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方法論記事

糖尿病性腎症のラットモデルに対するJiawei Shengjiang Sanの拮抗効果:EGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路との関連

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DOI:

10.3791/66179

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2024年5月10日

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Hebei University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、糖尿病性腎症の治療におけるJiawei Shengjiang San(JWSJS)の作用機序を探求するためのネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を説明するプロトコルを紹介します。

要約

私たちは、糖尿病性腎症の治療とネットワーク薬理学の展開におけるJiawei Shengjiang San(JWSJS)の作用を支えるメカニズムを掘り下げることを目指しました。ネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を用いて、JWSJSの活性成分と標的を予測し、緻密な「薬物-成分-標的」ネットワークを構築しました。Gene Ontology(GO)とKyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)のエンリッチメント解析を利用して、JWSJSの治療経路と標的を特定しました。分子ドッキング検証のためにAutodock Vina 1.2.0をデプロイし、ドッキング結果を確認するために100nsの分子動力学シミュレーションを実施し、続いて in vivo 動物検証を行いました。その結果、JWSJSは糖尿病性腎症と227の交差する標的を共有し、タンパク質間相互作用ネットワークトポロジーを構築していることが明らかになった。KEGGの濃縮解析では、JWSJSは、脂質とアテローム性動脈硬化症、PI3K-Aktシグナル伝達経路、アポトーシス、HIF-1シグナル伝達経路を調節することにより、糖尿病性腎症を緩和し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ1(MAPK1)、MAPK3、上皮成長因子受容体(EGFR)、およびセリン/スレオニンプロテインキナーゼ1(AKT1)を複数の経路の集合的標的として同定したことが示されました。分子ドッキングは、JWSJSのコア成分(ケルセチン、パルミトレイン酸、ルテオリン)が水素結合を通じて3つの重要なターゲット(MAPK1、MAPK3、EGFR)とのコンフォメーションを安定させることができると主張しました。 In vivo 試験では、JWSJSによる体重の顕著な増加と、糖化血清タンパク質(GSP)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)、ウリジン三リン酸(UTP)、空腹時血糖値(FBG)の低下が示されました。ヘマトキシリンとエオシン(HE)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色と組み合わせた電子顕微鏡法は、p-EGFR、p-MAPK3/1、およびBAXのさまざまな減少を示し、治療されたラットの腎臓組織におけるBCL-2発現の増加を示す、さまざまな程度の腎臓障害を軽減する各治療群の可能性を強調しました。結論として、これらの洞察は、糖尿病性腎症に対するJWSJSの保護効果が、EGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路の活性化の抑制と腎細胞アポトーシスの緩和に関連している可能性があることを示唆しています。

概要

糖尿病(DM)は、糖尿病性腎症(DN)、網膜症、神経障害など、複数のシステムに影響を及ぼし、継続的な高血糖によるさまざまな合併症を引き起こす可能性のある慢性疾患です1。DNはDMの重篤な合併症であり、末期腎疾患(ESRD)の約30%〜50%を占めています2。その臨床症状は微量アルブミン尿症であり、糸球体容積の増加、中双眼間質過形成、および肥厚した糸球体基底膜を特徴とするESRDに進行する可能性があります3。DNの病因は複雑で、完全には解明されていません。血糖値を下げる、血圧を調節する、タンパク尿を減らすなどの臨床方法は、主にその進行を遅らせるために使用されますが、その効果は一般的です。

現在、DN4を治療する特定の薬剤は見つかっていません。しかし、何世紀にもわたって、漢方薬は糖尿病とその合併症の治療に広く使用されており5、 患者の臨床症状を改善し、疾患の進行を遅らせてきました。多成分、多標的、および多経路効果の利点により、漢方薬はDN6の治療のための革新的な薬物源になると期待されています。

「Shengjiang san」は、明代の医師Gong Tingxianによる「Wanbing Huichun」に由来します。「Neifu Xianfang」という本には、Bombyx Batryticatus、Cicadae Periostracum、Curcumaelongae Rhizoma、Radix Rhei et Rhizomeの使用が説明されています。これに基づいて、Hedysarum Multijugum Maxim、Epimrdii Herba、およびSmilacis Glabrae Rhixomaを追加した後、明晰さの増加、濁りの減少、停滞した「熱」の放出、および「気」と血液の調和という盛江山の機能を発揮します7,8。また、脾臓を強化し、腎臓を引き締める効果も高めます。その有効性は、DNの「気」が「生命エネルギー」の不足、過度の乾燥と「熱」、およびトリプルエナジャイザー7,8によって引き起こされる「熱」の停滞により、順不同で上昇および低下する病因と一致しています。

以前の臨床研究では、中国の漢方薬がDMとその合併症の治療に使用されていることが示されており、jiawei shengjiang san(JWSJS)は、血糖値と脂質を調節し、タンパク尿を減らし、早期DN7患者の臨床効果を大幅に改善することが示されています。JWSJSがDNラットの尿中タンパク質と血糖値を低下させる能力は、以前の研究によって確認されています。これはおそらく、TXNIP/NLRP3およびRIP1/RIP3/MLKLシグナル伝達経路を阻害し、足細胞ピロトーシスを減少させ、DNラットの腎組織における壊死性アポトーシスを予防することによって起こり、したがって腎保護を達成する9。JWSJSは、DNラットのネフリンおよびポドシンタンパク質の発現をアップレギュレートし、足細胞の損傷を軽減することができるため、JWSJSが足細胞の損傷に対して阻害効果があることが示唆されます。JWSJSには、安全性プロファイルが良好な特定の抗DN効果がありますが、それに関する研究はほとんどなく、この研究は主にピロトーシスと壊死性アポトーシスに焦点を当てています。文献は十分に深くない、または体系的ではありません10。これまでの知見から、JWSJSはDNラットのタンパク尿を減少させ、腎障害を緩和することが確認されている7。しかし、JWSJSのDN治療のメカニズムに関する研究は少なく、深化や体系化に欠けています。そこで、本研究は、ネットワーク薬理学を用いてJWSJSのDN治療における分子性物質と作用機序を解析し、今後の研究の基盤となることを目的としています。

ネットワーク薬理学は、ケモインフォマティクス、ネットワーク生物学、バイオインフォマティクス、薬理学など、薬物作用のメカニズムを研究するための新しい方法です11,12。ネットワーク薬理学の研究デザインは、伝統的な漢方薬の全体論的概念と非常によく似ています13,14、そしてそれは漢方薬のメカニズムを研究するための重要な方法です。分子ドッキングは、分子間の相互作用を研究し、それらの結合パターンと親和性を予測できます。分子ドッキングは、コンピュータ支援薬物研究の分野における重要な技術として浮上しています15。したがって、この研究では、ネットワーク薬理学および分子ドッキング法を通じてJWSJS-DN-標的相互作用ネットワークを構築し、JWSJSによるDN治療のさらなる探求のための信頼性の高い理論的基盤を提供します。

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プロトコル

すべての動物は、米国国立研究評議会実験動物の世話と使用に関するガイド、第8版に従って維持および使用され、ARRIVEガイドライン16,17で推奨されているように報告されました。この研究は、China National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(中国国家研究評議会実験動物の世話と使用に関するガイド)に従って実施され、河北中医薬大学(DWLL2019030)の動物倫理委員会によって承認されました。

1. JWSJS有効成分とターゲットコレクション

  1. 薬用組成物JWSJS(Hedysarum Multijugum Maxim、Epimrdii Herba、Smilacis Glabrae Rhixoma、Radix Rhei et Rhizome、およびCurcumaelongae Rhizoma)を伝統的な漢方薬システム薬理学データベースおよび分析プラットフォーム(TCMSP)データベース18に入力して、すべての化学成分を取得します。 吸収、分布、代謝、排泄(ADME)スクリーニング経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%および薬物様特性(DL)≥0.18化学成分19,20。
  2. TCMSPデータベース(https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php、バージョン2.3)を使用して、対応する化学成分のターゲットを取得します。
  3. Bombyx BatryticatusとCicadae Periostracumの有効成分は、Traditional Chinese MedicineとChemical Composition21を検索して入手できる。
  4. 実験の信頼性を確保するため、この研究にはChemical Abstracts Service(CAS)番号を持つ化合物を選択してください。次に、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/、2021年更新)から有効成分の2D構造図(.sdf形式)をダウンロードします22。
  5. SwissADME (www.swissadme.ch、2021 年に更新)23を使用して、薬物の類似性として胃腸 (GI) 吸収が高い成分 (Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge) をスクリーニングし、≥ 2 項目が「はい」でした。これにより、 Bombyx Batryticatus と Cicadae Periostracumの有効成分が生まれました。
  6. これらをTCMSPデータベースにインポートして、標的タンパク質予測(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php、バージョン2.3)18。
  7. UniProtデータベース(https://www.uniprot.org、2021年更新)のターゲットを標準化し、ステータスを レビュー済み 、種を ヒューマン24に設定します。

2. DN対応対象収集

  1. GeneCards(https://www.genecards.org/、バージョン5.1)25、OMIM(https://omim.org/、2021年更新)26、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/、2021年更新)27、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/、2021年更新)28、およびDrugBankデータベース(https://www.drugbank.ca/、2021年更新)29を通じて糖尿病性腎症を検索してください。結合および重複除去後のDNのターゲットを取得します。
  2. JWSJSとDNの共通ターゲットのスクリーニングとネットワーク構築
    1. JWSJSとDNの共通対象をR 4.2.0ソフトウェアでスクリーニングし、ベン図を描画します。JWSJSの有効成分と潜在的なターゲットをCytoscape 3.8.0ソフトウェア30 にインポートして、薬物、成分、ターゲット、および疾患間の接続を視覚化する Drug-Ingredient-Target ネットワーク図を構築します。
    2. ノードのサイズに次数値のサイズを反映させ、次数値が高いほど、ネットワーク内でノードがより重要であることを示します。
  3. PPIタンパク質間相互作用ネットワークの構築とコアターゲットのスクリーニング
    1. オンラインプラットフォームSTRING(Version:11.5)を使用して交差する遺伝子を分析し、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク31を構築します。 Multiple Protein 解析モードを使用してネットワークを構築し、種を Homo sapiens に設定し、必要最小限のインタラクション スコアを >0.930 に設定します。
    2. Cytoscape 3.8.0を使用して、ネットワークをトポロジ的に解析し、各ノードの媒介中心性(BC)、近接中心性(CC)、次数中心性(DC)、固有ベクトル中心性(EC)、局所平均接続性ベース法(LAC)、およびネットワーク中心性(NC)の値を計算し、すべての値が中央値32より大きい6つのノードをスクリーニングします。このプロセスを数回繰り返して、DN療法のためのJWSJSのコアターゲットを特定します。
  4. GO機能解析とKEGGパスウェイエンリッチメント解析
    1. GOおよびKEGGエンリッチメント解析を実施して、JWSJSおよびDNの一般的なターゲットに関連する生物学的プロセス、分子機能、細胞成分、および経路を特定します。
    2. 組織を使用します 。Hs.eg.db パッケージを使用して交差ターゲットの ID を取得し、 clusterProfiler の org.エンリッチメント分析のためのHs.eg.db、enrichplot、および ggplot2 パッケージ33。
    3. 補正されたP値が0.05の上位10の生物学的ヒットで機能的なGOエンリッチメント解析<スクリーニングし、KEGG解析のために最も濃縮度の高い上位30の経路を選択します。

3.分子ドッキング

  1. AutoDock Vinaソフトウェアを使用して、JWSJSコアコンポーネントとDN療法のコアターゲットとの間の分子ドッキングを実行します34。
  2. PubChemのデータベース内を検索し、JWSJSコアコンポーネントの2次元構造のsdfファイルを取得します。ChemBio 3D Ultra14.0ソフトウェアを使用して、3D構造を生成および最適化し、mol2形式で保存して、リガンドファイルとして使用します。
  3. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB) データベースから、コアターゲットの 3D 構造の pdb 形式を見つけてダウンロードします。Pymol 2.4.0ソフトウェアを使用して、タンパク質構造から水分子とリガンドを除去し、 pdb 形式で保存し、受容体ファイルとして使用します。
  4. 受容体pdbファイルをAutoDockTools 1.5.7ソフトウェアにインポートして水素化し、受容体タンパク質と低分子リガンドの両方をpdbqt形式に変換し、Spacing係数を1に設定して受容体タンパク質のアクティブポケットを設定します。
  5. 分子ドッキングにAutodock vina 1.2.0を使用し、結合エネルギーを計算します。Affinity < 0 の場合、分子がタンパク質と自発的に結合すると考えられ、Affinity の絶対値が大きいほど、分子間の結合がより安定していることを示します。最後に、Pymol 2.3.0およびLigPlot 2.2.5ソフトウェアを使用してドッキング結果を視覚化します。

4. 分子動力学シミュレーション

  1. Desmond ソフトウェアを使用して MD シミュレーションを実行するには、次の手順に従います。
    1. Desmondソフトウェアの2019-1アカデミックバージョンを使用して、タンパク質-リガンド相互作用の安定性と柔軟性を評価します。
    2. ドッキング研究から得られた最も有望な3つのリガンド複合体について、分子動力学(MD)研究を実施します。0.15 M NaCl の SPC 水溶液環境でシミュレーションを行い、生理学的イオン条件を再現します。シミュレーションボックスは、溶質が境界から少なくとも10 Å離れているように設計されています。対イオンは、システムの電荷を中和するために導入されます。さらに、OPLS 2005力場のパラメータによって制御される周期的な境界条件が適用されます。
    3. Desmond のデフォルト パラメーターを使用して、100 ps のエネルギー最小化フェーズを開始します。
    4. Nosé-HooverチェーンとMartyna-Tobias-Kleinの方法論により、26.85 °C(300 K)および1.01325 barでの温度と圧力の安定化をすべての生産MDシステムで確実に行うことができます。分子動力学シミュレーションは、2 fsのタイムステップで合計100 nsの時間ステップで実行され、100 psごとに原子座標が記録されます。
    5. シミュレーション相互作用図 (SID) モジュールを開きます。シミュレーション結果データ ファイルをモジュールに読み込みます。
    6. モジュールで利用可能なオプション(二乗平均平方根偏差[RMSD]、二乗平均平方根変動[RMSF]、水素結合解析など)から目的の解析タイプを選択します。選択した解析タイプに必要な追加のパラメータを指定します。
    7. [分析]または[開始]ボタンをクリックして、分析を実行します。
    8. 解析が完了したら、SIDモジュールインターフェース内で結果を表示して解釈します。必要に応じて、結果をエクスポートして、さらに使用したりプレゼンテーションしたりします。

5. 動物実験バリデーション

  1. 動物と実験デザイン
    注:この研究には、SPFグレードの動物生産施設から入手した75匹の雄のSprague-Dawleyラットが含まれ、8週齢で体重は150 g±20 gでした(動物生産証明書番号SCXK [Hebei] 2018-004)。
    1. ラットをSPFレベルの動物実験室に収容し、1週間の適応給餌後にラットを正常グループとモデルグループにランダムに分けます。正常グループには通常の食事を提供し、モデルグループには高糖質および高脂肪の食事を提供します。4週間後、ラットを絶食しますが、12時間水を与えないでください。
    2. モデルグループにストレプトゾトシン(STZ;35 mg·kg-1)の腹腔内注射を注入します。.72時間後、尾静脈採血を通じて血糖値をテストします。空腹時血糖値が≥16.7mmol・16.7mmol・L-1、成功した糖尿病モデルとしてそれを確認します。
    3. ラット腎臓の病理組織学的変化を観察することにより、DNモデルの成功を確認します。
    4. 正常に複製されたモデルを、4.37 g/kg、8.73 g/kg、および 17.46 g/kg で JWSJS を投与されたモデル グループ (臨床等価用量の 3.2、6.3、および 12.6 倍に相当) とイルベサルタン グループ (0.014 g/kg) にランダムに分けます。各グループは10匹のラットで構成されていました。すべての薬物を1日1回経口強制経口投与します。.この投与計画を4週間一貫して維持します。.
    5. 1% ペントバルビタールナトリウム (50 mg/kg) の腹腔内注射を使用してラットに麻酔をかけ、ペダル離脱反射の喪失により適切な麻酔を確認します。安楽死の前に腹部大動脈から血液サンプルを採取します。
    6. 150 mg / kgの用量でペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射を使用してラットを安楽死させた後、腎臓を採取します。.
      注:動物は、安楽死に関する最新の米国獣医師会(AVMA)ガイドライン(https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals)に従って、人道的に安楽死させられました。
  2. 腎組織学解析
    注:腎臓組織を4%パラホルムアルデヒドで固定し、48時間後にエタノールで脱水しました。切片はパラフィンに埋め込まれていました。切片を薄い(4μm)スライスに切断し、ヘマトキシリンとエオシン(HE)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色を行い、腎臓の組織学の形態学的変化を光学顕微鏡で観察しました。
    1. HE染色:
      1. 脱ロウと水分補給:組織切片をキシレンIおよびII(各10分)、無水アルコールIおよびII(各3分)で処理します。次に、組織切片を95%、90%、80%、および70%エタノールに浸し(各2分間)、続いて蒸留水で5分間洗浄します。
      2. 組織切片をヘマトキシリン染色液に5分間置き、塩酸アルコールで切片を5秒間分化します。
      3. 切片をエオシン染色溶液に3分間置きます。
      4. 脱水、清澄化、および取り付け:さまざまなエタノール(70%、80%、90%、95%、および無水エタノール)で切片をさまざまな時間に脱水し、次にキシレンIおよびIIで清澄化した後、中性ガムで取り付けます。
    2. PAS染色:
      1. ステップ5.2.1で説明した脱ロウ手順に従って、切片を過ヨウ素酸染色溶液で~8分間処理します。
      2. 切片を蒸留水で2分間すすぎ、その後、暗闇でシッフ試薬で15分間染色します。
      3. 切片をシッフ試薬で処理した後、水道水で10分間洗浄します。
      4. ヘマトキシリンを使用して切片を1分間対比し、HCl-アルコールで30秒間区別します。切片を水道水で再度5分間洗浄し、核を青色に着色します。
    3. 電子顕微鏡:
      1. サンプルを2.5%グルタルアルデヒドに3時間固定し、PBSで3時間すすぎます。さらに、サンプルを1%オスミン酸で3時間処理し、PBSで再度3時間すすぎます。
      2. アセトンで終わる段階的な一連のアルコール浴を通じて脱水します(各ステップは合計で約2時間続きます)。
      3. エポキシプロパンとエポキシ樹脂の混合物(1:1)を室温(RT)で2時間サンプルに浸透させ、続いて37°Cの純粋なエポキシ樹脂をさらに2時間浸透させます。
      4. この後、切片化する前に、36時間にわたってますます高温でサンプルを硬化および硬化させます。このプロセスにより、組織に樹脂が完全に浸透し、樹脂が硬化して電子顕微鏡用の薄いスライスが可能になります。
      5. 3%酢酸ウラニルと鉛酸で二重染色し、15分以内に電子顕微鏡でサンプルを観察および撮影します。
        注:透過型電子顕微鏡(TEM)の設定は、TEMシステムでの高コントラストモード(Zoom-1 HC-1)での倍率7000倍、加速電圧80.0kVです。
  3. 免疫組織化学
    1. 脱ロウ:組織切片をキシレンIとIIにそれぞれ10分間置きます。
    2. 水分補給:脱ロウした組織切片を無水エタノールIおよびIIにそれぞれ3分間連続して入れ、続いて95%、90%、80%、80%、および70%エタノールにそれぞれ2分間入れて再水和します。
    3. 抗原賦活化:組織切片を0.1Mクエン酸-クエン酸緩衝液に高圧で約5分間浸漬し、RTまで冷却します。
    4. ブロッキング:抗体の非特異的結合を防ぐため、組織切片を5%正常ヤギ血清と約37°Cで30分間インキュベートしてブロッキングします。
    5. 一次抗体のインキュベーション:一次抗体のp-EGFR(1:200に希釈)とp-MAPK3/1(1:200に希釈)を組織切片に加え、加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
    6. 二次抗体のインキュベーション:切片をPBSで3回洗浄し、ビオチン標識二次抗体(製造元の指示に従ってPBSで希釈)を切片に加え、37°Cで30分間インキュベートします。
    7. 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンワーキング溶液を37°Cで組織切片に塗布し、続いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して3回洗浄します。
    8. DAB開発では、切片をDAB開発溶液でインキュベートし(室温で暗所3分間)、蒸留水ですすいでください。DABは、酸化すると茶色に変わる酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の発色基質として機能します。
    9. 対比染色にヘマトキシリンを約2分間使用し、切片を1%塩酸アルコールで5秒間分別し、流水で洗浄して青色にします。
    10. 低濃度から高濃度までの一連のエタノールに切片を連続して配置し、キシレンIおよびIIで透明にして脱水し、切片を中性ガムでマウントします。
      注:この手順には、一晩の一次抗体インキュベーションを含めて、約18〜24時間かかります。
    11. 切片ごとに3つの視野(200倍)をランダムに選択し、画像解析ソフトウェアを使用して切片の染色結果を解析します。Image Pro Plus 6.0 ソフトウェアは、以下の手順に従って使用しました。
    12. まず、セクションの画像をソフトウェアにインポートします。
    13. 密度補正: 正確な結果を得るには、密度補正を実行します。
      1. [ Measure > Calibration > Intensity]に移動し>新しい> std. Optional Density > Options >Imageに移動します。次に、画像の空白領域をクリックして背景値を記録し、[ OK]をクリックして確認します。
    14. 測定パラメータの設定:面積と積分光学密度(IOD)を計算するための測定パラメータを設定します。
      1. 「 Measure (測定)」>「Count/Size」>「Measure」をクリックし>「Measurements」を選択します。 「Area(100)」 と 「IOD」を選択し、「 OK」をクリックします。
      2. 「Options」に移動し、「Dark Background on Sample, 4-Connect Pre-Filter」にチェックを入れ、「OK」をクリックします。
    15. 色の選択: 陽性率を正確に判断するには、色を選択して汚れた領域と汚れていない領域を検出します。
      1. [ Select Colors > Histogram Based > HSI] をクリックします。H値は写真に合わせて調整し、 S は変更せず、 I はゼロから背景値までの範囲にします。次に、[ 閉じる]をクリックして確認します。
      2. データ収集と計算: データ収集と計算を実行するには、名前、面積(合計)、およびIOD(合計)が選択されている [Measure > Data Collector > Layout] をクリックします。次に、「Count > Collect Now」>「Data List」をクリックして、データをエクスポートし、さらに分析または保存します。
        注:これにより、分析された総面積に対して存在するタンパク質の量を示すIOD /面積の観点から、各セクションでのタンパク質発現の半定量的測定が行われました。
  4. ウェスタンブロッティング
    1. 腎臓組織を入手し、細かく切ります。これらのピースを1.5 mLの遠心分離チューブに入れ、予冷したタンパク質溶解溶液(50 mM Tris [pH 7.4]、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% Deoxycholateナトリウム、0.1% Dodecyl Sufate [SDS])を加え、均質化します。
    2. 氷上に30分間置いてから、13400 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 得られたサンプルを-80°Cの冷凍庫で保存します。
    3. Bradford法を使用してタンパク質を定量します。
      1. Coomassie Brilliant Blueワーキング溶液を調製するには、試薬と蒸留水を1:4の比率で混合します。
      2. ブランク、標準タンパク質グループ、サンプルタンパク質グループの3つのグループを設定します。各グループに3 mLのCoomassie Brilliant Blueワーキング溶液を、ブランクグループに生理食塩水、標準グループに標準タンパク質、サンプルグループに抽出した上清タンパク質を加えます。
      3. 混合物を5分間放置した後、紫外線分光光度計を使用して吸光度値を測定します。
      4. 次の式を使用してサンプル濃度を計算します:タンパク質濃度(mg / mL)=(サンプル吸光度値/標準チューブ吸光度値)x標準タンパク質濃度x5。
    4. 各タンパク質サンプルに同量の6倍ローディングバッファーを添加します。100°Cで5分間煮沸してから分注し、さらに使用するまで-20°C冷凍庫で保存します。
    5. 標準的な電気泳動、ブロッティング、ブロッキングを行います。
      1. 12%分解能ゲルを使用して、標準的なSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行います。スタッキングゲルに100V、分離ゲルに120Vの定電圧を印加し、色素の前面がゲルの底に達するまで印加します。
      2. 湿式転写システムを使用して、4°Cの冷蔵室で100Vで2時間、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンにタンパク質を転写します。
      3. タンパク質の転写後、TBST中の5%無脂肪乳を含むメンブレンをRTで1時間ブロックします。
    6. 一次抗体EGFR (1:2,000)、p-EGFR (1:2,000)、MAPK3/1 (1:2,000)、p-MAPK3/1 (1:2,000)、Bcl-2 (1:2,000)、BAX (1:2,000)、および CAPDH (1:5,000) を TBST で 5% BSA で希釈します。これらの希釈した一次抗体を添加し、メンブレンを4°Cで一晩、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
    7. TBSTでメンブレンを3回洗浄した後、希釈した二次抗体(1:5,000)を加え、続いて1時間インキュベートします。カラー現像後、ImageJソフトウェアを使用してターゲットバンドの定量分析を行います。
  5. qPCR解析
    1. グループ化:サンプルをグループ(Control、DN、Irbesartan、JWSJS-L、JWSJS-M、JWSJS-H)に割り当てます。
    2. RNA抽出:組織均質化とRNA抽出を行い、その後、製造元の指示に従ってクロロホルム添加、遠心分離、およびRNA沈殿を行います。
    3. RNAの沈殿と洗浄:RNAをイソプロパノールで沈殿させ、エタノールで洗浄します。
    4. RNAの可溶化:RNAペレットを乾燥させ、DEPC処理水に溶解します。
    5. cDNA合成:製造元の指示に従って、特定の反応混合物を使用して逆転写を行います。
    6. qPCR増幅:qPCRには、GAPDH、MAPK3、MAPK1、およびEGFR用の特異的プライマーを使用し、製造元の指示に従って増幅を行います。
      プライマー配列は以下の通りであった:
      GAPDH:F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'、R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATCA-3';
      EGFR:F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3、R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'。

6. 統計的手法

  1. 適切なソフトウェア(SPSSなど)を使用して分析を実行し、測定データを平均±標準偏差として表します。データが正規分布と分散の均質性の基準を満たしている場合は、一元配置分散分析を使用してグループ間を比較し、ボンフェローニ法で多重比較を実行します。
  2. T2検定は、分散が均一でない場合に多重比較に使用します。 0.05 を統計的に有意であると考えます。

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結果

プロトコールに従い、OBとDLの設定された基準に従ったスクリーニングと重複排除後の分析から、JWSJSの90の有効成分が最終的に得られました。これらには、20種類の Hedysarum Multijugum Maxim、23種類の Epimrdii Herba、15種類の Smilacis Glabrae Rhixoma、16種類の Radix Rhei et Rhizome、4種類の Curcumaelongae Rhizoma、15種類の Cicadae Periostracum、および6種類の Bombyx Batryticatus 成分が含まれていました。JWSJSには多くの有効成分が含まれているため、20種類しか記載されていません( 表1参照)。重複排除後、JWSJSの有効成分に対応する396のターゲットが最終的に取得されました。

疾患関連遺伝子を探索した結果、最終的に3035個のDN関連標的遺伝子が合体・重複排除...

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ディスカッション

私たちの研究では、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、および in vivo 動物モデルの組み合わせを採用しました。重要なステップは、「薬物-成分-標的」ネットワークの確立であり、これはDNの治療におけるJWSJSの潜在的なメカニズムを特定するために重要であり、特にEGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路との相互作用に焦点を当てていました。

この研究では、特に分子ドッキングプロセスにおいて、予測の精度を高めるためにいくつかの変更を加えました。トラブルシューティングは主に、 in vivo 動物モデルの条件を最適化して、ヒトDNとの関連性を確保することに焦点を当てていました。JWSJSの主要な活性成分と標的を特定することにより、この研究は、DN治療の潜在的な薬剤候補としてのJWSJSのさらなる研究開発のための理論的基礎を提供します。

この研究では、DNの腎アポトーシスの減少におけるJWSJSの潜在的な作用機序を調査しました。分...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、中国河北省自然科学基金会(第H2019423037号)の一般プロジェクトの支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2回;SYBRグリーンqPCRマスターミックス Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
24-h 尿タンパク質定量化 (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidineShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
自動生化学分析装置日立製作所, 日本7170A
無水エタノールBiosharp, Tianjin,中国N/A
BAX 一次抗体&NBSP;米国アフィニティAF0120ラット
BCL-2 一次抗体 アフィニティ、米国AF6139ラット
BX53 顕微鏡オリンパス、日本BX53
クロロホルム代替品ECOTOP、広州、中国ES-8522
Desmond ソフトウェア ニューヨーク州ニューヨーク州、米国リリース 2019-1
デジタル恒温水浴常州 金丹 梁友 機器、中国DK-8D
EGFR 一次抗体 アフィニティ、米国AF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical、米国14900空
腹時血糖値(FBG)南京建城生物工学研究所N / A
FC型全波長酵素ラベルアナライザーMultiskan;サーモ、米国N/A
GAPDH 一次抗体 アフィニティ (米国AF7021ラット
糖化血清タンパク質 (GSP)南京 建城生物工学研究所N/A
透過型電子顕微鏡日立製作所H-7650
ヘマトキシリン/エオシン (HE) 染色液Servicebio 米国G1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS,USA 該当なし
Real-Time PCR Amplification Instrument AppliedBiosystems, USAiQ5 
イルベサルタン錠杭州サノフィファーマシューティカルN / A
イソプロパノールバイオシャープ、天津、中国N / A
 JWSJS granulesGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM イメージングシステムコダック、USAIS2000
低密度コレステロール (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies アフィニティ、米国AF0155ラット
医療用遠心分離機湖南省 Xiangyi 実験装置開発、中国 TGL-16K
ミニトランスブロット転写システムBio-Rad, 米国N/A
Mini-PROTEAN 電気泳動システムBio-Rad, 米国N/A
NanoVue Plus 分光光度計Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden111765 p-EGFR
一次抗体 Affinity, USAAF3044Rat
Junction-Schiff (PAS) staining solutionServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 一次抗体 Affinity, USAAF1015ラット
二次抗体 米国サンタクルーズsc-2357ウサギ
ストレプトゾトシンシグマ、米国S0130
SureScript First-Strand cDNA 合成キットGeneCopeia、米国QP056T
TriQuick 試薬Solarbio、北京、中国R1100
ウルトラクリーンワークベンチ蘇州精製装置、中国SW-CJ-1F 
) ズ

参考文献

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