノックアウト細胞における細胞死の有意な減少が示されました。蛍光顕微鏡法では、同じ条件下でノックアウト細胞のミトコンドリア活性酸素種(ROS)が著しく減少していることが明らかになりました。これらの機能アッセイを組み合わせることで、RIP1タンパク質の損失が確認されます。U937ヒト単球での使用に最適化されたこの手順は、他の主要な細胞死調節因子を標的とするようにも適応させることができ、機能的で非致死的な変異体をもたらします。潜在的な落とし穴は、ミュータント生成中に発生する可能性のある課題についての洞察を提供するために、全体を通して対処されます。

Introduction

CRISPR/Cas9遺伝子編集技術の利用は、その発見以来急速に進化しています^1,2,3。細胞株や細菌内の遺伝子をノックインまたはノックアウトする能力は、研究を進め、細胞内メカニズムを理解するために非常に貴重です1,2,3,4,5,6。CRISPR-Cas9システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などの従来の遺伝子編集法を改良し、遺伝子特異性のエンジニアリングを簡素化します。この手順には、目的の遺伝子ターゲットを見つけるために使用されるガイドRNA(gRNA)と、二本鎖^DNA切断3,4で目的のゲノム位置を変更するエンドヌクレアーゼであるCas9の2....

Protocol

この手順の概略図を 図 1 に示します。ガイドRNA(gRNA)と標的配列を表1に示します。試薬および使用した機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 大腸菌由来のCas9エンドヌクレアーゼとピューロマイシン耐性を含有するRIP1標的CRISPR gRNAレンチウイルス発現ベクターの採取

1. クオドラントストリーク大 腸菌 は、100 μg/mL アンピシリンを添加した LB 寒天プレート上に レンチウイルスベクター gRNA を抱いています。
2. プレートを37°Cで1〜2日間インキュベートし、プレートの最も希薄な領域に個々のコロニーが見えるようにします。
3. 滅菌ループのある単一のコロニーを選択し、各コロニーを100 μg/mLのアンピシリンを添加した5 mLのLBブロスを50 mLのコニカルチューブに個別に追加します。均質化を確実にするために、単一のコロニーを追加した後、完全に上下にピペットで移動するようにしてください。
4. 50 mLコニカルチューブのキャップをベントしてテープで留め、37°C、225 rpmのオービタルシェーカーで8時間インキュベートします。

Results

RIP1 CRISPR変異U937細胞のコンフルエント集団の作製に続いて、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット解析を使用して、RIP1タンパク質発現レベルの損失を評価することにより、RIP1 CRISPR変異細胞株の作製に成功しました。この決定は、WT U937単球とNTC細胞との比較結果に基づいて行われました。図2では、RIP1の発現は5 μg/mLのピューロマイシンRIP1 CRISPR変異体細胞では検出されませんでしたが、WT U937細胞とNTC細胞の両方で検出されました。この結果は、このプロトコルが生存可能なRIP1 CRISPR変異体を選択するための信頼性と効果的な方法であることを示しています。

RIP1 CRISPR変異体細胞におけるRIP1タンパク質発現の喪失が成功したことから、これがRIP1の機能的喪失にも等しいかどうかを判断しました。以前に確立された研究では、腫瘍壊死因子-α (.......

Discussion

このプロトコルは、レンチウイルストランスフェクションとRIP1ノックアウトU937細胞株を作成するための形質導入の効率と信頼性の潜在的な落とし穴について詳細な指示と分析を提供することを目的としています。このトランスフェクションおよび形質導入の方法は、手間と時間がかかりますが、一般に、選択したgRNAおよびCas9エンドヌクレアーゼをトランスフェクションが困難な^{細胞株8,9,20}に組み込む効率的な方法であると考えられています。U937細胞やその他の免疫細胞のような単球と同様に、トランスフェクションは外来核酸を認識して応答する先天的なセンサーを持っているため、トランスフェクションを行うことは本質的に困難です。これは、外来核酸に応答して、核酸の破壊/超突然変異、転写抑制、および/または細胞死につながる可能性があります²¹。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
調整済みDMEM媒体	ギブコ	11995-040
アンピシリン	シグマ	A1593
ビスベンズイミド Hoechst 33342 三塩酸塩	シグマ	B2261
完全なRPMI-1640ミディアム	シグマ	R6504
CRISPR NTC gRNA大腸菌株	トランスオミック	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA大腸菌株	トランスオミック	TEVH-1162203
エンドオーバーエンドローテーター	サーモサイエンティフィック
EVOS FL蛍光顕微鏡	ライフテクノロジー
GenEluteプラスミドMaxiprepキット	シグマ	PLX15
ヤギ抗ウサギIgG抗体、(H+L)HRP複合体	シグマ	AP307P
HEK293Tセル	ATCCの
インキュベーターシェーカー	ニューブランズウィックサイエンティフィック
LB寒天	BDの	244520
LBブロス	BDの	244610
LV-MAXレンチウイルス包装ミックス	ギブコ	A43237
MitoSOXレッド	メドケムエクスプレス	ハイ-D1055
NanoDrop分光光度計	サーモサイエンティフィック
ネクロスタチン-1	メドケムエクスプレス	HY-14622A
オプティMEM	ギブコ	31985-062
ピューロマイシン	シグマ	P7255
ウサギ抗ヒトRIP1 mAb	細胞シグナル伝達技術	3493
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット装置	バイオラッド
TNF-&アルファ;	メドケムエクスプレス	ハイ-P7058
U937ヒト単球	ATCCの
WST-1 細胞増殖アッセイシステム	タカラ	MK400
X-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬	ロシュ・ダイアグノスティックス	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIOの	A1902