マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

サマリー

ここでは、角膜を神経支配する感覚線維を損傷する3つの異なる方法を提案します。これらの方法は、マウスの軸索再生の研究を容易にします。これら3つの方法は、他の動物モデルにも適応可能であり、角膜神経支配の生理学と再生の研究に最適です。

要約

角膜は目を覆う透明な組織であり、クリアな視力に不可欠です。それは体内で最も神経支配された組織です。この神経支配は、目に感覚と栄養機能を提供し、角膜の完全性の維持に貢献します。この神経支配の病理学的破壊は、神経栄養性角膜炎と呼ばれます。これは、目の怪我、手術、または病気によって引き起こされる可能性があります。この研究では、臨床で一般的に遭遇する3つのタイプのケースを要約する方法で神経支配に損傷を与えるための3つの異なるプロトコルを提案します。

最初の方法は、眼科バリで上皮を擦り傷を負わせることからなる。これには、クリニックで行われる光屈折矯正角膜切除術と同様の方法で、上皮層、遊離神経終末、および基底神経叢の除去が含まれます。2番目の方法は、上皮の完全性を維持しながら、生検パンチで末梢を切片化することにより、神経支配のみを標的とします。この方法は、層状角膜形成術の最初のステップに似ており、神経支配の変性とそれに続く中心角膜の軸索の再成長につながります。最後の方法は、蛍光神経線維の焼灼部位を特異的に局在化する多光子顕微鏡を用いて、トランスジェニックマウスモデルの神経支配を損傷する。この方法は、紫外線に過度にさらされる光角膜炎と同じダメージを与えます。

この研究は、角膜神経支配、特に軸索の変性および再生の生理病理学を調査するためのさまざまな選択肢について説明しています。再生を促進することは、上皮欠損や角膜の穿孔などの合併症を回避するために重要です。提案されたモデルは、神経の再生を促進し、疾患の進行を制限する新しい薬理学的分子や遺伝子治療の試験に役立つ可能性があります。

概要

目の透明な表面である角膜は、上皮、間質、内皮の3つの異なる層で構成されています。この器官は、体内で最も神経支配の密度が高く、主に三叉神経節の眼科枝に由来する感覚線維(Aδ型およびC型)で構成されています。感覚線維は、間質中部で角膜の周囲を貫通し、表面を覆うように枝分かれする大きな束の形をしています。次に、それらは分岐してボウマン膜を突き刺し、角膜の中心に渦を形成することによって容易に認識できる基底下神経叢を形成します。これらの線維は、上皮の外表面で遊離神経終末として終端する。それらは、熱的、機械的、化学的刺激を伝達し、上皮の恒常性に不可欠な栄養因子を放出することができます^1,2。神経栄養性角膜炎(NK)は、角膜感覚神経支配に影響を与える変性疾患です。このまれな疾患は、角膜感受性の低下または喪失に起因し、その結果、涙液の産生が低下し、角膜の治癒特性が低下^{します3。}NKは、患者が上皮欠損に苦しむステージ1から、間質融解および/または角膜穿^{孔が発生するステージ}3まで、よく説明されている3つの段階を経て進行します4。

臨床的には、この病気の起源は多様である可能性があります。患者は、眼の身体的損傷、手術、または糖尿病などの慢性疾患によって角膜神経支配を失う可能性があります

プロトコル

すべての実験は、国家動物実験委員会によって承認されました。

1. 事前準備

1. 麻酔用のケタミンキシラジンの麻酔液を準備します。200 μL のケタミン (100 mg/mL) と 125 μL のキシラジン (20 mg/mL) を 2,175 mL の滅菌 0.9% NaCl で希釈することにより、ケタミンを 80 mg/kg で、キシラジンを 10 mg/kg で注入します。
2. 1,400 mLの滅菌0.9% NaClに0.3 mg/mLのブプレノルフィン100 μLを加えて、鎮痛溶液として0.02 mg/mLのブプレノルフィン溶液を調製します。
3. 蛍光染色液を調製します。
   1. 細かいスケールを使用して10 mgのフルオレセイン塩を秤量し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して0.1%フルオレセイン溶液を得ます。
   2. 溶液を光から保護し、5分間振とうします。10 mLのシリンジと0.2 μmのシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。
      注:蛍光溶液は光から保護する必要があり、+ 4°Cで5日間保存できます。
4. マウスの準備
   1. マウスに重みを付け、麻酔液のマウス重量(MW)10μL / gの腹腔内注射を行うことにより、麻酔を誘発します。マウスの動きが止まったら、加熱....

結果

この研究は、マウスの角膜神経支配に損傷を与えるためのいくつかのプロトコルを提案しています。同様のプロトコルは、上皮の治癒の生理病理学を調査するために使用されてきましたが、私たちは、角膜神経支配再生を調査する新しい方法を適応させ、開発することを選択しました。神経支配を観察するために、2つの手法を使用しました。まず、免疫蛍光法を用いて、汎ニューロン抗体(BIIIチューブリン)を用いて神経線維を染色し、インターカレーターを用いて核を染色しました。第二に、神経線維に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス株を利用した。角膜は落射蛍光顕微鏡を用いて画像化した。

最初の方法では、0.5mmの錆リング除去剤を備えた眼科用バリを使用して、角膜上皮層を除去しました(図1A)。この研究は、上皮の内部に位置する神経支配に生じる損傷に焦点を当て、その再生に関与する細胞および分子成分を理解する手段としています。手術前は、基底上皮は無傷でした。基底神経叢下の神経線維は、渦と呼ばれる典型的なパターンを形成しました(

ディスカッション

神経栄養性角膜炎はまれな疾患と考えられており、10,000人に5人が罹患しています。ただし、化学熱傷などの身体的傷害や、糖尿病や多発性硬化症などの症候群によるNKの罹患者は、^{これらの統計に}は含まれていません3。さらに、この状態は依然として著しく過小診断されており²²、この疾患の有病率は過小評価されています。患者の視力を維持する手段として、軸索の再生を促進する新しい治療法と治療法が強く求められています。現在、NKの初期段階に罹患している患者に提供される唯一の利用可能な治療法は、角膜神経の再生をサポートする薬理学的点眼薬^23,24,25の適用です。ただし、これらは特定のポイントまでしか有効ではありません。潰瘍などの角膜のより深刻な変化の場合、羊膜移植または角膜形成術^3,4

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 &マイクロ;m seringe	フィルターCLEARLINE	51733
0.5 mm錆リング除去剤	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mLプラスチックチューブ	Eppendrof
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
綿棒	任意のプロバイダー	N/A
解剖ツール	ファインサイエンスツール	N/A
フルオレセイン	メルク	103887冷
水魚の皮からのゼラチン	シグマ	G7765
ヤギ血清	メルク	S26
ヘッドホルダー	ナリシゲ	SGM 4
加熱プレート	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	フランスの販売承認番号: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume Computational Clearing(LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
レーザーパワーメーター	コヒーレント	N/A
ライカ サンダーイメージャー 組織顕微鏡	ライカ	N/A
多光子 ツァイス LSM 7MP 直立顕微鏡	ツァイス	N/A
Ocry-gel	TVMラボ	N/A
パラメトリック発振器	コヒーレント	N/A
ペンライト 青コバルトフィルターキャップ	Bernell	ALPEN
ペトリ皿	Thermo Scientific	150318	軸切開プロトコル
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea ホールマウント処理
Rompun 2%	Elanco	N/A	フランスの販売承認番号: FR/V/8146715 2/1980
滅菌生検パンチ 2.5 mm	LCH 医療	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	封入剤

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