静的バリア組織モデルを動的微生理学的システムに変換する

血管バリアは、血液区画を周囲の組織から分離する重要なインターフェースとして機能します。それらは、免疫細胞を引き付け、分子透過性を制御し、組織への病原体の侵入を防ぐことにより、恒常性を維持する上で重要な役割を果たします^1,2。in vitro培養モデルは、in vivo微小環境を模倣して開発されており、健康な状態と病気の状態の両方でバリア特性に影響を与える要因と条件の体系的な調査を可能にしています^3,4。

このような培養モデルに最も広く用いられているアプローチは、多孔質のトラックエッチングされた培養膜が培地で満たされた区画を分離する、トランズウェルのような「オープンウェル」構成⁵である(図1A)。このフォーマットでは、膜の両側に細胞を播種することができ、幅広い実験プロトコルが開発されています。しかし、これらのシステムは、バリアの成熟をサポートし、in vivoで見られる免疫細胞の循環を模倣するために不可欠な流体の流れを提供する能力に限界があります^5,6。したがって、薬物投与量、機械的刺激、または流体誘起せん断応力^6,7,8を導入する動的流れを必要とする研究には使用できません。

オープンウェルシステムの限界を克服するために、多孔質培養膜と個別にアドレス指定可能な流路を組み合わせたマイクロ流体プラットフォームが開発されました⁹。これらのプラットホームは、流体ルーティング、灌流、化合物の導入、制御されたせん断刺激、および動的細胞^{添加機能7,10,11,12,13}を正確に制御します。マイクロ流体プラットフォームが提供する高度な機能にもかかわらず、複雑なマイクロ流体プロトコルと確立された実験ワークフローとの互換性がないため、バイオサイエンスラボでは広く採用されていません^4,10,14。

これらの技術間のギャップを埋めるために、磁気的に再構成可能なモジュールベースのシステムを採用したプロトコルを紹介します。このシステムは、実験の特定のニーズに基づいて、オープンウェルモードとマイクロ流体モードを簡単に切り替えることができます。このプラットフォームは、厚さ100 nmの培養膜(ナノメンブレン)を備えたm-μSiM(シリコン膜によって実現されるモジュール式微生理学的システム)として知られるオープンウェルデバイスを備えています。このナノメンブレンは、図1Bに示すように、高い空隙率(15%)とガラスのような透明性を備えています。上部コンパートメントを下部チャネルから物理的に分離し、生理学的長さスケール¹⁵を横断する分子輸送を可能にします。明視野イメージングで生細胞をイメージングする際に既知の課題がある従来のトラックエッチングメンブレンとは異なり、ナノメンブレンの良好な光学的および物理的特性により、メンブレン表面の両側の細胞を鮮明に可視化できます15,16,17。

本プロトコルは、特殊な播種およびフローモジュールの製造の概要を説明し、プラットフォームの磁気再構成を説明します。これは、静的および動的条件下で内皮バリアを確立するためにプラットフォームをどのように使用できるかを示しています。この実証により、内皮細胞が流れ方向に沿って整列し、せん断刺激下でせん断感受性遺伝子標的がアップレギュレーションされることが明らかになりました。

このデザインは、実験要件やエンド・ユーザーの好みに応じて、さまざまなモードで使用できます。各実験の前に、 図 2 に示す決定フローチャートを参照して、プロトコルに必要な手順とモジュールを決定してください。例えば、ユーザーが実験全体を通してオープンウェルフォーマットを維持し、トランズウェルタイプのシステムと直接比較しようとする場合、細胞播種にパターニングステンシルは必要ありません。コアモジュールは市販されており( 材料表を参照)、極薄ナノメンブレンは、実験のニーズに合わせて、空隙率と細孔径の異なる材料のライブラリから選択できます。

1. パターニングステンシルの作製

注:パターニングステンシルは、メンブレンチップの多孔質領域にのみ細胞を配置し、フローモジュールを追加した後に細胞が損傷を受ける可能性のある周囲のシリコン層に細胞が沈殿するのを防ぎます¹⁶ ( 図3を参照)。単分子膜の損傷は、バリアの完全性に悪影響を及ぼし、実験結果を損なう可能性があります。ステンシルは、損傷のリスクがないため、オープンで静的な培養では不要です。

1. Supplementary Coding File 1(図4A)で提供されている設計を使用して、金型を購入、機械加工、または3Dプリントします。
   注:ステンシル壁は、高アスペクト比の直線壁機能と比較して、メディア容量を増やし、気泡の閉じ込めを最小限に抑えるためにテーパー状になっています。
2. 3.2mmのアクリル板に130μmの粘着剤(PSA)フィルムをコールドローラーで貼り付けます( 材料表参照)。
3. 補足コーディングファイル2に示されている設計に従ってアクリル板をレーザーカットし、空洞の配列を作成します(図4B)。
4. PSAフィルムから保護層をはがし、アクリル板を型に貼り付けます。
   注意: レーザーカットされたシートが金型と位置合わせされ、金型の特徴がキャビティの中央に配置されるようにします(図4C)。メンブレン上での細胞の位置決めの精度は、このステップに依存します。
5. PDMSプレポリマーを完全に混合し(塩基と触媒の比率が10:1を使用)( 材料表を参照)、目に見える気泡が残らなくなるまで真空チャンバー内で脱気します(5〜15分)。
6. PDMSを金型キャビティにゆっくりと流し込み、平らなエッジで水平にします。
   メモ: 気泡の巻き込みを防ぐため、PDMS を各キャビティにゆっくりと流し込んでください。注湯後に気泡がある場合は、金型を真空チャンバーに入れ、再度脱気してください。
7. ホットプレート上で70°Cで1時間硬化させた後、室温まで冷却します。
8. 先端が平らなピンセットを使用して金型キャビティからステンシルを取り出します。

2. フローモジュールの製作

注:フローモジュールは、コアモジュールのクローバー形状のウェルと同様のフットプリントを共有し、成形されたマイクロチャネル(幅 = 1.5 mm、高さ = 0.2 mm、長さ = 5 mm)が含まれています。クローバーの形状は、多孔質培養領域上のチャネルの位置合わせに役立ちます(図5)。

1. 標準的なソフトリソグラフィー技術¹⁸ を使用して、 補足コーディングファイル3 (図4D)で提供されている設計によって定義された特徴を持つシリコンモールドを作成します。
2. 厚さ3.2mmのアクリル板に130μmのPSAフィルムを貼ります。
3. 補足コーディングファイル4に示された設計に基づいてアクリル板をレーザーカットし、クローバー状の空洞の配列を作成しました(図4E)。
   注意: キャビティの高さはフローモジュールの高さを決定し、適切なシーリングを確保するために、コアモジュールウェルの高さよりもわずかに(0〜0.1 mm)高くする必要があります。
4. PSAフィルムから保護層を剥がし、シリコンモールドの三角形のアライメントマークをレーザーカットシートのアライメントマークに合わせ、レーザーカットシートをシリコンモールドに貼り付けます。
   注意: ステップ1.4と同様に、レーザーカットされたアクリルシートがシリコンモールドと位置合わせされ、モールドの特徴が各キャビティ内の中央に配置されていることを確認します(図4F)。このステップでは、フットプリントに対するマイクロチャネルの位置を決定します。
5. 脱気したPDMSを金型キャビティにゆっくりと流し込み、平らなエッジで水平にします。
   注意: 注ぐ後に気泡が存在する場合は、気泡が除去されるまで金型のガスを抜きます。
6. 金型をホットプレートに置き、PDMSを70°Cで1時間焼成した後、金型を室温まで冷却します。
7. 先端が平らなピンセットを使用して、金型キャビティからフローモジュールを慎重に取り外します。
8. マイクロチャネルフィーチャーが上を向くようにフローモジュールの向きを調整し、生検パンチを使用してチャネルの端にコアの入口と出口のポートを配置します( 材料表を参照)。

3. 下部および上部アクリルハウジングの製作

注意: コアモジュールは下部ハウジングに収まります。ハウジングに埋め込まれた磁石間の引力により、フローモジュールが圧縮され、コアモジュールに密閉されます(図6)。

1. 補足コーディングファイル5に記載されているデザインを使用して2mmのアクリル板をレーザーカットし、磁石挿入用の穴のある上部ハウジングを作成します。
2. 3.5mmのアクリル板に130μmのPSAフィルムを貼り付けます。
3. 補足コーディングファイル6のデザインに基づいてアクリル板をレーザーカットし、磁石挿入用の穴のある下部ハウジングを作成します。
   注意: 下部ハウジングの厚さは重要なパラメータであり、フロー中の漏れを防ぐためにコアモジュールの全体的な厚さと一致する必要があります。
4. PSA保護層をはがし、下部ハウジングをガラスカバーガラスに取り付けます。
5. 4.75mmニッケルメッキネオジム磁石( 材料表を参照)をハウジングのレーザーカット穴に圧入します。
   注意: 磁気吸引を確保するために、下部と上部のハウジングの磁石が反対極性で配置されていることを確認してください(図6)。

4. フロー回路の製作

注:クローズドループフロー回路には、リザーバーとして2つのサンプル収集バイアルが含まれています(図7)。インレットリザーバーにはポリフッ化ビニリデン(PVDF)フィルターがあり、細胞培地をインキュベーター内の_CO2 濃度と平衡化させます。

1. 1mmの生検パンチを使用して、サンプル採取バイアルのキャップに2つの穴を開けます。
2. 生検パンチを使用して、別のサンプル採取バイアルのキャップに2つの穴(1mmと4mm)を作成し、このバイアルの下部に1mmの穴を作成します。
3. 20 Gのディスペンシングチップを1 mmの穴のそれぞれに挿入し、ホットグルーで密封します。
4. 0.22 μmのPVDFフィルター( 材料表を参照)を4 mmの穴に入れ、ホットグルーで密封します。
5. 1.5mmのアクリル板を、 Supplementary Coding File 7 に示されているデザインでレーザーカットし、サンプル保持ステージを作成します。
6. リザーバーをアクリルステージに配置します。
7. マイクロフローチューブを使用してディスペンシングチップを接続します( 材料表を参照)。
8. 21 Gのディスペンスチップを使用して、チューブをフローモジュールの入口と出口に接続します。
9. 蠕動ポンプ( 材料表を参照)を流動循環に利用します。
   注:必要に応じて、シリンジまたは空気圧ポンプを使用して流量を導入することもできます。流量は、実験の必要性に基づいて決定する必要があります。実験的に検証されたCOMSOLモデルから導出された包括的な表が補足 表1 に示されており、セル単層¹⁶で所望のせん断応力を達成するために必要な流量を選択する際にユーザーを支援する。

5. 細胞播種

注:従来のメンブレンインサートと同様に、ナノメンブレン上で異なる種類の細胞を培養することができます。二次細胞型は、底流路¹⁵における膜の反対側で共培養することもできる。

1. メンブレンを5 μg/cm² のフィブロネクチン( 材料表を参照)で室温で1時間コーティングし、細胞接着を改善します。
   注:選択したセルタイプは、必要なコーティングとセル密度に影響を与える可能性があります。ここで説明する手順は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC、 材料表を参照)用です。
2. P200ピペットを使用してコーティング液を吸引し、コアモジュールウェルにパターニングステンシルを配置します。
3. セルメディアをデバイスのウェルと下部チャネルに追加します。
4. HUVECを40,000細胞/^cm2 の密度でウェルに播種します。
   注:この密度のHUVECは、通常、24時間のインキュベーション後にコンフルエント単層を形成します^16,19。
5. デバイスをペトリ皿に入れます。15 mLのコニカルチューブキャップを純水でペトリ皿に加え、局所的な湿度を維持します。
6. ペトリ皿をインキュベーターに移します。
   注意: デバイスの上部ウェルと下部チャネルのセルメディアは、24時間ごとに交換する必要があります。一番下のチャネルのメディアを交換するには、新しいメディアをポートの1つにそっと挿入して、古いメディアを他のポートから取り替えます。

6. マイクロ流体モードへの再構成

1. 上部ハウジング、下部ハウジング、フローモジュール、リザーバー、チューブ、およびディスペンシングチップを、組み立て前にUV滅菌チャンバーに30分間置いて滅菌します。70%エタノールを循環させ、次に無菌PBSをフロー回路に循環させます。
2. リザーバーとチューブに内皮細胞増殖培地を充填します( 材料表を参照)。
3. 下部ハウジングをサンプルステージに置きます。オープンウェルコアモジュールを下部ハウジングに挿入します。
4. モジュールのウェルから細胞培地を吸引します。フローモジュールをウェルに置きます。
5. 上部ハウジングを配置して、フローモジュールをコアモジュールにしっかりと密閉します。インレットとアウトレットのディスペンスチップをフローモジュールポートに接続します。
6. 蠕動ポンプを始動して、システムに流体の流れを導入します。

7. フロー導入後のオープンウェル形式での下流分析の実施

注:ここでの培養時間は、実験の目的によって異なります。ダウンストリーム解析(免疫細胞化学、RNA抽出など)は、好みに応じてオープンウェルまたはマイクロ流体フォーマットで行うことができます。例えば、オープンウェルフォーマットが望ましい場合は、標準プロトコル^16,19に基づいてアッセイを行うようにシステムを再構成する必要があります。

1. せん断流曝露の所望の時間に達したら、ポンプを停止します。インレットとアウトレットのディスペンスチップを取り外します。
2. 上部ハウジングを取り外します。ピンセットを使用して、フローモジュールをウェルからそっと取り外します。
3. 100 μLの細胞培地をウェルに加えます。標準プロトコルに基づいて所望のアッセイを実施します。

オープンウェルコアモジュールは、図6Aに示すように、下部ハウジングとカバーガラスによって作成された特定のキャビティ内に最初に配置されます。続いて、マイクロチャネルとアクセスポートを含むフローモジュールがコアモジュールのウェルに挿入されます。フローモジュールは、図6Bに示すように、下部ハウジングと上部ハウジングに埋め込まれた磁石間の磁気吸引力により、膜のシリコン支持層に対してしっかりと密閉されます。この磁気ラッチ機構の有効性を評価するために、破裂圧力試験を実施し、システムが最大38.8 ± 2.4 kPaの行き止まり圧力に耐えることができることを実証しました。この圧力耐性は、細胞培養アプリケーションで遭遇する一般的な動作圧力を大幅に上回っています。さらに、培養領域16における74ダイン/cm2のせん断応力に相当する最大4000μL/minの流速にさらされても、システムは漏れのない状態を保ちます。

オープンウェルモードとマイクロ流体モードを切り替えることができるプラットホームを開発する場合、細胞播種アプローチを慎重に検討しなければならないが、これは、従来の静的なオープンウェルプラットホーム16では典型的には問題ではない。チャネル境界周辺の単層の損傷は、実験結果に合併症をもたらす可能性があります20。この問題に対処するために、コアモジュールのオープンウェル内に収まり、細胞が膜表面に優先的に沈降するための特定のウィンドウを提供する取り外し可能なステンシルが設計されました(図3)。細胞単層がパターニングされ、コンフルエントに達すると、ユーザーはオープンウェルフォーマットで実験を継続するか、プラットフォームをマイクロ流体モードに再構成して細胞単層を生理学的せん断応力にさらすかを柔軟に行うことができます(図3)。磁気ラッチ機構により、必要に応じてオープンウェルとマイクロ流体フォーマットを簡単に切り替えることができます。例えば、フロー刺激後にデバイスをオープンウェルフォーマットに戻すことができるため、標準的な実験プロトコルを使用してさまざまなアッセイ(免疫染色、RNA抽出、分子透過性測定など)を柔軟に実施できます15,16。

人体の生理学的設定では、血管バリアは流れによって引き起こされるせん断応力にさらされ、バリアの構造と機能に影響を与える重要な生物物理学的手がかりとして機能します5,21,22。したがって、微生理学的システムにおける流体の流れの追加は重要な要件です。プラットホームの汎用性を実証するために、標準プロトコルを使用してオープンウェルフォーマットでHUVEC単分子膜を確立しました。24 時間の静置培養後、プラットフォームをマイクロ流体モードに再構成し、細胞単層を 10.7 dynes/cm2 のせん断応力に 24 時間さらしました。その結果、フロー下で培養した細胞はフロー方向に沿って整列し、フローなしで培養した細胞はランダムに配向していることが示されました(図8A、B)。せん断刺激後、プラットホームをオープンウェルフォーマットに再構成し、標準プロトコルを使用してRNAを抽出しました。その結果、細胞をせん断応力に曝露すると、健康な血管において抗血栓機能やアテローム保護機能などの重要な役割を果たすクルッペル様因子2(KLF2)と内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)がアップレギュレーションされることが示されました23,24(図8C)。

図1: in vitro 血管バリアモデルの比較。 (A)従来のトランズウェル様インサートと(B)オープンウェルm-μSiMの概略図。コンフルエントHUVEC単分子膜の明視野画像は、トラックエッチングされたメンブレンと極薄ナノメンブレンの明視野イメージング品質の違いを浮き彫りにしています。スケールバー = 100 μm。Mansouri et al.16より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:意思決定フローチャート 実験のニーズと下流の分析設定に基づくフローチャート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:プラットフォームの実験ワークフロー。 (A)多孔質膜上に細胞を直接配置するために、取り外し可能なパターニングステンシルをコアモジュールのウェルに挿入する(挿入図はパターン化された細胞を示し、黄色の線はマイクロチャネル境界を示す)。(B)ステンシルは、静的細胞培養用の装置内に保持または取り外すことができる。(C)プラットフォームをマイクロ流体モードに再構成するには、ステンシルをフローモジュールに置き換えます。磁気シール機構により、構成はリバーシブルです。ハウジングとフローモジュールを取り外して、オープンウェルモードに切り替えることができます。スケールバー = 200 μm。Mansouri et al.16より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:金型の概略図。 (A)孔版型。(B)レーザーカットされたアクリル板。(c)孔版金型の組立図。(D)フローモジュール金型。(E)レーザーカットされたアクリル板。(F)フローモジュール金型の組立図。三角形の特徴は、アクリル板を金型に取り付けやすくするためのアライメントマークです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:クローバー形状のフローモジュールの概略図。 (A)フローモジュールとメンブレンチップとの接触界面。流体の流れの入口ポートと出口ポートはピンク色で示されています。(B)PDMSフローモジュールの3D画像。Mansouri et al.16より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:デバイス再構成用の磁気アセンブリ。 (A)デバイスをマイクロ流体モードに再構成するためのコンポーネントの概略図。極が逆向きに埋め込まれた磁石は、シーリングの引力を誘発します。(b)血管チャネルをピンク色で、組織区画を緑色で示す再構成されたデバイスの断面図。Mansouri et al.16より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:フロー回路の組み立て図。 この回路は、蠕動ポンプ、セル媒体を供給し、変動を減衰させるための2つのリザーバー、チューブ、およびコンポーネントを所定の位置に保持するためのアクリルステージで構成されています。Mansouri et al.16より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図8:オープンウェルモードとマイクロ流体モードで培養したHUVECの比較。 細胞を播種し、オープンウェルで24時間培養して、コンフルエント単層を確立しました。その後の24時間の間に、1組のデバイスをマイクロ流体モードに再構成しました。(A)フロー(10.7 dynes.cm-2 shear stress)で培養した細胞をフロー方向に沿って整列させたもの(挿入図は細胞のアクチンと核をそれぞれ緑と青で示しています)。(B)オープンウェルフォーマットでフローなしで培養した細胞は、アライメントを示さなかった。レーダープロットの棒の長さは、対応する方向のセルの数を示します。(C)フロー下で培養した細胞は、非フロー条件と比較してKLF2およびeNOS遺伝子のアップレギュレーションが高かった(**p < 0.01、n = 3、平均± SD)。スケールバー = 100 μm。Mansouri et al.16より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足表1:異なる流量でのナノメンブレン表面のせん断応力。 この表は、さまざまな流量におけるナノメンブレン表面のせん断応力値に関する情報を提供します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:孔版金型のCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル2:孔版金型のレーザーカットキャビティのCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル3:フローモジュールのCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル4:フローモジュール金型のレーザーカットキャビティのCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル5:上部ハウジングのCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル6:下部ハウジングのCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル7:アクリルステージのCADモデル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

J.L.M.はSiMPore, Inc.の共同設立者であり、同社の株式を保有しています。SiMPoreは、本研究で用いた膜を含む極薄シリコンベースの技術を商品化しています。