方法論記事

超高速液体クロマトグラフィー-質量分析と漢方薬成分の自己確立データベース分析

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DOI：

10.3791/66091

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2023年11月3日

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1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, 2General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

高山ノコギリソウハーブ、 Achillea millefolium L.、 漢方薬の複雑な成分を分離して認識するために適用できる一般的なプロトコルと体系的なデザインについて説明します。

要約

漢方薬は複雑で、未知の化合物が多数存在するため、定性的な研究が重要になります。超高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型質量分析(UPLC-Q-TOF-MS)は、化合物の定性分析において最も広く使用されている方法です。このメソッドには、サンプルの前処理、MS チューニング、MS 取得、およびデータ処理のための標準化およびプログラムされたプロトコルが含まれています。サンプルの前処理には、収集、粉砕、溶媒抽出、超音波、遠心分離、およびろ過が含まれます。データの後処理については、データのインポート、自己確立済みのデータベース構築、メソッドの確立、データ処理、およびその他の手動操作を含む詳細に説明されています。高山ノコギリソウハーブの地上部である Achillea millefolium L. は、炎症、胃腸障害、および痛みの治療に使用され、その3-オキサ-グアイアノライドは抗炎症薬開発の有用な手がかりとなる可能性があります。AML中の3つの代表的な化合物が同定され、TOF-MSと自己確立したデータベースが組み合わされました。さらに、既存の文献との違い、液相パラメータの最適化、スキャンモードの選択、イオン源の適合性、衝突エネルギーの調整、異性体のスクリーニング、メソッドの制限、および可能な解決策について議論しました。この標準化された分析法は普遍的であり、漢方薬の複雑な化合物の同定に適用できます。

概要

中国医学は世界で最も豊かな経験的知識を蓄積してきました1。伝統的な漢方薬における化学成分の定性分析は、研究2の重要なトピックとなっています。漢方薬の化学的違いを区別することは、カテゴリーの複雑さと起源の多様化のために困難です3。漢方薬の主な化合物タイプには、アルカロイド、サポニン、フラボノイド、アントラキノン、テルペノイド、クマリン、リグナン、多糖類、ポリペプチド、およびタンパク質が含まれます1。しかし、化合物の分離や異性体の同定は、漢方薬の質的研究の発展を妨げています。

超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)と適切なクロマトグラフィーカラムの組み合わせは、漢方薬における複合化合物の分離を強力にサポートします4。近年、高分解能質量分析は、漢方薬の質的分析においてますます人気が高まっています。一般的に使用される高分解能質量分析法には、四重極飛行時間型質量分析法(Q-TOF-MS)5、orbitrap質量分析法(Orbitrap-MS)6、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析法(FT-ICR-MS)7などがあります。FT-ICR-MSは最高の分解能を備えていますが、高価な運用および保守コスト8を伴います。Orbitrap-MSは、特に分子量が500 Da9未満の低分子化合物の検出に優れています。Q-TOF-MS は、血清薬理化学10,11 の定性分析において最も広く使用されている分析法です。従来のネットワークデータベースや商用データベースと比較して、データ処理のための自己確立データベースとの共同分析がますます普及しています。

高山ノコギリソウハーブ、 Achillea millefolium L. (AML)は、漢方薬の一種で、主に新疆ウイグル自治区、内モンゴル自治区、および中国東北部で育ちます12。AMLの地上部は、炎症、胃腸障害、およびリウマ痛、歯痛、腹痛などの痛みの治療に広く使用されています13。AML由来の3-オキサ-グアヤノリドは、抗炎症薬開発のリードとして大きな可能性を秘めています14。AMLの化学成分に関する現在の研究は、セスキテルペン、モノテルペン、フラボノイド、およびフェノール化合物に焦点を当てています15。しかし、AML中の化合物の同定には、他の漢方薬に使用できる体系的な定性的誘導スキームはありません。この研究は、Q-TOF-MSと自己確立したデータベース分析を組み合わせることで、漢方薬の化学成分の標準化された同定を提供することを目的としています。

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プロトコル

1.サンプル前処理

  1. 漢方薬AMLコレクション
    1. 2月に高山ノコギリソウハーブ、 Achillea millefolium L. (AML)の種子を地面に植えます。同年7月にAMLの地上部を回収します(図1A)。
      注:この論文で使用したAMLは、中国四川省綿陽市の標高400mの山岳地帯で収集されました。
  2. 乾燥処理
    1. 集めたAMLをすべて純水で洗い流し、沈殿物や不純物を取り除きます。AMLを50°Cのオーブンで24時間乾燥させます(図1B)。
  3. パウダーの準備
    1. 乾燥後、AMLを高速多機能破砕機で粗粉に粉砕します。粉末を50メッシュのふるいに通します(図1C)。
  4. 溶媒抽出
    1. 正確に秤量したAMLサンプル1 gを、30 mLの75%エタノール水溶液(図2A)を入れた円錐形フラスコに入れます。
    2. 混合物を超音波浴超音波装置で25°Cで30分間抽出します(図2B)。
    3. サンプルを 14,000 × g で 5 分間遠心分離します(図 2C)。
    4. 注射シリンジに微多孔質メンブレンフィルター(0.22 μm、有機物のみ)を取り付け、上清を2 mLのサンプルボトルにろ過します(図2D)。

2.MSチューン

  1. LC-MS 制御ソフトウェアを起動します(図 3A)。MS tuneモジュールを開き、1 ng/μLのロイシン脳(LE)溶液を2回パージします。
  2. LockSpray Flow Controlパネルで、流量を50 μL/minに設定し、[Flow]ボタンをクリックしてLE溶液を質量分析計に送ります(図3B)。
  3. LockSpray Source Setupボタンをクリックして、ポジティブモードでのMSチューニングを完了します(図3C)。マイナスのアイコンをクリックして、イオンモードを切り替えます。LockSpray Source Setup(ロックスプレーソースセットアップ)ボタンをクリックして、ネガティブモードでのMSチューニングを完了します。

3. MS取得

  1. ファイル名、MSメソッド、インレットファイル、バイアル、容量などのシーケンステーブルを設定します。「保存」ボタンをクリックして、シーケンステーブルを記録します。
  2. [Run]ボタンと[Start]ボタンを順番にクリックします(図3D)。[サンプル データのみ取得] オプションを選択します。OKボタンをクリックして、データ取得を開始します。
  3. [Chromatogram]ボタンをクリックすると、リアルタイムのトータルイオンクロマトグラム(TIC)ウィンドウが開きます(図 3E)。「Display」ボタンと「TIC」ボタンを順番にクリックします。[BPI Chromatogram]オプションを選択し、[OK]ボタンをクリックしてベースピーククロマトグラム(BPI)ウィンドウを表示します(図 3F)。

4. データ処理

  1. データ分析ソフトウェアを起動します。
  2. [ My Work ]ボタンと[ Import MassLynx Data ]ボタンを順番にクリックして、子ウィンドウに入ります(図 4A)。生データファイルを選択し、サンプルセット名を入力し、[ Create UNIFI Sample Set ]ボタンをクリックしてMSスペクトルの生データをインポートします。
    注: 正と負の生データが別々にインポートされていることを確認してください。
  3. データベースの確立
    1. 初期ウィンドウの[ Administration ]ボタンをクリックします(図4B)。 「Import library items 」ボタンをクリックします。.xlsx形式のデータベーステンプレートファイルを選択し、すべての分離された化合物構造を.mol形式で同じフォルダに含めます。
    2. データベースの名前を入力します。 [Verify ]ボタンをクリックして、すべてのコンパウンドが表示されていることを確認します。 「インポート 」ボタンをクリックして、自己確立データベースのビルドを完了します。
      注:データベースにインポートする必要がある独立した.mol形式のファイル内のすべての化合物は、文献参照に基づいて調製されます。複合構造ファイルは、描画ソフトを使用して自分で描画します。
  4. [解析方法の作成] ボタンをクリックして、子ウィンドウを開きます。「Generate a process only method」ボタンをクリックして、データ処理方法を確立します。
  5. データ分析
    1. 「分析の作成」ボタンをクリックして、子ウィンドウを開きます。
    2. [既存のデータから分析を作成]ボタンをクリックし、インポートしたデータと確立された方法を選択します。
    3. [処理]ボタンをクリックして、長いデータ計算を開始します(図4D)。
    4. 「Investigate」ボタンをクリックして、TICウィンドウに切り替えます。
    5. [Select traces] ボタンをクリックし、TOF MSE BPI を選択します。[Replace all] ボタンをクリックして、BPI を表示します。
  6. 右クリックして [Add column] オプション [Add column] オプション [Display compound information] (化合物名、自然質量、観測 m/z、質量誤差、観測保持時間 (RT)、検出器カウント、レスポンス、付加体、代替割り当て、検出されたフラグメントの総数など、化合物情報を表示します (図 4E)。
  7. High-energy fragmentsオプションを選択して、選択した化合物の二次マススペクトルフラグメントを表示します(図 4F)。
  8. 各二次フラグメントに従って分子切断経路を手動で描画します(図4G)。
    注:例は、代表的な結果のセクションで詳しく説明されています。

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結果

代表的な結果を表示するためのモデルとしてアルプスのノコギリソウハーブを使用しました。 図4Gに示すように、m/z=463.08935のケルセチン-3'-O-グルコシドは、加水分解反応中にヘキソース分子が失われることにより、m/z=300.02828の中間体に変化しました。別の経路では、フラボノイド構造骨格のC-C結合の切断により、m / z = 223.06232の中間体が形成され、ヘキソースユニットのヒドロキシメチルと隣接するヒドロキシが消失しました。さらに、ヘキソース骨格の開裂により、m/z = 71.01498 の中間体が得られました。フェノール酸の場合、m / z = 515.11923の3,5-ジカフェオイルキニン酸は、加水分解反応を介してC9H6O3 またはC18H12O7 基を失い、それぞれm / z = 353.08783または173.04579の中間体を形成する可能性があります(図4H

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ディスカッション

高分解能質量分析と自社で確立されたデータベースを組み合わせることで、漢方薬の化学成分を同定するための体系的な定性技術が得られます。一般的な伝統的な漢方薬を含む商用データベースとは異なり、文献で報告された化合物を使用する自己確立済みのデータベースは、希少な医学または民族医学の分析においてより正確である16。同様の方法は、最終医薬品17、染料18、プラスチック包装19など、他の研究分野にも適用されている。一般的な商用データベースマッチングと比較して、珍しい伝統的な漢方薬の化合物を同定する能力が大幅に向上しています。同定された3つの化合物は、報告された文献と一致していますが、二次フラグメントイオンとフラグメンテーションパターンについては、今後さらに詳しくご案内します。

TOF-MSでは、マイナスイオンモードは、フラボノイドやアントラ...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国ポスドク科学基金会(2022MD713780)、免疫疾患のTCM治療の継承およびイノベーションチーム、重慶医学科学研究プロジェクト(重慶衛生委員会と科学技術局の共同プロジェクト)(2022DBXM007)、および重慶自然科学基金会(cstc2018jcyjAX0370)によって資金提供されました。重慶科学研究所の業績インセンティブと指導のための特別プロジェクト(cstc2022jxjl120005、cstc2021jxjl130021)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クロロホルムSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
酢酸エチルChuandongChemicalCAS 141-78-6
液体クロマトグラフWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS 制御ソフトウェア
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-ブチルアルコールChuandongChemicalCAS 71-36-3
石油エーテルChuandongChemicalCAS 8032-32-4
四重極飛行時間型質量分析WatersSYNAPT XS
UNIFIWatersデータ解析ソフトウェア

参考文献

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
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