QuEChERS 法およびガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析によるアボカド品種中の 45 種類の農薬の測定(英語)

Summary

本プロトコルでは、ギ酸アンモニウムを用いた Quick-E asy-Ch eap-Eeffective-R ugged-S afe (QuEChERS) 法と、続いてガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析を使用したアボカド品種の多クラス残留農薬の分析について説明します。

Abstract

ガスクロマトグラフィー(GC)タンデム質量分析(MS/MS)は、食品中の残留農薬のサーベイランスに広く採用されている卓越した分析装置です。それにもかかわらず、これらの方法はマトリックス効果(ME)に対して脆弱であり、分析種とマトリックスの特定の組み合わせによっては、正確な定量に影響を与える可能性があります。MEを軽減するためのさまざまな戦略の中で、マトリックスマッチドキャリブレーションは、その費用対効果と簡単な実装により、残留農薬アプリケーションにおける一般的なアプローチを表しています。この研究では、3種類のアボカド(Criollo、Hass、Lorena)について、ギ酸アンモニウムとGC-MS/MS、を用いたQuick-E asy-Cheap-E effective-R ugged-S afe(QuEChERS)法を用いて、合計45種類の代表的な農薬を分析しました。

この目的のために、5 g のアボカドサンプルを 10 mL のアセトニトリルで抽出し、さらに 2.5 g のギ酸アンモニウムを添加して相分離を誘導しました。その後、上清は、150 mgの無水MgSO₄、50 mgの第一級-第二級アミン、50 mgのオクタデシルシラン、10 mgの黒鉛化カーボンブラック、および60 mgの酸化ジルコニウムベースの吸着剤(Z-Sep +)を使用した分散型固相抽出によるクリーンアッププロセスを受けました。GC-MS/MS 分析は 25 分未満で成功裏に実行されました。この分析法の性能を評価するために、厳密な検証実験を実施しました。アボカドの各品種のマトリックスマッチド検量線を検討したところ、ほとんどの農薬/品種の組み合わせで、MEは比較的一貫しており、20%未満(ソフトMEと見なされる)であることが明らかになりました。さらに、この分析法の定量限界は、3 種類のいずれの品種でも 5 μg/kg 未満でした。最後に、ほとんどの農薬の回収率は70〜120%の許容範囲内に収まり、相対標準偏差値は20%未満でした。

Introduction

化学分析では、マトリックス効果(ME)はさまざまな方法で定義できますが、広く受け入れられている一般的な定義は次のとおりです:これは、シグナルの変化、特に特定の分析物の分析中にサンプルマトリックスまたはその一部が存在する場合の検量線の傾きの変化を指します。重要な側面として、MEは、ターゲット分析物¹の定量測定の精度に直接影響するため、分析法の検証プロセス中に徹底的な調査が必要です。理想的には、サンプルの前処理手順は、サンプルマトリックスから成分が抽出されないように十分に選択的であるべきです。しかし、多大な努力にもかかわらず、これらのマトリックスコンポーネントの多くは、ほとんどの場合、最終決定システムに収められています。その結果、このようなマトリックス部品は、多くの場合、回復率と精度の値を損ない、追加のノイズを導入し、メソッドに関連する全体的なコストと労力を増加させます。

ガスクロマトグラフィー(GC)では、MEはGCシステム内に活性部位が存在するために発生し、さまざまなメカニズムを通じて標的分析種と相互作用します。一方では、マトリックス成分は、標的分析種と相互作用するこれらの活性部位をブロックまたはマスクし、その結果、シグナルが頻繁に増強されます²。一方、遮るものがないままの活性部位は、強い相互作用によりピークテーリングや分析種分解を引き起こし、MEがマイナスになる可能性があります。ただし、これは特定の場合に潜在的な利点を提供する可能性があります²。GCシステムで完全な不活性を達成することは、非常に不活性なコンポーネントを使用し、適切なメンテナンスを行っているにもかかわらず、非常に困難であることを強調することが重要です。連続して使用すると、GCシステム内のマトリックス成分の蓄積がより顕著になり、MEが増加します。今日では、酸素、窒素、リン、硫黄などの元素を含む分析種は、これらの活性部位と容易に相互作用するため、より大きなMEを示すことが広く認識されています。一方、炭化水素や有機ハロゲンなどの高安定な化合物は、このような相互作用を起こさず、分析中にMEを観察することはない^2,3。

全体として、MEを完全に排除することはできず、マトリックス成分を完全に除去することが不可能な場合、補償または修正のためのいくつかの戦略が開発されます。これらの戦略の中で、重水素化内部標準(IS)、分析種保護剤、マトリックスマッチドキャリブレーション、標準添加法、または注入技術の改良の利用が科学文献1,2,4,5で文書化されています。SANTE/11312/2021ガイドラインでも、これらの戦略が推奨されています⁶。

MEを補償するためのマトリックスマッチドキャリブレーションの適用に関しては、実際の状況でのサンプル配列には、さまざまな種類の食品や同じ商品からのさまざまなサンプルが含まれます。この場合、同じ商品からの任意のサンプルを使用すると、すべてのサンプルのMEが効果的に補償されると仮定されます。しかし、既存の文献には、この問題を具体的に調査する十分な研究が不足しています⁷。

かなりの割合の脂肪と色素を含むマトリックス中の農薬の多成分残留物の測定は、困難な作業です。大量の共抽出物質は、抽出効率に大きく影響し、その後のクロマトグラフィー測定に支障をきたし、カラム、イオン源、検出器を損傷する可能性があり、その結果、大量のME8,9,10が生じる可能性があります。その結果、このようなマトリックス中の微量レベルの農薬の分析では、高い回収率を確保しながら、分析前にマトリックス成分を大幅に削減する必要があります⁷。高い回収率を得ることは、農薬分析の信頼性と正確性を維持し、規制基準に準拠するために重要です。これは、農業および関連分野での食品の安全性、環境保護、および情報に基づいた意思決定を確保するために不可欠です。

アボカドは、世界中の熱帯および地中海性気候で栽培され、その原産地と多数の輸出市場の両方で広く消費されている高い商業的価値を持つ果物です。分析的な観点から、アボカドは、ナッツ類に類似したかなりの数の脂肪酸(すなわち、オレイン酸、パルミチン酸、およびリノール酸)、緑の葉のような有意な色素含有量、ならびに他の果実に見られるものと同様の糖および有機酸を含む複雑なマトリックスである¹¹。その脂肪分の多い性質のため、分析方法を採用する際には特別な注意を払う必要があります。残留農薬分析は、GC-MSを使用してアボカドに対して実施されているものもあります^{が、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20}の場合、他のマトリックスと比較して比較的頻度が低くなっています。ほとんどの場合、Quick-E asy-Ch eap-Eeffectective-R ugged-S afe (QuEChERS) 法のバージョンが適用されています 8,12,13,14,15,16,17,18.これらの研究のいずれも、異なるアボカド品種間のMEの一貫性を調査していません。

したがって、この研究の目的は、ギ酸アンモニウムと GC-MS/MS を用いた QuEChERS メソッドを使用して、異なる種類のアボカド(クリオロ、ハス、ロレーナなど)にわたる 45 種類の代表的な農薬の ME と回収率の一貫性を研究することでした。私たちの知る限り、このような脂肪マトリックスサンプルでこの種の研究が行われたのはこれが初めてです。

Protocol

1.ストックと作業溶液の準備

注:安全上の理由から、プロトコル全体を通してニトリル手袋、実験室用コート、および安全メガネを着用することをお勧めします。

1. 45種類の市販農薬標準試料( 材料表を参照)のそれぞれについて、アセトニトリル中濃度10 mLメスフラスコに約1,000 mg/Lの個々のストック溶液を調製します。
2. 上記の個々のストック溶液を組み合わせて、25 mLメスフラスコにアセトニトリル中の400 mg/Lストック溶液を調製します。
   注:この混合溶液は、回収およびキャリブレーション実験用の作業溶液を準備するために使用されます。
3. アセトニトリル中のアセトニトリルにそれぞれ750 mg/Lおよび1,050 mg/Lの濃度のアトラジン-d₅ およびリン酸トリフェニル(TPP)のストック溶液を調製します。アトラジン-d₅ を手続き型内部標準(P-IS)として、TPPを注射用内部標準(I-IS)として利用します。
   注:理想的なシナリオは、特定のターゲット分析物ごとに同位体標識された内部標準を利用することです。
4. 10 mLメスフラスコに0.05%(v/v)ギ酸(劣化防止用)を含有するアセトニトリル溶液を調製すると、農薬で10、100、400 μg/kgのサンプル相当量、P-ISで200 μg/kgのサンプル相当量が得られます。これらの溶液を琥珀色のガラスバイアルに入れ、-20°Cの暗所で保存してください。
5. 農薬とP-ISのキャリブレーション溶液をアセトニトリルに溶かし、0.05%(v/v)のギ酸を10 mLメスフラスコに溶かして調製すると、それぞれ5、10、25、75、200、400、600 μg/kg、200 ng/ngが得られ、-20°Cの暗闇で琥珀色のガラスバイアルに保管します。
   注:実験作業全体で同じ溶液を使用できますが、各使用直後に指定された条件下で保管することが不可欠です。
6. アセトニトリルと水の比率が 4/1(v/v)のアセトニトリルとギ酸 0.5%(v/v)の比率で、100 g/L の 3-エトキシ-1,2-プロパンジオール、10 g/L の L-γ-ラクトン、10 g/L の D-ソルビトール、および 5 g/L のシキミ酸を含む分析種保護剤の混合物を調製します。
   注:この分析物保護剤の混合物は、MEを軽減するために注射の直前に追加されます。.

2.サンプル収集

1. スーパーマーケットで入手可能な3種類のアボカド(クリオロ、ハス、ロレーナなど)からサンプルを収集します。各サンプルの重量が約1kgであり、これはその後のすべての研究を実施するのに十分であり、指令2002/63/CE²¹と一致していることを確認してください。
   注:残留農薬の存在の可能性を最小限に抑えるために、有機サンプルを優先的に選択しました。
2. 収集したアボカドサンプルを実験室に輸送し、チョッパーを使用してパイプなしで個別に均質化します( 材料の表を参照)。均質化したサンプルは、分析まで4°Cの琥珀色のガラス容器に保管します。
   注: 同じアボカド サンプルが研究全体で使用されます。したがって、使用するたびに指定された条件下で保管することが重要です。

3. ギ酸アンモニウムを用いたQuEChERS法によるサンプル調製

注: 図 1 は、ギ酸アンモニウムを使用した QuEChERS メソッドの概略図を示しています。

1. 50 mLの遠心分離チューブで各アボカドサンプル5 gを秤量します( 材料の表を参照)。
2. P-IS溶液50μLを添加すると、濃度は200μg/kgになります。回収率評価のために、ステップ1.4で調製した農薬溶液も添加して、収率10、100、および400μg/kg(各n = 5)にします。
3. チューブを30秒間ボルテックスして、スパイクがサンプルに完全に統合されるようにします。
4. 10 mLのアセトニトリルを遠心分離チューブに加えます。チューブを70rpmで5分間振とうします。
5. 2.5 gのギ酸アンモニウムを加え、チューブを再び70 rpmで5分間振とうし、続いて1,800 × g で5分間遠心分離します。
6. 150 mg の無水 MgSO₄、50 mg の第一級-第二級アミン(PSA)、50 mg のオクタデシルシラン(C₁₈)、10 mg のグラファイト化カーボンブラック(GCB)、および 60 mg の酸化ジルコニウムベースの吸着剤 Z-Sep+ を含む 2 mL の遠心分離チューブに、1 mL の抽出物を加えて、分散型固相抽出(d-SPE)を利用した精製を行います。チューブを30秒間ボルテックスし、1,800 × g で5分間遠心分離します。
7. 抽出物200 μLをオートサンプラーバイアルに移し、ステップ1.6で調製した分析種保護剤溶液20 μLを加え、TPP溶液50 μLを含めます。
8. GC-MS/MS システムを使用して機器分析を実行します(セクション 4 を参照)。
9. 上記と同じ手順に従って、ブランク抽出物を使用してマトリックスマッチドキャリブレーションを実行しますが、d-SPEステップ(ステップ3.6)では、15 mLチューブ内の上清5 mLを洗浄します。ステップ3.7でスパイク溶液とP-IS溶液を追加します。オートサンプラーバイアルにキャリブレーション標準溶液を添加すると、TPPとともに5、10、25、50、100、200、400、および600 μg/kgが得られ、最終容量は270 μLになります。
   注:全体として、各アボカド品種のマトリックスマッチド検量線とアセトニトリルのみのキャリブレーションを必ず作成してください。

4. GC-MS/MS を用いた機器分析

1. 電子イオン化界面(-70 eV)とオートサンプラーを備えたトリプル四重極(TQ)を備えたGC-MS/MS システムを使用して分析を行います( 材料表を参照)。
2. キャリアガスにMSのGCカラム(長さ30m、内径0.25mm、膜厚0.25μmのシリカボンド)と超高純度 のヘリウム を 1.2mL/minの一定流量で採用します。
3. 機器の操作を続行する前に、次のパラメータを確認してください。
   1. ガス圧が正しいことを確認します: ヘリウム は 140 psi 、 アルゴン は 65 psiです。
   2. ロータリーポンプオイルの状態をチェックして、透明で適切なレベルにあることを確認します。
   3. 注射シリンジに以前の注射による障害物がないことを確認してください。
   4. 洗浄バイアルに各溶媒が十分な量含まれていることを確認してください。
   5. 消耗品カウンター(セプタム、ライナー)が制限に達していないことを確認してください。
4. フロントパネルにあるメインGCスイッチをオンにし、背面にあるMSスイッチをオンにします。
5. GC-MS/MS システムのすべてのパラメータを制御する GCMS リアルタイム解析ソフトウェアを開きます。
   注:装置システムには、デフォルトでGCMSリアルタイム解析ソフトウェアが含まれています。
6. 「バキュームコントロール」をクリックします。アドバンスト |真空システムを開始するためのロータリーポンプ1。
   注意: このウィンドウでは、圧力を監視して、最適な真空値(9.0 Pa未満)を決定します。所要時間は約12時間です。
7. [開始]をクリックして、ターボ分子ポンプ1とターボ分子ポンプ2をオンにします。
8. [Ion Source Heater] オプションの [Start] をクリックします。
   注意: 推奨時間を1時間後に、システムの真空度をチェックして、推奨値が1.6e-3Pa未満であることを確認します。
9. MS 界面温度 を 250 °C に、 イオン源温度 を 300 °C に設定します。
10. GCオーブンを初期温度50°Cで1分間維持し、その後、25°C/分の速度で180°Cまで上昇させます。その後、温度を5°C/minで230°Cに上げ、次に25°C/minで290°Cに上げます。最後に、温度を290°Cで6分間一定に保ちます。合計解析時間は24.6分です。
11. これらのシステムがすべてオンになったら、[ 閉じる ]をクリックします。
12. 分析ソフトウェアの 「Tuning 」オプションをクリックし、「 Peak Monitor View 」をクリックして、質量分析計の条件の初期検証を行います。
    メモ: 必要に応じて、自動チューニングを実行します。
13. 「Acquisition」をクリックし、表示されたウィンドウで「Download Initial Parameters」をクリックします。機器がGCおよびMSの準備ができていることを確認します。

5. データ取得

1. ソフトウェアから [New Batch File ]をクリックし、サンプル名、サンプル ID、メソッドファイル、データファイル、注入量、チューニングファイルなどの情報を含むシーケンスを作成します。必要に応じて行を追加し、[ 保存]をクリックします。
2. [Batch Start] をクリックして、インジェクション プロセスを開始します。
3. スプリットレスモードで250°Cで注入を行い、注入量を1 μLに保ちます。注射後1分後、スプリットを開きます。
   注:注入の合間には、10 μLシリンジをメタノール、酢酸エチル、アセトニトリルで洗浄し、各溶媒で1回のすすぎを行ってください。すべての注射はトリプリケートで行われます。
4. TQを備えたMS/MSシステムで採用されている標準モードであるマルチプルリアクションモニタリング(MRM) モードを使用して、分析物を分析します。
   注: 表1 は、マルチクラス農薬、P-IS、およびI-ISの保持時間(分単位)と定量子および修飾子の遷移を示しています。定量分析は、定量イオンのピーク面積とP-ISイオンの比に依存します。I-ISは、注入時の品質管理に使用されます。 補足ファイル 1 には、分析した 45 種類の農薬すべてのクロマトグラムが含まれています。
5. Postrun Analysisソフトウェアを開いてデータ解析を行います。
   注:装置システムには、デフォルトでGCMS Postrun Analysisソフトウェアが含まれています。
6. 分析する注入をクリックし、分析種を含むテーブルをナビゲートして、目的のピークを選択します。
7. ピークまたは関心領域をクリックして、クロマトグラムを視覚化します。ピーク積分を確認し、必要に応じて手動積分を実行します。すべての分析種の面積を検証して、必要な計算と分析法評価を行います。

Results

分析法の包括的なバリデーションは、SANTE/11312/2021 ガイドライン⁶ に従って実施され、直線性、ME、回収率、再現性の評価が含まれていました。

直線性評価のために、複数の濃度レベル(5 〜 600 μg/kg の範囲)でスパイクブランクサンプルを使用して、マトリックスマッチド検量線を作成しました。選択した農薬のほとんどの測定係数(R²)は0.99以上であることが判明し、濃度と反応の間に非常に線形の関係があることを示しています。5μg/kgの最低校正レベル(LCL)を選択し、食品モニタリング目的で確立された最大残留限界(MRL)である10μg/kgを順守しました²²。

MEを評価するために、マルチクラス農薬の検量線の傾きを純溶媒とマトリックスマッチドキャリブレーション条件で比較しました。例として、 図 2 は、溶媒中の曲線とカルボフランの ...

Discussion

マトリックスマッチドキャリブレーションに関連する主な制限は、キャリブレーション標準としてブランクサンプルを使用することから生じます。これにより、分析用に処理するサンプルの数が増え、各分析シーケンスでのマトリックス成分の注入が増加し、機器のメンテナンス要求が高くなる可能性があります。それにもかかわらず、この戦略は、各サンプルの検量線を実行する必要があるため、注入するサンプルの数がはるかに多くなる標準添加よりも適しています。したがって、どちらの場合も、費用対効果が高く、迅速で、信頼性を維持しながら、このような共抽出を最小限に抑えるサンプル調製技術を使用する必要があります。これに関連して、QuEChERS法は、アボカドサンプル^{8、12、13、14、15、16}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-エトキシ-1,2-プロパンジオール	Sigma Aldrich	260428-1G
アセトニトリル	メルク	1006652500
ギ酸アンモニウム	Sigma Aldrich	156264-1KG
AOAC 20i/s オートサンプラー	島津製作所	221-723115-58
自動加振機 MX-T6-PRO	SCILOGEX	8.23222E+11
天秤	OHAUS	PA224
遠心チューブ、15 mL	ネスト	601002
遠心チューブ、2 mL	Eppendorf	4610-1815
遠心チューブ、50 mL	ネスト	602002
遠心分離機 Z206A	MERMLE	6019500118
Choper 2L	オスター	2114111
カラム SH-RXI-5SIL MS、30m x 0.25 mm、0.25 µm	島津	221-75954-30	MS GCコラム
ディスペンス5-50 mL		4600361
DSC-18	Sigma Aldrich	52600-U
D-ソルビトール	Sigma Aldrich	240850-5G
酢酸エチル	Merk	1313181212
GCMS-TQ8040	島津	製作所 211552
グラファイトカーボンブラック	Sigma Aldrich	57210-U
注射器	島津	LC2213461800
L-ギュロン酸 γ;-ラクトン	Sigma Aldrich	310301-5G
Linner splitless	島津製作所	221-4887-02
マグネシウム硫酸マグネシウム無水物	Σ Aldrich	M7506-2KG
メタノール	Panreac	131091.12.12
Milli-Q超純水(タイプ1)ミリ	ポア	F4H4783518
ピペットチップ10-100&マイクロ;L	Biologix	200010
ペットチップ100-1000 µL	ブランド	541287
ピペットチップ20-200µL	ブランド	732028
ピペット パスツール	NORMAX	5426023
ピペット トランスファーペット S variabel 10 - 100 & micro;L	ブランド	704774
ピペットトランスファーペットSバリアベル100-1000µL	ブランド	704780
ピペット トランスファーペット S バリアベル 20 - 200 & マイクロ;L	SCILOGEX	7.12111E+11
第一級-第二級アミン	Sigma Aldrich	52738-U
シキミ酸	Sigma Aldrich	S5375-1G
シリンジフィルター PTFE/L 25 mm, 0.45 & マイクロ;m	NORMAX	FE2545I
リン酸トリフェニル (QC)	Sigma Aldrich	241288-50G
融合インサート付きバイアル	Sigma Aldrich	29398-U
Z-SEP+	Sigma Aldrich	55299-U	酸化ジルコニウムベースの吸着剤
農薬			CAS 登録番号
4,4´-DDD	Sigma Aldrich	35486-250MG	72-54-8
4,4´-DDE	Sigma Aldrich	35487-100MG	72-55-9
4,4´-DDT	Sigma Aldrich	31041-100MG	50-29-3
Alachlor	Sigma Aldrich	45316-250MG	15972-60-8
Aldrin	Sigma Aldrich	3666-25MG	309-00-2
アトラジン	シグマ アルドリッチ	45330-250MG-R	1912-24-9
アトラジン-d5 (IS)	シグマ アルドリッチ	34053-10MG-R	163165-75-1
ブプロフェジン	シグマ アルドリッチ	37886-100MG	69327-76-0
カルボフラン	シグマ アルドリッチ	32056-250-MG	1563-66-2
クロルプロファム	シグマ アルドリッチ	45393-250MG	101-21-3
クロルピリホス	シグマ アルドリッチ	45395-100MG	2921-88-2
クロルピリホスメチル	シグマ アルドリッチ	45396-250MG	5598-13-0
デルタメトリン	シグマ アルドリッチ	45423-250MG	52918-63-5
ジクロラン	シグマ アルドリッチ	45435-250MG	99-30-9
ジクロルボス	シグマ アルドリッチ	45441-250MG	62-73-7
ディルドリン	シグマ アルドリッチ	33491-100MG-R	60-57-1
ジフェニルアミン	シグマ アルドリッチ	45456-250MG	122-39-4
エンドスルファン A	シグマ アルドリッチ	32015-250MG	115-29-7
エンドリン	シグマ アルドリッチ	32014-250MG	72-20-8
EPN	シグマ アルドリッチ	36503-100MG	2104-64-5
エスフェンバレレート	シグマ アルドリッチ	46277-100MG	66230-04-4
エチオン	シグマ アルドリッチ	45477-250MG	563-12-2
フェナミフォス	シグマ アルドリッチ	45483-250MG	22224-92-6
フェニトロチオン	シグマ アルドリッチ	45487-250MG	122-14-5
フェンチオン	シグマ アルドリッチ	36552-250MG	55-38-9
フェンバレート	シグマ アルドリッチ	45495-250MG	51630-58-1
HCB	Sigma Aldrich	45522-250MG	118-74-1
Iprodione	Sigma Aldrich	36132-100MG	36734-19-7
Lindane	Sigma Aldrich	45548-250MG	58-89-9
Malathion	Sigma Aldrich	36143-100MG	121-75-5
Metalaxyl	Sigma Aldrich	32012-100MG	57837-19-1
Methidathion	Sigma Aldrich	36158-100MG	950-37-8
Myclobutanil	Sigma Aldrich	34360-100MG	88671-89-0
Oxyfluorfen	Sigma Aldrich	35031-100MG	42874-03-3
Parathion-methyl	Sigma Aldrich	36187-100MG	298-00-0
Penconazol	Sigma Aldrich	36189-100MG	66246-88-6
ピリミホスメチル	シグマ Aldrich	32058-250MG	29232-93-7
プロピコナゾール	Sigma Aldrich	45642-250MG	60207-90-1
Propoxur	Sigma Aldrich	45644-250MG	114-26-1
プロピザミド	Sigma Aldrich	45645-250MG	23850-58-5
ピリプロキシフェン	Sigma Aldrich	34174-100MG	95737-68-1
Tolclofos-メチル	Σ Aldrich	31209-250MG	5701804-9
Triadimefon	Σ Aldrich	45693-250MG	43121-43-3
Triflumizole	Σ Σ Aldrich	32611-100MG	68694-11-1
α-HCH	Sigma Aldrich	33377-50MG	319-86-8
β-HCH	Σ Aldrich	33376-100MG	319*85-7