方法論記事

遠位中動脈閉塞法を用いたマウスにおける急性虚血性脳卒中の誘発

DOI：

10.3791/66134

⸱

2023年12月15日

 ,  ,  , 
1Wuhan Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、C57BL/6Jマウスの経頭蓋電気凝固術による遠位中大脳動脈閉塞(dMCAO)モデルを確立し、その後の神経学的行動と組織病理学的特徴を評価するためのプロトコルを提示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

虚血性脳卒中は、世界中の成人人口の死亡と機能障害の主な原因であり続けています。虚血性脳卒中患者のうち、最適な時間枠内で血管内血栓溶解療法または機械的血栓摘出術を受ける資格があるのはごくわずかです。これらの脳卒中生存者のうち、約3分の2が長期間にわたって神経機能障害に苦しんでいます。安定性と再現性のある実験的虚血性脳卒中モデルを確立することは、虚血性脳卒中の病態生理学的メカニズムをさらに調査し、効果的な治療戦略を開発するために非常に重要です。中大脳動脈 (MCA) は、ヒトの虚血性脳卒中の主な位置を表しており、MCA 閉塞は限局性脳虚血の頻繁に使用されるモデルとして機能します。このプロトコルでは、C57BL/6 マウスの経頭蓋電気凝固術による遠位 MCA 閉塞 (dMCAO) モデルを確立する方法論について説明します。閉塞部位はMCAの皮質枝に位置しているため、このモデルは皮質に限定された中等度の梗塞病変を生成します。神経学的、行動学的、および組織病理学的特性評価は、このモデルで目に見える運動機能障害、ニューロン変性、およびミクログリアとアストロサイトの顕著な活性化を示しています。したがって、このdMCAOマウスモデルは、虚血脳卒中と普及の価値を調査するための貴重なツールを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳卒中は、障害の発生率と死亡率が高いことを特徴とする一般的な急性脳血管疾患です1。すべての脳卒中症例のうち、80%近くが虚血性脳卒中2に属しています。これまで、静脈内血栓溶解療法は、急性虚血性脳卒中の治療のための限られた数の生産的なアプローチの1つであり続けています。しかし、血栓溶解療法の有効性は、有効期間が狭いことと出血性形質転換の発生によって制限されます3。虚血性脳卒中後の長期リハビリテーション段階では、かなりの数の患者が持続的な神経機能障害を経験する可能性があります4。虚血性脳卒中の根底にある病態生理学的メカニズムを解明し、虚血性脳卒中を標的とした新しい治療戦略の開発を促進するためには、さらなる研究が急務です。虚血性脳卒中の信頼性と再現性のあるモデルの確立は、虚血性脳卒中の基礎研究だけでなく、その後のトランスレーショナル研究にとっても重要です。

1981年、田村らは、中大脳動脈(MCA)の近位部位における経頭蓋電気凝固術を用いて、限局性脳虚血モデルを開発しました5。それ以来、多くの研究者が、ライゲーション、圧迫、クリッピングなどのさまざまな方法論を利用して、遠位MCA閉塞(dMCAO)を誘発し、一過性または永久的な虚血性脳卒中モデルを確立してきました6,7,8。フィラメントモデルと比較して、dMCAOモデルは、梗塞サイズの縮小や生存率の向上などの顕著な利点を示し、虚血性脳卒中9後の長期的な機能回復の研究に適しています。さらに、dMCAOモデルは、フィラメントモデルと比較して高齢のげっ歯類の生存率を示しており、高齢者および併存動物モデル10の虚血性脳卒中を調査するための有利なツールとなっています。光血栓性(PT)脳卒中モデルは、外科的侵襲性が低く、死亡率が有意に低いという特性を持っていることが実証されています。しかし、PTモデルはdMCAOモデルと比較して、細胞壊死および組織浮腫の度合いが高く、側副循環が存在しない11。さらに、PTモデルで観察された虚血性病変は、主に微小血管閉塞から生じ、dMCAOモデル12の大血管塞栓症によって誘発される脳虚血とは大きく異なることは注目に値します。

この論文では、小骨窓開頭術を介して遠位MCAを凝固させることにより、マウスdMCAOモデルを誘導する方法論を紹介します。さらに、この実験モデルにおける虚血性傷害と脳卒中の転帰を包括的に特徴付けるために、組織学的検査と行動評価を実施しました。私たちは、研究者にこのモデルを知ってもらい、虚血性脳卒中の病理学的メカニズムに関するさらなる研究を促進することを目指しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この実験プロトコルは、江漢大学の動物施設管理委員会によって承認され、中国疾病管理センターが発行した実験動物倫理ガイドラインに従って実施されました。このプロトコルでは、10週齢の成人男性C57BL / 6Jマウス、体重24〜26gを使用しました。すべてのマウスは、12時間の明暗サイクル制御環境下で、餌と水を自由に使用して飼育されました 。

1. 術前準備

注意: このプロトコルに必要な主要な機器と機器を 図1に示します。

  1. 手術の前に、オートクレーブで手術器具を滅菌します。
  2. 手術の60分前に、鎮痛のためにメロキシカムを5 mg / kgの用量で皮下投与します。.
  3. 誘導チャンバー内でマウスを5%イソフルランで麻酔します。
  4. 75%エタノールで加熱手術ボードを拭き、温度を37°Cに設定して加熱スイッチを作動させます。 次に、マウスをボード上の左横位置に配置し、頭を外科医から離して配置し、尾を外科医に向けて配置します。
  5. マウスの顔にマスクを取り付けて、維持麻酔のために2%イソフルランと0.3L/minの酸素を一定に供給します。処置中の乾燥から角膜を保護するために、角膜に眼軟膏を塗布します。
  6. 左眼窩から左耳道までの毛皮をシェーバーで剃ります。脱毛クリームを使用して、滅菌のために残りの毛皮を取り除きます。
  7. ポビドンヨード消毒剤と75%エタノールを3回塗布して、手術部位を準備します。

2.遠位MCAOモデル

  1. つま先のつま先の挟み込みの反射神経を評価して、マウスが深く麻酔されているかどうかを確認します。
  2. 滅菌メスの刃を使用して、左眼窩と左耳道の間に垂直切開を行います。
  3. リトラクターで皮膚の軟部組織を引っ込め、側頭筋を露出させます。
  4. まっすぐな微小鉗子を使用して、側頭筋の頂端部と背側部分を頭蓋骨から分離します。
  5. MCAの分岐部を特定し、頭蓋骨の基部に偏った側頭骨の下の「Y」字型を仮定します(図2A)。
    注:MCAの分岐部が視覚的に識別できない場合(解剖学的に正常な変動のため)、最も吻側の血管を確認します。
  6. 電気頭蓋ドリルを使用して頭蓋骨を薄くし、半透明の質感を持つ硬膜が見えるまで骨窓(直径4mm)を作ります。
    注意: このプロセス中の過熱を防ぐために、通常の生理食塩水を頭蓋骨に断続的に追加します。
  7. 湾曲したマイクロ鉗子で動脈の上の硬膜を取り外して、MCAブランチを露出させます。
  8. 電気焼灼器を7 Wに設定し、MCAの分岐部の近位および遠位の部位で電気凝固鉗子を使用して動脈を凝固させます(図2A)。解剖学的な変化のために分岐部が見えない場合は、正確に識別されたMCA枝(上記のように)に対して、約1mm間隔の2つの別々の場所で凝固を行う13。
  9. レーザースペックル血流計を使用して、左MCA皮質枝の血流を監視します。
    注: 電気凝固術後のベースライン値の 40% 未満の血流減少を示すマウスは、研究から除外されました。
  10. 5-0ポリグリコール酸縫合糸を使用して、筋肉と皮膚を別々に縫合します。滅菌綿棒を使用して、ジクロフェナクナトリウムゲルとムピロシン軟膏を皮膚切開部に塗布します。.
  11. マウスを回収チャンバーに入れます。すべてのマウスが完全に目覚めるまで監視します。鎮痛用のメロキシカム(5 mg / kg、SC)を24時間ごとに最大72時間提供します。.

3. 偽装作戦

  1. 動脈凝固のプロセスを除いて、上記と同じ手順を再現します。

4. 行動テスト

注:dMCAOの前に、マウスは1日2回、3日間行動訓練を受けました。dMCAOの3日目に 、マウスを行動試験室に移動して、試験前に2時間の環境適応を行います。

  1. 握力試験14
    注意: 握力計は、プッシュプルひずみゲージと金属製の水平バーで構成されています。
    1. マウスの尻尾の付け根をつかみます。マウスを金属製のグリップバーに向かって徐々に下げ、両前足で水平バーをつかみます(図2B)。
    2. マウスを約2cm / sの一定速度で後方に引き、本体を水平に保ちます。
    3. マウスが前足をバーから離したときの最大力をグラム(g)で記録します。
  2. ポールテスト15
    1. マウスを垂直の木製のポール(高さ50 cm、直径1 cm)の上に置き、頭を上に向けてマウスを降りさせます(図2B)。
    2. マウスが向きを変えるのにかかった時間(Tターン)とポールを降りるのにかかった合計時間(T合計)を60秒のカットオフ時間で記録します。
  3. 粘着テープ剥離試験16
    1. マウスを持ち、粘着テープ(2 mm×2 mm)のパッチをマウスの右前足に貼り付けます(図2B)。
    2. マウスを飼育ケージに戻し、自由に動くようにします。
    3. マウスが接着剤を取り除くのにかかった時間を60秒の制限で記録します。
  4. シリンダーテスト17
    1. マウスをオープントップの透明なガラスシリンダー(直径:14 cm、高さ:20 cm)に置き、カメラを使用して自発的な立位探索行動を3分間記録します(図2B)。
      注:実験手順では、前肢の動きを最適に記録するために、2つのミラーがシリンダーに沿って配置されました。
    2. 75%エタノールでシリンダーを拭いて、残留する嗅覚の手がかりを取り除き、その後のマウスをテストします。
    3. 動画の再生速度を実際の速度の1/5に落とし、左前足(L)または右前足(R)で壁に触れた回数、または両前足の同時使用回数(B)をカウントします。右前足の使用率を(L-R)/(L+R+B)×100%で計算します。

5. 灌流とサンプル調製

  1. ペントバルビタール(300 mg / kg)の腹膜注射過剰投与によりマウスを安楽死させます。.マウスを仰臥位に置き、手足を固定します。
  2. 中腹腔から始まり、胸部上部に向かって伸びる、皮膚の正中線切開を行います。
  3. 手術用ハサミで胸を開き、止血器で剣状突起を上に折ります。肺と横隔膜を慎重に取り外して、心臓を露出させます。
  4. 灌流針先を左心室に挿入し、ハサミで右心房に穴を開けます。左心室を介して20mLの生理食塩水で心臓を灌流します。.
  5. マウスの首を切り落とし、目の間の正中線に沿って頭皮を切り開きます。頭蓋骨の基部から始まり、眼窩まで開口する両側に沿って骨を切ります。
  6. カルバリウムを持ち上げ、鉗子を使用して脳を頭蓋骨の基部からそっと取り外します。
    注:マウスの半数の脳は2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色を受け、残りの半分の脳は組織学的検査を受けました。
  7. フォローアップの組織学的分析のために、脳を4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩浸します。

6. 梗塞量の把握

  1. 脳を冷蔵庫の-20°C冷凍室に20分間置きます。
  2. 脳を1mmの脳マトリックスに配置し、ミクロトームブレードを使用して脳を厚さ2mmの冠状動脈切片にスライスします。
  3. 脳切片を24ウェル培養プレートに移し、2% TTCを添加して脳組織を覆います。24ウェル培養プレートを37°Cに設定した温度で、恒温オーブンに30分間入れます。
  4. 脳切片を慎重に持ち上げ、4%パラホルムアルデヒド溶液に15分間固定します。
  5. これらの脳切片を1200 x 1200 dpiの解像度でスキャニスターで光学スキャンします。
  6. Image Jソフトウェア(https://imagej.net/software/imagej/index)18を用いて、各切片の梗塞領域(右半球の領域から左半球の無傷領域を差し引いた領域)を合計することにより、脳梗塞の体積を測定する。梗塞の体積パーセンテージを梗塞の体積/右半球の体積×100%として計算します。

7. 病理組織学的染色および免疫蛍光染色法

  1. パラホルムアルデヒド溶液から脳サンプルを採取し、流水で1時間洗い流します。
  2. 脳サンプルを自動組織脱水機に移します。脱水、ガラス化、ワックス浸漬のプリセットプログラムを起動します。脱水した脳サンプルをパラフィンに埋め込み、ミクロトームで厚さ5μmにスライスします。
  3. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
    1. キシレンで切片を3回、それぞれ8分間脱ろうします。
    2. グラジエントエタノール(100%、95%、90%、80%、70%)と蒸留水に毎回5分間連続して浸漬することにより、切片を再水和します。
    3. 切片をヘマトキシリン溶液で5分間染色します。
    4. 切片を蒸留水ですすいで残留物のヘマトキシリンを洗浄し、5%塩酸アルコールに浸して5-sの区別を行います。切片を蒸留水で2分間洗浄します。
    5. 切片をエオシン溶液で30秒間染色し、蒸留水を使用して余分な染色液を洗い流します。
    6. 切片を90%エタノール、95%エタノール、100%エタノール、キシレン(2回)に毎回5分間連続して浸漬します。切片を中性バルサム封入剤で取り付けます。
  4. 免疫蛍光染色
    1. キシレンで切片を3回、毎回8分間脱ろうします。
    2. グラジエントエタノール(100%、95%、90%、80%、70%)と蒸留水に毎回5分間連続して浸漬することにより、切片を再水和します。
    3. クエン酸抗原賦活化溶液を予熱して電子レンジで沸騰させます。切片を抗原賦活化溶液に浸します。抗原賦活化バッファーを低電力(20W)で20分間再加熱します。
    4. 電子レンジの電源を切り、抗原賦活化バッファーを室温(RT)まで冷まします。
    5. 切片を0.1 mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で毎回5分間3回洗浄します。
    6. ブロッキング溶液(5%ウシ血清アルブミン)と室温で切片をインキュベートし、免疫グロブリンの非特異的結合をブロックします。
    7. 切片をウサギ抗NeuN抗体(1:300)、ウサギ抗Iba-1抗体(1:500)、およびマウス抗GFAP抗体(1:500)と4°Cで一晩インキュベートします。
    8. 切片を0.1 mM PBSで毎回5分間3回洗浄します。
    9. 切片をヤギ抗ウサギAlexa 594標識IgG(1:500)またはヤギ抗マウスAlexa 488標識IgG(1:500)と室温で1時間インキュベートします。
    10. 切片を0.1 mM PBSで洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む退色防止封入剤で埋入します。
    11. 虚血性半影内の3つの微視的視野(300 μm×300 μm)を、それぞれ594 nmと488 nmの蛍光顕微鏡で撮影します。
    12. ImageJソフトウェア(https://imagej.net/software/imagej/index)を使用して、虚血性半影19のカウントを平均することにより、陽性染色された細胞密度を推定する。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dMCAOを実行するために使用される主要な機器は、 図1に示す顕微手術器具セット、イソフルラン気化器、およびモノポーラ顕微手術電気凝固発生器です。この研究の実験手順を 図2に示します。簡単に言うと、遠位MCAを露出させるために小さな骨窓開頭術が採用され、その後、C57BL/6マウスに永久的な限局性脳虚血を誘発するために凝固されました。さらに、虚血性傷害と脳卒中の転帰は、dMCAO の 3 日後での TTC 染色、組織学的検査、および行動評価を通じて評価されました。外科的処置中に、外科的出血で死亡したマウスは1匹だけでした。さらに、残りのマウスは、手術後3日間の観察期間中に全員が生存しました。

肉眼観察により、dMCAOは皮質に目に見える充血と浮腫を引き起こすことが明らかになりました(図3A、下)。偽手術群では、識別可能な巨視的変化は観察されませんでした(図3A

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

開頭術電気凝固dMCAOモデルの現在のプロトコルでは、外科的処置は最小限の侵襲性で行われ、側頭筋の一部のみが分離され、咀嚼機能への悪影響を軽減します。マウスはすべて処置後、順調に回復し、摂食困難の事例は観察されませんでした。MCAはマウスの側頭骨で容易に識別できるため、適切な開頭術の位置を正確に特定することが容易になります。このdMCAOモデル誘発性虚血性病変は、皮質の外側部分に局在しており、Llovera G et al.13によって記述された以前の報告と一致しています。さらに、このモデルに関連する梗塞容積は約16%であり、大多数のヒト虚血性脳卒中症例で観察された梗塞容積と密接に一致している20。

いくつかの研究所では、開頭術の電気凝固dMCAOモデルを利用して、虚血性脳卒中の病態生理学とその薬理学的介入を調査しています。注目すべきは、上記の実験的研究の大部分が、脳卒中後のマウスの基本的な反射と四肢運動機能を評価するために、多様な評価尺...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らには、開示すべき対立する利益はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、湖北省自然科学財団からの助成金(2022CFC057)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム
クロリド(TTC)		Sigma-Aldrich108380TTC染色用色素
24ウェル培養プレートコーニング(米国)CLS3527TTC染色用容器
4%パラホルムアルデヒド武漢Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1101組織固定
5% ウシ血清アルブミンWuhan BOSTER Bio Co., Ltd.AR004非特異的抗原ブロッキング
5-0 ポリグリコール酸縫合Jinhuan Medical Co., LtdKCR531手術用材料
麻酔器ミッドマークコーポレーションVMR麻酔動物
退色防止封入媒体Beyotime BiotechP0131IF染色用シール
自動化-組織脱水 
machine		Leica Biosystems (ドイツ)TP1020脱
毛組織脱毛クリームVeet (フランス)20220328手術用材料
ジクロフェナク ナトリウム gelWuhan Ma Yinglong Pharmaceutical
 Co., Ltd.		H10950214動物用鎮痛剤
ドリルチップ(0.8mm)Rwd Life Science Co., Ltd.手術用機器
Eosin staining solutionWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1001H&用染料E staining
Eye ointmentGuangzhou Pharmaceutical Co., LtdH44023098手術用材料
蛍光顕微鏡オリンパス(日本)BX51画像取得
GFAP マウスモノクローナル抗体Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		3670ヤ
ギ抗マウス Alexa
488-conjugated IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		44082 番目の抗体 staining
Goat anti-rabbit Alexa
594-conjugated IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		88892 番目の IF 染色用
抗体 握力計Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.XR501行動試験用ヘ
マトキシリン染色液武漢Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1004H&用染料E染色
Iba1 ウサギモノクローナル抗体Abcamab178846IF染色用一次抗体
イソフルランRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10動物
レーザードップラー血流量計ムーアインスツルメンツ(英国)moorVMS血流モニタリング
メロキシカムベーリンガーインゲルハイムJ20160020動物用鎮痛剤
MicrodrillRWD Life Science Co., Ltd.78001手術
用顕微手術器具セットRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-R手術用機器
ミクロトームサーモフィッシャーサイエンティフィック (アメリカ)HM325組織切片製造
ミクロトームブレードライカバイオシステムズ (ドイツ)819組織切片製造
モノポーラ電気凝固装置スプリングシーナリー 医療機器
Co., Ltd.		CZ0001手術用機器
ムピロシン軟膏天津スミス クライン &French
Laboratories Ltd.		H10930064動物用抗感染
NeuN Rabbit モノクローナル抗体Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		24307一次抗体 IF 染色用
中性バルサムAbsin Bioscienceabs9177Seal for H&E染色
パラフィン包埋センターサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国)EC 350パラフィンブロックを生産
ペントバルビタールナトリウムシグマ・アルドリッチP3761安楽死動物
リン酸緩衝生理食塩水上海 Beyotime Biotech Co., LtdC0221A組織切片のすすぎ
シェーバーShenzhen Codos Electrical Appliances
Co.,Ltd.		CP-9200手術用ク
エン酸ナトリウム溶液Shanghai Beyotime Biotech Co.、Ltd.P0083IF染色のための抗原賦活化
糸 装置 麻酔 (英語)薬

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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