ヒト多能性幹細胞からの腸管神経系系統の分化

サマリー

ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腸神経系(ENS)系統を導出することで、ENSの発生と疾患を研究し、再生医療で使用するためのスケーラブルな細胞源を提供します。ここでは、化学的に定義された培養条件を使用してhPSCから腸管ニューロンを誘導するための詳細な in vitro プロトコルを示します。

要約

ヒトの腸管神経系ENSは、神経伝達物質の多様性が顕著なグリア細胞とニューロン細胞の大規模なネットワークです。ENSは、腸の運動性、酵素分泌、栄養素の吸収を制御し、免疫系や腸内細菌叢と相互作用します。その結果、ENSの発達および後天性の欠陥は、多くのヒトの病気の原因であり、パーキンソン病の症状に寄与する可能性があります。動物モデルシステムにおける制限と初代組織へのアクセスは、ヒトENSの研究において大きな実験的課題を提起しています。ここでは、定義された培養条件を使用して、ヒト多能性幹細胞であるhPSCからENS系統を効果的にin vitro で誘導するための詳細なプロトコルを示します。私たちのプロトコルは、15日以内にhPSCを腸管神経堤細胞に特異的に分化することから始まり、30日以内に機能的な腸管ニューロンの多様なサブタイプを生み出します。このプラットフォームは、開発研究、疾患モデリング、創薬、再生アプリケーションのためのスケーラブルなリソースを提供します。

概要

腸管神経系(ENS)は、末梢神経系の最大の構成要素です。ENSには、消化管内に位置し、腸のほぼすべての機能を制御する4億個以上のニューロンが含まれています¹。ENSの発生と機能、および腸管性ニューロパチーにおけるその欠陥の分子的理解には、腸管ニューロンの信頼できる本物の供給源へのアクセスが必要です。ヒトの初代組織へのアクセスは限られており、動物モデルは多くの腸内ニューロパチーの主要な疾患表現型を再現できていません。ヒト多能性幹細胞(hPSC)技術は、特に一次供給源2,3,4,5,6,7から単離が困難な細胞種を無制限に供給する上で非常に有益であることが証明されています。ここでは、hPSCからENS培養物を得るための段階的かつ堅牢なin vitro法について詳しく説明します。これらのスケーラブルなhPSC由来培養物は、発生研究、疾患モデリング、ハイスループット薬物スクリーニングへの道を開き、再生医療のための移植可能な細胞を提供することができます。

腸管ニューロン系統は、胚形成中のENS発生経路をたどる神経堤(NC)細胞に由来します。胚では、NC細胞は折り畳み式の神経板の縁に沿って出現します。それらは増殖し、移動し、感覚ニューロン、シュワン細胞、メラノサイト、頭蓋顔面骨格、腸内ニューロン、グリア^8,9,10など、さまざまな細胞タイプを生じさせます。細胞の運命決定は、NC細胞が出現する前後軸に沿った明確な領域、すなわち、頭蓋NC、迷走神経NC、体幹NCおよび仙骨NCに依存する。ENSは迷走神経および仙骨のNC細胞から発生し、前者は腸の長さに沿って広範囲に移動し、腸にコロニーを形成するため、腸内ニューロンの集団を支配します¹¹。

PSCからのNC細胞の誘導には、一般に、デュアルSMAD阻害とWNT経路活性化の組み合わせが含まれます^12,13。最近まで、すべてのNC誘導プロトコルには、培養条件に血清やその他の動物製品添加物が含まれていました。化学的に未定義の媒体は、NC誘導の再現性を低下させるだけでなく、機構的な発生研究にも課題をもたらします。これらの課題を克服するために、Barberら¹⁴は、化学的に定義された培養条件を用いたNC誘導プロトコルを開発し、したがって、血清置換因子(例えば、KSR)^13,14に依存する代替方法よりも有利であった。これは、基礎培地の置換と、hPSCから腸管NC細胞を誘導するためにFattahiらによって最初に提示されたプロトコルの最適化によって得られました。この改良されたシステムは、ここで紹介するhPSC分化プロトコルの基礎です。これは、レチノイン酸(RA)に加えてBMP、FGF、WNT、TGFβシグナル伝達の正確な調節により、15日間で腸管神経堤(ENC)細胞を誘導することから始まります。次に、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)で細胞を処理することにより、ENS系統を導き出します。すべての培地組成物は化学的に定義されており、30〜40日以内に堅牢な腸内ニューロン培養物が得られます。

ここで述べた単層細胞培養系に加えて、自由浮遊胚様体^15,16を用いた代替のNC誘導法が開発されている。これらの培養物中の遊走性細胞は、迷走神経NCを表すサブセットでNCマーカーを発現することが示されています。初代腸組織との共培養は、これらの培養物の腸内NC前駆体を濃縮するために使用されてきました。これらの研究における培地組成物には、神経成長因子、NT3、脳由来神経栄養因子などのさまざまな因子の組み合わせが含まれています。この段階では、これらの要因が腸内ニューロン前駆体のコミットメントのアイデンティティにどのように影響するかは完全には明らかではありません。単分子膜と胚様体ベースの培養における腸内NC誘導を効率的に比較するには、より多くのデータが必要です。これらの戦略ではカルチャのレイアウトが異なるため、各方法の使用を検討し、特定のアプリケーションを念頭に置いて最適化する必要があります。

ここで提示されたプロトコルは再現性があり、異なるhPSC(誘導および胚)系統^8,14,16を用いて、我々および他の者によって成功裏に試験されている。

プロトコル

1. 培地の準備

注:プロトコール全体で言及されている濃度は、培地成分の最終濃度です。すべての培地を無菌条件下で層流フードで調製し、暗所で4°Cで保存します。2週間以内にご使用ください。

1. hPSC維持培地:フィーダーフリーのhPSC維持培地サプリメント(20μL / mL)とそのベース培地を混合します。
2. 培地A:骨形成タンパク質4(BMP4;1 ng/mL)、SB431542(10 μM)、CHIR99021(600 nM)を分化ベース培地に添加します。
3. 培地B:分化ベース培地にSB431542(10μM)とCHIR99021(1.5μM)を添加します。
4. C培地:分化ベース培地にSB431542(10μM)、CHIR99021(1.5μM)、RA(1μM)を添加します。
5. ニューラルクレストコンプリート(NCC)培地:FGF2(10 ng/mL)、CHIR99021(3 μM)、N2サプリメント(10 μL/mL)、B27サプリメント(20 μL/mL)、L-グルタミンサプリメント(10 μL/mL)、およびMEM NEAA(10 μL/mL)をニューロベース培地に加えます。
6. ENC培地:GDNF(10 ng / mL)、アスコルビン酸(100 μM)、N2サプリメント(10 μL / mL)、B27サプリメント(20 μL / mL)、L-グルタミンサプリメント(10 μL / mL)、およびMEM NEAA(10 μL / mL)を神経基礎培地に加えます。
7. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)1x:PBSで500 mM EDTA(1000x)を最終濃度500 μMに希釈します。
   注:特に明記されていない限り、このプロトコル全体でCa²⁺ およびMg²⁺ 遊離PBSを使用してください。

2. 培養プレートのコーティング

1. 基底膜マトリックスコーティングプレート:500 mLの血清ピペットを使用して激しくピペッティングすることにより、基底膜マトリックスの500 μL凍結アリコートを50 mLの冷却DMEM:F12で迅速に解凍し、希釈します。希釈した基底膜マトリックス溶液(ウェル表面積1cm² あたり100 μL)でウェルをコーティングし、37°Cで一晩インキュベートします。 使用前にコーティング媒体を吸引してください。基底膜マトリックスの糊化を防ぐために、この手順をできるだけ早く実行し、凍結アリコートを溶解するために冷たいDMEM:F12を使用してください。
   注:凝固を防ぐために、融解中(氷上)および分注中(氷上のチューブ)は、基底膜マトリックスの温度を冷たく保つ必要があります。
2. PO/FN/ラミニンコーティングプレート:PBS中の15 μg/mLポリオルニチン(PO)溶液を調製し、ストックを1000倍に希釈します。ウェル表面積1 cm² あたり100 μLのPO/PBS溶液でウェルをコーティングし、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。 翌日、PO/PBSを吸引し、2 μg/mLのフィブロネクチン(FN)と2 μg/mLのラミニンを含む新しく作ったFN/ラミニン/PBS溶液で、ウェル表^面積100 μL/cm2でウェルをコーティングします。プレートは、37°Cで最低2時間のインキュベーション後に使用できます。 使用前にFN /ラミニン/ PBSを吸引してください。

3. hPSC培養の維持

注:すべての細胞インキュベーションステップは、加湿インキュベーター内で5%_CO2 および37°Cで行われます。

1. hPSC培養物からhPSC培地を吸引し、コロニーが~80%コンフルエントになるまで、新鮮な培地(ウェル表面積1 cm² あたり200 μL)を隔日で追加します。
2. 継代するには、hPSC培地を吸引し、ウェル表面積^1cm2 あたり100μLのPBSで細胞を洗浄します。
   注:細胞を洗浄するために^Ca2+ および^Mg2+ 遊離PBSを使用することが重要です。
3. 500 μM EDTA(ウェル表面積1 cm² あたり100 μL)を添加します。プレートの蓋を元に戻します。倒立顕微鏡で観察し、コロニーエッジの細胞の剥離を監視します(2〜4分)。
4. 5 mLまたは10 mLの血清ピペットを使用して、同量のhPSC培地を各ウェルに移し、数回ピペッティングして細胞を機械的に回収します。
   注:最適なEDTAインキュベーション時間は、iPS細胞ラインによって異なります。分離するコロニーの激しいピペッティングは、コロニーの過度の解離や細胞死につながる可能性があるため、避けてください。分化プレートを開始するために継代するときは、EDTAで細胞を1〜2分長くインキュベートします。
5. 細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移します。細胞を回転させ(2分、290 x g、20-25°C)、上清を慎重に捨てます。
6. 細胞を適切な容量のhPSC培地に再懸濁し、新しい基底膜マトリックスコーティングプレートのウェルに移します。
   注:定期的なhPSCメンテナンスには、1:18〜1:24の継代比を使用してください(1:18は、6ウェルプレートの1つのウェルから解離した細胞の3分の1を完全な新しいプレートに移すことを意味します)。差別化プレートを開始するには、5:6の継代比に従います。
7. 5% CO₂ および37°Cでインキュベートします。

4. 神経堤誘導

注: この手順を 図 1A に概略的に示しています。NC分化は、細胞が約80%コンフルエントになったら開始します。これは、細胞が5:6の比率で継代されると、1〜2日以内に達成されます(上記参照)。0日目に、多能性および完全に未分化のhPSC細胞を用いてNC分化を開始します。高効率のためには、コロニー境界は最小限の分化細胞を持つべきです。コロニーが大きい場合、または倒立顕微鏡を使用して監視するとコロニーの中心が肥厚/暗くなり始める場合の鑑別のための通路およびプレートhPSC。コンフルエンシーと形態に注意を払うことは、細胞株によって異なり、cm²あたり50,000〜200,000の間で変動する可能性があるため、播種した細胞の数よりも信頼性が高い傾向があります。

1. 0日目に、hPSC維持培地を、1 ng/mL BMP4、10 μM SB431542、600 nM CHIR99021(ウェル表面積1 cm² あたり200 μLの培地)を含む培地Aと交換します。
2. 2日目には、細胞は100%コンフルエントであるべきです。使用済みの培地Aを穏やかに吸引し、10 μM SB431542、1.5 μM CHIR99021(ウェル表面積1 cm² あたり200 μLの培地)を含む培地Bを細胞に供給します。
   注:NC誘導中に培養物が増殖すると、細胞が下にある単層から剥離する可能性があります。古い培地を静かに取り除き、ウェルの側面に新しい培地を追加することで、過剰な細胞損失を回避します。
3. 4日目に、培地B(ウェル表面積1cm² あたり200μLの培地)を再び細胞に供給します。
4. 6日目に、培地Bを、10 μM SB431542、1.5 μM CHIR99021、1 μMのレチノイン酸(ウェル表面積1 cm² あたり400 μLの培地)を含む培地Cと交換します。
5. 8日目と10日目は、6日目として給餌します。

5. ENCスフェロイドの形成

注: この手順を 図 1B に概略的に示しています。

1. 12日目に、ミディアムCを穏やかに吸引し、ウェル表面積^1cm2 あたり100μLのPBSで細胞を洗浄します。同量の細胞剥離溶液を添加し、5% CO₂ および37°Cで30分間インキュベートします。
2. 10 ng/mL FGF2、3 μM CHIR99021、10 μL/mL N2 サプリメント、20 μL/mL B27 サプリメント、10 μL/mL L-グルタミンサプリメント、10 μL/mL MEM NEAA を含む同量の NCC 培地を添加して、細胞剥離溶液を希釈します。血清学的ピペットを使用して、単一細胞懸濁液を回収し、15 mLのコニカルチューブに加えます。
3. 細胞を回転させ(2分、290 x g、20-25°C)、上清を慎重に捨てます。
4. 10 mLの血清ピペットを使用して、12 mL(フル6ウェルプレートの場合)のNCC培地を加え、機械的に1〜2回ピペッティングして細胞を完全に再懸濁します。細胞懸濁液を超低接着プレートに移します。
   注:約10 cm² のENC単層細胞を2 mLのNCC培地に再懸濁し、超低接着プレートの1ウェルに移します。これは、フル6ウェルNCインダクションプレートをフル6ウェル超低アタッチメントプレートに移したのと同じです。
5. 14日目に、小さな回転楕円体が各ウェルの中央に集まるまで、プレートを静かに渦巻かせます。P1000マイクロピペットを使用し、ゆっくりと円を描くように、使用済みのNCC培地を各ウェルの周囲で吸引します。浮遊性スフェロイドは取り除かないようにしてください。
6. 元の容量のNCC培地を細胞に供給します。

6. ENインダクション

注: この手順を 図 1B に概略的に示しています。

1. 15日目に、14日目と同じ手法を適用して培地を静かに取り出し、PBSでスフェロイドを洗浄します。回転楕円体を避けて、できるだけ多くのPBSを取り除きます。
2. 細胞剥離溶液(ウェル表面積1cm² あたり100 μL)を添加し、5% CO₂ および37°Cで30分間インキュベートすることにより、スフェロイドを単一細胞に解離します。
3. 10 mLの血清ピペットを使用して、等量のENC培地(10 ng/mL GDNF、100 μMアスコルビン酸、10 μL/mL N2サプリメント、20 μL/mL B27サプリメント、10 μL/mL L-グルタミンサプリメント、および10 μL/mL MEM NEAAをニューロベース培地に含有)を各ウェルに加え、残りのスフェロイドを2〜3ラウンドの機械式ピペッティングで切断します。細胞を50mLのコニカルチューブに移します。
   注:強制ピペッティングや先端開口部の小さいピペットの使用により発生する可能性のある過度のストレスや細胞死は避けてください。
4. 細胞を回転させ(2分、290 x g、20-25°C)、上清を慎重に捨てます。10 mLの血清ピペットを使用して、5~10 mLのENC培地を加え、ピペッティングを1〜2回行って細胞を完全に再懸濁します。
5. トリパンブルーと血球計算盤などの細胞計数法を使用して、生細胞の濃度をカウントします。
   注意:トリパンブルーは発がん性が疑われる物質です。取り扱いには注意し、適切に廃棄してください。
6. 表面積^{cm 2} あたり約 300,000 〜 400,000 個の生細胞を、mL あたり約 ~ 1,000,000 個の細胞の密度でプレートすることを目的として、十分な量の ENC 培地を追加します。プレートのウェルからFN/ラミニン/PBS溶液を吸引します。
   注:この段階はプロトコルの最終的な再めっきステップを示すため、EN培養用に計画されているアッセイに従ってプレート形式を選択してください。腸内ニューロン前駆細胞は15日目に凍結することができます。球体を細胞剥離溶液で解離した後、前駆細胞を約5 x 10⁶ 細胞/mLで10% DMSOやStem-cellbankerなどの凍結培地に再懸濁します。必要に応じて、5 μM Y-27632 ROCK阻害剤を含む温かいENC培地で解凍します。目的のプレート形式のプレートセル。数時間後にメディアを新しいENCと交換します。
7. 細胞をPO/FN/ラミニンでコーティングしたウェルに穏やかに加えます。特に384ウェルプレートのような小さなウェルサイズのプレートを使用する場合、気泡が細胞懸濁液の下に閉じ込められるのを防ぎ、細胞がPO/FN/ラミニンコーティングに付着するのを防ぎます。これは細胞死につながる可能性があります。
8. 30〜40日目までENC培地(ウェル表面積^1cm2 あたり200μL)を隔日で細胞に給餌し、その後、給餌頻度を減(週に1〜2回)減らしますが、給餌量は2倍にします(ウェル表面積^1cm2 あたり培地400μL)。
   注:培地を過度に除去および添加すると、ウェルの表面からのニューロン培養物の剥離が促進される可能性があるため、これは重要です。特に長期培養では、剥離を前向きに防ぐために、ENCにFN(2 μg/mL)とラミニン(2 μg/mL)を週に1回補給します。

結果

このプロトコルは、化学的に定義された培養条件を使用して、hPSCから腸管神経堤および腸管ニューロンを導出する方法を提供します(図1A-B)。高品質のニューロンを生成するには、効率的な腸管神経堤誘導ステップが必要です。これは、図1Cに示すように、約0.1〜0.4mmのサイズの滑らかな表面で丸く見えるはずの自由浮遊球の形態を確認することで視覚的に評価できます。これらのスフェロイドは、図1Dに見られるように、神経堤マーカーSRY-Box転写因子10(SOX10)^17,18も発現するはずです。腸管ニューロン誘導期では、神経突起は早くも25〜30日目に見えるようになります(図1E)。しかし、これは分化を遅らせることができ、望ましくない間葉系細胞汚染を封じ込める効率が低くなります。ヒトの腸管神経系は、さまざまな神経伝達物質を発現する多様なニューロンの集合体です。この不均一性は、提供されたインビトロプロトコルにおいて再現され、主要なマーカーの発現は、前述のプロトコル^{13、14、19、20、21}(図1F、G)に従って、免疫蛍光イメージングおよびフローサイトメトリーなどの細胞染色法によって評価することができる。

図1:ヒトENC細胞と腸管ニューロンサブタイプをhPSCから導出 (A)hPSCからの腸管神経堤(ENC)誘導。hPSCからENC細胞を誘導するための培地組成を示すプロトコル(0〜12日目)。(B)ENCスフェロイド形成およびENCからの腸管ニューロン誘導 プロトコル(12〜15日目)は、ENCスフェロイド形成のための培地組成を示しています。その後、腸内ニューロンを作製し、GDNFとAAを含有する培地で処理することにより成熟させます。(C)プロトコルの異なる時点における分化したhPSCの代表的な位相コントラスト画像。スケールバー:1000 μM. (D) SOX10::GFP 14日目にH9 iPS細胞由来ENCスフェロイドを発現。スケールバー:1000μm.(E)33日目のニューロンの位相収縮画像。スケールバー:400μm.(F-G)40日目のニューロンにおける神経伝達物質マーカーの免疫蛍光イメージング(F)およびフローサイトメトリー(G)。スケールバー:50μm。略語:BMP4 =組換えヒトBMP4タンパク質;RA =レチノイン酸;FGF2 = 組換えヒト FGF 基本;GDNF = 組換えヒトグリア細胞株由来神経栄養因子;AA = アスコルビン酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで述べる分化プロトコルは、30〜40日以内にhPSCから腸管ニューロンを得るための頑健なin vitro法(図1E)と、古い培養物でグリア線維性酸性タンパク質、GFAP、およびSOX10を発現する腸グリアを得るための堅牢なインビトロ法を提供する(>55日目)^13,14,19,22。これらのニューロンとグリアは、hPSCが迷走神経細胞と腸管神経堤細胞に段階的に分化し、続いて腸内ニューロンとグリア前駆細胞が続くことによって誘導されます^13,14。神経堤細胞は、神経堤マーカー、転写因子AP-2αおよびβ、TFAP2AおよびTFAP2Bをそれぞれ発現する²¹。我々は以前に、CD49がhPSC由来神経堤細胞の効率を示すマーカーとして使用できることを示しました¹⁴。この方法の効率と成功は、いくつかの要因の組み合わせにかかっています。まず、すべてのステップを無菌条件下で実行することが重要です。ヒトPSC培養物のマイコプラズマ汚染試験は、幹細胞の増殖に悪影響を与える可能性があり、目視では検出できないため、重要です。第二に、均一かつ適切にコーティングされたプレートを使用すると、斑状のhPSC培養物の増殖や、NC培養物や古いニューロンがウェルの表面から剥離する可能性が減少します。第三に、分化を高効率で行うためには、多能性で完全に未分化のhPSC細胞から始めることが不可欠です。hPSCコロニーは、コロニー境界に最小限の分化細胞を持つ必要があります。hPSCは、コロニーが大きい場合、または位相差顕微鏡で観察するようにコロニーの中心の色が濃くなったり暗くなったりする場合は、分化のために継代またはメッキする必要があります。望ましくない分化細胞(通常は間葉系細胞)は、全体的な分化効率を低下させるだけでなく、培養物が古くなるにつれて、ウェルの表面からニューロンが剥離する可能性があります。したがって、最初の15日間はENCカルチャーを注意深く監視することをお勧めします。効率的な分化条件下では、培養物~6日目の表面に暗い円盤が現れ、これは12-15日目に効率的なスフェロイド形成を示しています。さらに、回転楕円体期(12-15日目)では、自由に浮遊する球体は滑らかな表面を持つはずです(図1D)。12〜15日目に3Dスフェロイド期を維持することは、一般に、培養物をENS系統に下流で分化するためのENCの純度を向上させるのに十分です。ただし、早期の純粋なENC前駆細胞集団を必要とする研究では、CD49Dを使用したFACSが推奨されます。CD49Dは、SOX10:hPSC由来のNC系統の特異的な表面マーカーであり、細胞株^13,14全体で成功裏に使用されています。FACSを用いたCD49D+細胞の単離に関する詳しい情報およびゲーティング戦略に関する推奨事項については、読者は、Barberらの論文、図2D、Box1および補足図6¹⁴を参照されたい。第4に、効率を最大化するためには、hPSC培養物が単層で~80%コンフルエントなときに分化を開始する必要があります。これは、2日目に完全にコンフルエントな文化を持つことを意味します。コンフルエンシーが低いと効率に悪影響を及ぼし、非常に密度の高い培養物は細胞死率が高くなる傾向があり、望ましくない分化細胞の出現につながる可能性があります。

15日目に細胞を再播種することは、このプロトコールの重要なステップです。これは、単層ニューロン培養の最後の細胞導入ステップであるため、プレートレイアウトは計画されたアッセイに従って選択する必要があります。各ウェルに移された細胞の数は、ニューロンの多様性とウェルの表面に付着したままの古いニューロンに大きな影響を与える可能性があります。一般に、細胞密度は、cm² あたり250,000〜350,000細胞(96ウェルプレートのウェルあたり約75,000〜100,000細胞、または24ウェルプレートのウェルあたり500,000〜700,000)の範囲が望ましい。30〜40日目から、特により長いニューロン培養のために計画された細胞のニューロンの剥離を前向きに防ぐために、フィブロネクチンとラミニンを給餌培地(週に1回以下)に追加することを検討できます。この時点で、給餌頻度を5〜7日に1回に減らし、各ウェルに培地を残してから、新鮮な培地を追加することをお勧めします。これにより、ニューロンの投射に不必要な物理的ストレスがかかる可能性が低くなります。培地の蒸発を考慮すると(特にプレートの境界にあるウェルの場合)、75μLを除去し、各ウェルに100μLの新鮮な培地を追加することができます。経験から、ポリマーカバースリップ底面イメージングプレートで培養した培養物は、ウェルの表面に長時間付着したままで留まる傾向があります。したがって、他の細胞タイプとの共培養など、非常に古いニューロン培養を必要とする実験には、ポリマーカバースリップボトムイメージングプレートを検討することをお勧めします。風乾PO/FN/ラミニンコーティングされたプレートは、依然として効率的な分化をもたらす可能性がありますが、これはこのプロトコルの目的のために体系的にテストされていません。したがって、コーティングしたばかりのプレートの使用をお勧めします。

ここで説明するプロトコルは、Barberら¹⁴によって以前に公開されたプロトコルに基づいています。血清補充因子を含む培地を使用する古いENC誘導法(KSRなど)^13,14と比較して、現在のプロトコル培地条件は化学的に定義されています。これは、より一貫した分化に向けて有利であり、培養条件を操作することにより、より正確な発生研究を可能にします。この堅牢なプロトコルは、H9、UCSF4、WTC11などの試験済みの独立した誘導幹細胞株および胚性幹細胞株から腸管ニューロンの培養を再現性よく生成します。提示されたプロトコルの強力な側面は、ヒトENSに見られるものに似たさまざまなENSニューロンサブタイプを生成する能力です。例えば、さまざまなENS神経化学的アイデンティティに対する特異的マーカーの発現は、フローサイトメトリーおよび蛍光イメージングによってチェックできます(図1F、G)。一酸化窒素シンターゼ1(NOS1)陽性のhPSC由来腸内ニューロン集団の典型的な範囲は5%〜20%です。コリンO-アセチルトランスフェラーゼ(CHAT)は40%-60%です。γ-アミノ酪酸(GABA)は15%〜30%、セロトニン(5-HT)は15%〜30%です。しかし、これらのサブタイプ間のin vitroの構造的および機能的結合性がin vivo細胞ネットワークを正確にモデル化する程度については、さらなる研究が必要です。さらに、個々のサブタイプの転写プロファイリングを拡大するためのシングルセル解析は、in vivoおよびin vitroの細胞同一性をよりよく比較するのに役立つだけでなく、発生研究や分子研究、さらには創薬や再生医療のための特定のサブタイプの濃縮に向けた将来のプロトコールの最適化にも役立つでしょう。

異なるニューロン細胞を含む培養物、および古い培養物ではグリア細胞を含むにもかかわらず、このプロトコルは、筋細胞、上皮細胞、免疫細胞など、ENSの in vivo ニッチに自然に見られる他の細胞タイプを生成しません。ENSとこれらの細胞種との相互作用を健康や疾患の観点から研究するには、共培養と腸管オルガノイドシステムの最適化に投資する必要があります。全体として、in vitro でhPSCからENSのさまざまなサブタイプを生成する強力な方法がここで説明されています。スケーラブルな培養物は、ヒトENSの発生研究、薬物療法の開発、腸管神経障害の治療のための移植可能な細胞の提供を目的とした疾患モデリング実験、毒物学試験に適しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アスコルビン酸	Sigma-Aldrich	A5960
B27 サプリメント (無血清、ビタミン Aを除く)	Gibco	12587-010
基底膜マトリックス、Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
細胞培養遠心分離機	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Lifeテクノロジー	A1516401
DMEM/F-12 グルタミン無	ライフテクノロジー
EDTA	コーニング	MT-46034CI
フィーダーフリー hPSC メンテナンス メディウム エッセンシャル 8 フレックス ミディアム キット	ライフ テクノロジー	ズ A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
フィブロネクチン	コーニング	356008
GDNF	Peprotech	450-10
血球計算盤	Hausser Scientific	1475
ヒト多能性幹細胞、H9 ESC	WiCell	RRID: 湿度
インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Herralcell 150i
倒立顕微鏡	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EVOS FL
層流フード	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1300 シリーズクラス II、タイプ A2
ラミニン	Cultrex	3400-010
L-グルタミンサプリメント、グルタグロ	コーニング	25-015-CI
MEM NEAAs	コーニング	25-025-CI
マルチウェルプレート、Falcon	BD	353934、353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
ペットフィ	ッシャーブランド	13-678-11E、13-678-11F
PO	シグマ-アルドリッチ	P3655
ポリマーカバースリップボトムイメージングプレート、同上	上	81156
RA	シグマアルドリッチ	R2625
SB431542	R&Dシステム	1614
トリパンブルーステイン、0.4%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250-061
超低アタッチメントプレート	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-601
Y-27632 二塩酸塩	R&Dシステム	1254