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方法論記事

反復性虚血による冠状動脈側副成長のマウスモデル

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DOI:

10.3791/66127

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2025年5月9日

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medical Sciences, Northeast Ohio Medical University, 2Department of Biological Sciences, Kent State University, 3College of Medicine, University of Arizona, Phoenix

この記事について

サマリー

この論文では、マウスの反復性虚血によって誘発される出生後の冠状動脈側副成長を研究する方法を紹介します。これには、左前下行動脈への空気圧閉塞器の外科的移植、反復性虚血プロトコルの自動拡張システム、および側副成長を評価するための潜在的な方法が含まれます。

要約

冠状動脈側副血行路は虚血性心疾患(IHD)の自然なバイパスであるため、長年にわたり、冠状動脈側副成長(CCG)は、特にCCGが損なわれている2型糖尿病またはメタボリックシンドロームの患者において、IHDの有望な治療標的でした。しかし、このプロセスは、ブタ、イヌ、ラットなどの他の動物モデルが確立されているにもかかわらず、CCGのマウスモデルが不足していることもあって、十分に研究されていません。マウスモデルは、系統追跡や遺伝子調節(過剰発現またはノックアウト)など、種で利用可能な多くの遺伝的修飾を利用して、関与する経路や細胞タイプを含むCCGのプロセスとメカニズムを解明できます。したがって、私たちは、一過性を介して反復性虚血(RI)によって誘発されるCCGのマウスモデルの開発に着手しました。 左前下行動脈(LAD)の反復閉塞。この原稿では、LADに空気圧オクルーダーを埋め込むRI手術、圧力とインフレーションのタイミングを制御するために使用される自動圧力ベースのインフレーションシステム、RIプロトコルのシーケンスなど、このマウスCCGモデルの詳細を提供します。この方法は、RIによって誘発されるCCGのプロセスを解明するための1つの出版物をすでに作成しており、発芽血管新生が成体マウスの心臓のCCGに成熟した冠状動脈を生じさせることを示しています。

概要

虚血性心疾患(IHD)は、米国における主要な死亡原因であり、この病気を治療するために年間200,000件以上の冠動脈バイパス手術が行われています1。冠状動脈側副血行路、冠状動脈樹の枝の間の吻合は、閉塞2の下流の虚血組織に血液を再供給できる自然なバイパスです。しかし、人々は、ネイティブの担保ネットワーク3,4の範囲に幅広いばらつきを示します。IHDの患者さんで、冠動脈の側副治療が広範囲に及んでいるほど、心筋梗塞の縮小や死亡率の低下など、心イベント時の転帰が良好です。したがって、冠状動脈側副成長(CCG)は10年以上にわたって治療標的となっています5,6,7。これは、冠状動脈の側副成が不十分なメタボリックシンドローム8の患者数が増えていること9にとって特に興味深いものです。しかし、CCGのプロセスとメカニズムがより深く理解されるまで、IHDの治療のためにCCGを誘導する試みは実を結ぶ可能性は低いです。

冠状動脈側副血行路は大動物モデルで研究されており、ブタ10、イヌ11、およびラット12においてCCGを誘導するために、主要な冠状動脈の短時間の反復閉塞が用いられている。しかし、CCGのマウスモデルは、系統追跡、遺伝子特異的または細胞特異的なトランスジェニックおよびノックアウトラインなど、多くの遺伝子改変マウス系統が容易に利用できるため、CCGの分子的および細胞的メカニズムを研究する上でより多くの利点があります。興味深いことに、ヒトとは異なり、マウスは天然の冠状副血行子を持たないと報告されており13,14、冠状動脈の側副形成を研究するための魅力的なモデルとなっています。実際、最近の報告によると、閉塞性動脈疾患の患者では、ほぼ半数(47%)が傍側血統を持っていませんでした（レントロップグレード0）3;したがって、CCGのマウスモデルは、ネイティブの側副血行が最小限の患者に臨床的に関連性がある可能性があります。

そこで、反復性虚血によって誘発されるCCGのマウスモデルを開発し、タイマーで自動化された圧力ベースのインフレーションシステムを使用して、左前下行動脈(LAD)上のインフレータブルバルーンオクルーダーを開発しました。反復性虚血プロトコルは、最近の出版物14に示されているように、側副成長を刺激することができます。このCCGのマウスモデルは、細胞および分子レベルでのCCGのプロセスに関する新たな洞察を提供し、CCGを促進するための潜在的な標的を検証するために使用できます。

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プロトコル

記載されている動物実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施され、ノースイーストオハイオ医科大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.手術の準備

注:RIプロトコルには、体重が25g以上の雌雄のC57BL/6マウスを使用してください。手術全体を通して無菌技術を使用します。

  1. セットアップ
    1. オートクレーブまたはビーズ滅菌器ですべてのツールを滅菌します。オクルーダー、テザー、PEチューブなどのデリケートな材料やインプラントをエチレンオキシド(EtO)で滅菌します。
    2. 手術部位を70%エタノールで拭いて清掃します。滅菌ドレープにすべてのツールと消耗品をレイアウトして、エリアを準備します。消耗品の完全なリストについては、 材料の表 を参照してください。
  2. マウス挿管
    1. 立ち直反射が失われるまで、3%イソフルランと酸素(1 L / minの流量)でマウスに短時間麻酔をかけます。.胸部、背中の中央、右耳の後ろを剃ります。抜け毛を完全に取り除きます。グリコピロレートを0.01〜0.02 mg / kgで筋肉内に注入します。.
    2. 3%-4%イソフルランで5分間再度麻酔します。マウスを仰臥位に置き、上切歯から拘束し、鈍い鉗子を使用して舌を脇に動かします。光ファイバーライトと拡大喉頭鏡を使用して、20G血管カテーテルでマウスにすばやく挿管します。
    3. マウスの仰臥位を保温手術用パッドに置き、挿管チューブを3%イソフルランを含む小動物の人工呼吸器に接続します。リズミカルな両側の胸部上昇をチェックして、挿管を確認します。足の指のつま先つまみ反応の欠如により、適切な麻酔の深さを確認します。
  3. 術野の準備
    1. 眼科用軟膏を目に塗布して乾燥を防ぎます。
    2. 剃った部分をベタジンできれいにし、次に70%エタノールで、一方向に一度拭きます。
    3. サージカルパッドの心電図(EKG)接点に電極クリームを塗布し、マウスの手足をそれらにテープで貼り付けます。マウスの下半分に滅菌ガーゼを掛けます。
    4. 手術中の呼吸数、体温、麻酔の深さを、サージカルパッドのソフトウェアインターフェースを使用して監視します。
  4. 左開胸術とオクルーダー移植術
    1. イソフルランを2%に減らします。.はさみを使用して胸の皮膚に2〜3cmの正中線切開を行い、次に湾曲した鉗子を使用して、胸の左側の皮膚と筋肉の層を穏やかに分離します(図1A)。
    2. 鈍い鉗子を使用して、胸壁にそっと開口部を作り、通常は3番目 と5番目の 肋間骨の間に心臓を露出させます。
    3. リトラクターを使って肋骨をやさしく広げ、心臓を視覚化します。鈍い鉗子を使用して、心膜を引き裂いて心臓を露出させます。左耳介(図1B)を特定し、可能であれば左前下行動脈(LAD)の基底部分を視覚化します。
    4. 8-0をパスLADの下の心筋を通るポリプロピレン縫合糸。
      注:入口と出口の間の距離は、オクルーダーの幅とほぼ等しく、LADに対して垂直である必要があります。
    5. リトラクターを取り外します。先のとがった鉗子を使用して、オクルーダーチューブの端を胸壁を2番目の下肋間腔に通し、オクルーダーが胸腔内の心臓の上に位置するまで、オクルーダーチューブを胸壁から引き出します。
    6. 外科医の結び目(図1C)を使用してオクルーダーを心臓にしっかりと結び、オクルーダーが心臓に横たわっているが、心臓に押し込まれないようにします。
    7. 押しボタン式インフレーションデバイスを使用して、オクルーダーを10 psiで短時間膨らませます(~10秒)。心電図をチェックして、インフレーション中のST上昇を確認し、可能であれば、心臓尖のブランチングを視覚的に確認します。必要に応じて縫合糸の位置や張力を調整し、虚血を確認します。
  5. 閉会
    1. 6-0ポリプロピレン縫合糸で隣接するリブを閉じ、胸部チューブを挿入します。胸部から空気と血液を排出してから、胸部チューブを取り外します。胸壁の閉じた切開部に2%リドカインを塗布します。.
    2. 先のとがった鉗子を使用して、オクルーダーチューブを右肩の皮膚の下にトンネルし、右耳の後ろの皮膚を通してチューブを外部にします。胸の筋肉を交換し、6-0ポリグラクチン縫合糸で皮膚を閉じます(図1D)。
    3. マウスを腹臥位に反転させます。手術終了の少なくとも30分前に、ケトプロフェンを3 mg / kgの投与量で皮下投与します(0.9%滅菌生理食塩水で1 mg / mL希釈を使用)。.
  6. テザー移植
    1. 小さなハサミを使って、背中の中央の皮膚に小さく(1cm)切開し、皮下脂肪や筋肉組織から皮膚をやさしく分離します。
    2. オクルーダーチューブを背中の中央にある切開部にトンネルで固定し、外部に押し出し、テザーに通します。6-0縫合糸を使用して、耳の近くの小さな穴を閉じます。
    3. 6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、テザーを背中の筋肉に固定します(図1E)。テザーボタンの上の皮膚を6-0縫合糸で閉じます。
  7. 回復
    1. マウスが自立して呼吸できるようになったら、挿管チューブを取り外します。マウスを術後RIケージに入れます(1匹の場合; 図3)足のピンチ反応が戻ったら。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを継続的に監視します。マウスが完全に動くようになるまで、ケージをヒートパッドの上に置きます。
    2. 翌日、ケトプロフェンの2回目の投与を3 mg / kgで皮下投与します。.
    3. RIプロトコルを開始する前に、マウスを5〜7日間休ませてください。マウスを毎日モニタリングして、機器の完全性を確認し、必要に応じてケージを交換します。マウスはRIプロトコルの期間中、シングルハウスであるため、必要に応じて適切な濃縮を行います。

2. 反復性虚血

  1. 前述のように、RI プロトコルの 0 日目に心エコー検査によってオクルーダーの配置を確認します15。オクルーダーの膨張中の心機能の低下を観察します。
  2. マウスのオクルーダーチューブをRIインフレーションシステムに接続します(図4)。システムは、オクルーダーを10psiまで6分間、1日4回膨らませ、各膨らませる間に3時間の休憩を挟みます(図5)。
  3. RIの17日後、ステップ2.1のように心機能を再チェックします。

3. ポリマー灌流と組織採取

  1. 犠牲時には、マウスに3%〜4%イソフルランを麻酔し、ヘパリン(500 U / kg)を腹腔内に注射します。.ノーズコーンを使用して、イソフルラン投与を2%で少なくとも5分間続け、つま先のピンチ反応がないことで麻酔の適切な深さを確認します。.
  2. 胸腔を開けて、心臓と胸部大動脈を露出させます。下行胸部大動脈をPE20チューブでカニューレし、下大静脈(IVC)を二等分して流出を可能にします。IVCから出る液体が透明になるまで1x PBSで心臓を逆行性に灌流し、続いて3 mLの1%リドカイン、次に3 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSで投与します。.オクルーダーの正確な位置でLADの永久的な結紮を行います。
  3. 動脈回路が満たされるまで、X線不透過性試薬で心臓を逆行性灌流します。.PE20チューブを止血剤で固定し、ポリマーを90分間硬化させます。解剖スコープで心臓をイメージします。

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結果

C57BL/6マウス136匹(雌雄合わせて)のうち、RI手術の生存率は93.4%で、17日間のRIプロトコル全体で生存したマウスは80.9%でした。

マウスRIプロトコルは、心筋に永久的な損傷を伴わない虚血の短いエピソードを有する以前の動物RIモデル12,16に基づいて最適化されました。手術中、オクルーダーの機能評価は、オクルーダーの膨張中にLV頂点の目に見えるブランチングと心電図のST上昇を観察することで行うことができます(図6)。術後の回復期間の後、閉塞器の機能は、閉塞器の膨張前と膨張中の両方で心エコー検査によって 0 日目に再度チェックされました。膨張中に駆出率(EF)と分数短縮(FS)の両方が減少し、これは閉塞器が正しく配置され、膨張中に虚血と機能低下を引き起こしていることを示しています(図7A)。これらのパラメータは、17日目に再度評価で...

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ディスカッション

冠状動脈の側副血行路は、IHD患者にとって自然なバイパスです。血管新生を標的とした臨床試験が失敗した後17、冠状動脈側副創成を促進することは、これらの患者にとってより良い治療アプローチになる可能性があります。血管新生由来の毛細血管が内皮細胞の単層しかないのに対し、側副動脈は平滑筋細胞を被覆した成熟した動脈です。側副は、閉塞性動脈によって引き起こされる心筋虚血の領域に血流を補充します。CCGの制御を理解することは、IHDを治療するための新しい標的を開発するために不可欠です。

反復虚血を用いた大動物モデルでCCGを研究することは有益であり10,11,12、特に自動化して分散を減らし、時間効率を向上させる場合18が、現在の遺伝技術を十分に活用...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者は、ここで説明した方法に貢献してくれた Weiguo Wan、Cody Juguilon、Iyanuoluwa Ogunmiluyi、および Devan Richardson に感謝します。本作業は 1R15HL115540-01 および 1 R01 HL137008-01A1 によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#5/45度鉗子ファインサイエンスツール11251-35
1/4 "クローズドブラス電気ソレノイドバルブ米国ソリッドUSS2-00054インフレーションシステム
1 / 4 "オープンブラス電気ソレノイドバルブAceCrewインフレーションシステム
1/4 "空気圧チューブ‎中国 SNS Pneumatic Co.,Ltd‎APU1/4-32.8ft押しボタン装置
1/4インチ プッシュインコネクタRuoFeng543Y押しボタン装置
1/8インチ 真鍮製 フィッティングエッジ インフレーションシステム
2 ポジション 空気圧式 電動ソレノイドバルブU.S. ソリッドUSS- PSV00033押しボタン装置
20G 血管BD381703
45 度CastroviejoニードルホルダーRobozRS-6421
6-0ポリグラクチン縫合DemeTECHG176011B13M
6-0ポリプロピレン縫合糸ADスジカルXS-P618R11
70%エタノール
8-0ポリプロピレン縫合糸DemeTECHPM19800、65G0P
ベタジンPurdue製品367618150085
鈍い鼻のはさみWorld Precision Intruments500366
カーボンファイバー アロー シャフト術後ケージ; 12.5 cm
コットン綿棒 (3 インチ)ピューリタン872-PC DBL
キュリティ ガーゼ スポンジ (2x2)枢機卿の健康2146
ディプシー スイベル シンカーウォーター グレムリン術後ケージ
電極クリームSignacreme17-05
グリコピロレートウェストワード0143-9679-01
ハートマン止血剤ファインサイエンスツール13003-10
イソフルランコベトラス29404
ケトフェン(ケトプロフェン)ゾエチス10004031
リドカイン (2%)コベトラス14583
MICROFIL (黄色)Flow TekMV-122
ミニプッシュボタンInteractiviaE-SWC-PBM-PBS-105プッシュボタンデバイス
ミニチュア空気圧調整器PneumaticPlusPPR2-N02BG-4プッシュボタンデバイス
Mini-Colibri スプリングリトラクターファインサイエンスツール17000-01
MiniVent ベンチレーターハーバードの器具73-0044
Occluderの注文は
鉗子を扱った八角形の細い科学用具11041-08
Ohanのげっ歯類の挿管システムBMR供給Ohan-201
パラホルムアルデヒドの解決4% PBSのサンタクルスsc-281692
PE20の管
PE50チューブ
プラスチックスイベル(1チャンネル)Instech375/25PS術後ケージ
プレミックスPBSバッファー、10xロシュ116667890011x
圧力ゲージPICゲージ102D-158D-10/32プッシュボタンデバイス
プログラマブルデジタルアウトレットタイマーBN-LINK‎BND-60/SU105インフレーションシステム
Puralube 獣医眼軟膏Dechra17033-211-38
リトラクター w/ 18200-07 エラストマーファインサイエンスツール18200-10 および 18200-11
げっ歯類 外科用モニター+Scintica900-0053-01
丸型縫合糸結束鉗子ファインサイエンスツール18026-10
スナップロックバレルスイベル(サイズ5)イーグルクロー‎01032-005術後ケージ
ストレート ニードル ホルダーファイン サイエンス ツール12060-01
テザーインステックPS62
糸に希釈

参考文献

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