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方法論記事

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

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⸱

DOI:

10.3791/66182

⸱

2023年12月8日

 ,  ,  , 
1Institute for Neurosciences of Montpellier, University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology, Gui de Chauliac Hospital

この記事について

サマリー

ここでは、角膜を神経支配する感覚線維を損傷する3つの異なる方法を提案します。これらの方法は、マウスの軸索再生の研究を容易にします。これら3つの方法は、他の動物モデルにも適応可能であり、角膜神経支配の生理学と再生の研究に最適です。

要約

角膜は目を覆う透明な組織であり、クリアな視力に不可欠です。それは体内で最も神経支配された組織です。この神経支配は、目に感覚と栄養機能を提供し、角膜の完全性の維持に貢献します。この神経支配の病理学的破壊は、神経栄養性角膜炎と呼ばれます。これは、目の怪我、手術、または病気によって引き起こされる可能性があります。この研究では、臨床で一般的に遭遇する3つのタイプのケースを要約する方法で神経支配に損傷を与えるための3つの異なるプロトコルを提案します。

最初の方法は、眼科バリで上皮を擦り傷を負わせることからなる。これには、クリニックで行われる光屈折矯正角膜切除術と同様の方法で、上皮層、遊離神経終末、および基底神経叢の除去が含まれます。2番目の方法は、上皮の完全性を維持しながら、生検パンチで末梢を切片化することにより、神経支配のみを標的とします。この方法は、層状角膜形成術の最初のステップに似ており、神経支配の変性とそれに続く中心角膜の軸索の再成長につながります。最後の方法は、蛍光神経線維の焼灼部位を特異的に局在化する多光子顕微鏡を用いて、トランスジェニックマウスモデルの神経支配を損傷する。この方法は、紫外線に過度にさらされる光角膜炎と同じダメージを与えます。

この研究は、角膜神経支配、特に軸索の変性および再生の生理病理学を調査するためのさまざまな選択肢について説明しています。再生を促進することは、上皮欠損や角膜の穿孔などの合併症を回避するために重要です。提案されたモデルは、神経の再生を促進し、疾患の進行を制限する新しい薬理学的分子や遺伝子治療の試験に役立つ可能性があります。

概要

目の透明な表面である角膜は、上皮、間質、内皮の3つの異なる層で構成されています。この器官は、体内で最も神経支配の密度が高く、主に三叉神経節の眼科枝に由来する感覚線維(Aδ型およびC型)で構成されています。感覚線維は、間質中部で角膜の周囲を貫通し、表面を覆うように枝分かれする大きな束の形をしています。次に、それらは分岐してボウマン膜を突き刺し、角膜の中心に渦を形成することによって容易に認識できる基底下神経叢を形成します。これらの線維は、上皮の外表面で遊離神経終末として終端する。それらは、熱的、機械的、化学的刺激を伝達し、上皮の恒常性に不可欠な栄養因子を放出することができます1,2。神経栄養性角膜炎(NK)は、角膜感覚神経支配に影響を与える変性疾患です。このまれな疾患は、角膜感受性の低下または喪失に起因し、その結果、涙液の産生が低下し、角膜の治癒特性が低下します3。NKは、患者が上皮欠損に苦しむステージ1から、間質融解および/または角膜穿孔が発生するステージ3まで、よく説明されている3つの段階を経て進行します4。

臨床的には、この病気の起源は多様である可能性があります。患者は、眼の身体的損傷、手術、または糖尿病などの慢性疾患によって角膜神経支配を失う可能性があります5,6。今日まで、NKの病因プロセスは十分に理解されておらず、この視力を脅かす状態に対する治療オプションは非常に限られています。したがって、上皮欠損の特徴をよりよく理解して、これらの繊維の再生の背後にあるメカニズムをよりよく理解し、潜在的にそれらを促進する必要があります。本研究では、マウスにNKを誘導する角膜損傷のモデルをいくつか提案する。

最初のモデルは、眼のバリによる角膜の上皮層の摩耗です。このモデルは、主にげっ歯類や魚などのさまざまな動物の上皮の再生の文脈で研究されており7,8,9、角膜の治癒を促進する分子をテストするために研究されています10,11。生理学的には、上皮細胞が傷口を閉じるのに2〜3日かかります。しかし、神経支配の生理学的パターンは、擦り傷から回復するのに4週間以上かかります12,13。手術中、眼球バリは、基底神経叢と線維の自由神経終末を含む角膜の上皮層を除去します。この手順は、眼の屈折異常を矯正するために光屈折矯正角膜切除術(PRK)の患者と臨床的に比較できます。この手順は、角膜の上皮を除去し、次にレーザーで間質を再形成することからなる14。患者は、そのような手術後に、2年間の角膜神経密度の低下や、術後3か月から1年間の感度の低下など、いくつかの副作用を経験する可能性があります15。手術が角膜微小環境の脆弱性を誘発することを考えると、このモデルは、これらの副作用を調査し、より速い再神経支配を促進し、問題の副作用を軽減する治療アプローチを開発するのに役立つ可能性があります。

2番目のモデルは、角膜の周囲にある軸索を生検パンチで切断し、中枢神経支配のウォーラー変性を誘発することからなる 16。臨床的には、この方法は、外科医が角膜の部分的なトレフィネーションを実現して角膜の前方の厚さの一部を除去し、それをドナー移植に置き換える前層角膜形成術と比較することができます 17。層状角膜形成術後、患者はドライアイ、角膜神経支配の喪失、移植片拒絶反応など、多くの症状に苦しむことがあります18。角膜神経に対して実施されたこの軸索切開モデルは、移植後に起こり、その後軸索が再生する線維変性のメカニズムに関する洞察を提供する可能性がある。

3番目の方法は、レーザーで角膜神経を損傷します。麻酔をかけた動物の角膜に多光子顕微鏡を用いると、活性酸素種(ROS)の形成の結果として、光学野に局在する神経の変性が誘発され、DNA損傷や細胞キャビテーションを引き起こす19。この方法は、自然紫外線への過度の曝露(日焼け)によって引き起こされる角膜の光損傷を再現し、これもROS形成を引き起こし、DNA損傷を引き起こします20。角膜の日焼けに苦しむ患者は、上皮細胞の劣化が角膜線維の四肢のすべてを奪うため、大きな痛みを経験します。

ここで説明する3つの方法は、NKの病因プロセスと軸索再生の調査を可能にするように設計されています。それらは簡単に再現可能で正確です。さらに、動物の迅速な回復と簡単な監視を可能にします。

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プロトコル

すべての実験は、国家動物実験委員会によって承認されました。

1. 事前準備

  1. 麻酔用のケタミンキシラジンの麻酔液を準備します。200 μL のケタミン (100 mg/mL) と 125 μL のキシラジン (20 mg/mL) を 2,175 mL の滅菌 0.9% NaCl で希釈することにより、ケタミンを 80 mg/kg で、キシラジンを 10 mg/kg で注入します。
  2. 1,400 mLの滅菌0.9% NaClに0.3 mg/mLのブプレノルフィン100 μLを加えて、鎮痛溶液として0.02 mg/mLのブプレノルフィン溶液を調製します。
  3. 蛍光染色液を調製します。
    1. 細かいスケールを使用して10 mgのフルオレセイン塩を秤量し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して0.1%フルオレセイン溶液を得ます。
    2. 溶液を光から保護し、5分間振とうします。10 mLのシリンジと0.2 μmのシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。
      注:蛍光溶液は光から保護する必要があり、+ 4°Cで5日間保存できます。
  4. マウスの準備
    1. マウスに重みを付け、麻酔液のマウス重量(MW)10μL / gの腹腔内注射を行うことにより、麻酔を誘発します。マウスの動きが止まったら、加熱したプレート(37°C)の上に置き、足の指をつまんで完全に麻酔をかけていることを確認します。
    2. 手術を受けている眼に人工涙液を一滴、反対側の眼球に眼球ジェルを一滴垂らします。
    3. マウスがつまんでも反応しなくなったら、鎮痛剤(0.02 mg/mLブプレノルフィン)を5 μL/gのMWに注射し、0.1 mg/kgのブプレノルフィンを首の皮下投与します。

2.角膜の擦り傷

  1. ステップ1.3に従って、蛍光染色液を調製します。
  2. 手順1.4に従って、マウスを準備します。
  3. 摩耗を行う前に、眼のバリを70%EtOHに浸し、次にPBSに浸して洗浄します。
  4. マウスを側面の加熱プレート(37°C)に置き、手術を受けている眼に簡単にアクセスできるようにします。
    1. 綿棒を使用して人工涙液を吸収し、目に触れずにまつげを払い落とします。
    2. 眼球バリをオンにし、マウスのまぶたを2本の指で開き、同時に振動をブロックして、バリに詰まらないようにします。
  5. 瞳孔または目の中心を定在させ、眼の表面に眼球のバリを塗り、円を描く運動をします。よく見ると、切除した上皮の表面が観察できます。それ以外の場合は、角膜で約20回の円運動を行います。
  6. マウスを腹の上に戻し、眼球ゲルが反対側の目にまだ存在するかどうかを確認します。
  7. 蛍光染色液を擦り傷のある眼に一滴垂らし、20秒待ちます。目に触れずにティッシュで滴を吸収し、人工涙液の滴ですすいでください。人工涙液の滴をティッシュで吸収し、青いコバルトランプで目を照らします。
    注:摩耗は円形である必要があります。それを得るには、ある程度のトレーニングが必要です。
  8. 擦り傷を負った目に眼球ジェルを一滴垂らし、加熱したパッドの上でマウスを目覚めさせます。マウスが勝手に動いたら、ケージに戻します。
  9. 次の2日間、動物の健康状態を確認してください。
  10. 眼球バリを使用した後、軟部組織を使用してバリの頭に付着した上皮細胞を除去し、70%EtOHに浸してからPBSに浸します。
    注意: 上皮細胞が軟部組織で除去されたら、組織の破片がバリの頭に詰まっていないことを確認してください。

3.角膜神経の軸索切開

  1. 手順1.4に従って、マウスを準備します。
  2. マウスを側面の双眼ルーペの下に置き、手術を受けている目にアクセスします。ペトリ皿の底をマウスの頭の下に置き、目が水平になるようにします。
    注意: 次の手順は、双眼鏡ルーペを覗いて実行されます。
  3. 綿棒で人工涙液を取り除き、目に触れずにまつげを取り除きます。
  4. 動物を軌道から飛び出すために、動物の目の下に滑らかな湾曲したペンチを置きます。圧力がかかると目が眼窩に戻らないように、視神経の損傷を防ぐために過度にペンチを閉じてください。
  5. 2.5mmの生検パンチを圧力なしで眼に垂直に適用し、パンチが角膜の表面に完全に接触するようにします。
    注:角膜にパンチを当てると、実験者の手が視野を妨げる可能性があります。
  6. 次に、圧力をかけ始め、パンチを数回ひねります。
    注意: 圧力によって、ねじれの数は異なる場合がありますが、一般的には約5です。適切な圧力と動きを感じるためのトレーニングが必要です。圧力がかかりすぎると、目が破裂します。この場合、液体が病変から出て、目が柔らかくなるのが観察できます。動物は生贄にされなければならない。
  7. 生検パンチを取り外します。生検パンチが適用された角膜に円が見える必要があります。
    注意: 次の手順では、双眼ルーペは必要ありません。
  8. 反対側の眼にまだ眼球ゲルがあるかどうかを確認し、軸索切除された眼にいくつか塗布します。
  9. マウスを加熱パッド(37°C)でウェイクアップさせ、マウスが自力で動いているときはケージに戻します。
  10. 次の2日間、動物の健康状態を確認してください。

4.角膜ホールマウント処理

  1. サンプルの収集と固定。
    1. マウスの体重を量り、麻酔液のマウス重量(MW)10 μL/gの腹腔内注射を行うことにより、麻酔を誘発します。
    2. つま先をつまんでマウスの動きが止まり、反射神経がなくなったら、頸椎脱臼を行います。
    3. 2本の指で眼窩から眼球を飛び出し、湾曲したハサミで視神経を切断して眼球を摘出します。
    4. PBSを含む2 mLのプラスチックチューブに眼球を入れます。
    5. PBSを4%パラホルムアルデヒドに交換し、室温(RT)で20分間シェーカー(30rpm)に置いて、アイを固定します。
    6. シェーカー(30rpm)の室温でPBSで10分間3回すすぎます。
  2. 角膜の解離
    1. ペトリ皿内のパラフィルムにPBSを一滴垂らします。
    2. このPBSの滴に目を置きます。
    3. ペトリ皿を双眼鏡ルーペの下に置きます。
    4. マイクロダイセクションハサミと鉗子を使用して角膜を解剖します。辺縁を保つために毛様体の上に切り込みます。
    5. 水晶体、毛様体、虹彩を細かい鉗子で取り除きます。
    6. 角膜を2mLのプラスチックチューブに戻します。
  3. 免疫蛍光プロトコール
    1. 角膜を2.5%魚皮ゼラチン2mL、5%ヤギ血清、0.5%界面活性剤のPBS溶液中で、シェーカー(30rpm)の室温で1時間インキュベートします。
    2. 1/1000に希釈した一次抗体(抗βIIIチューブリン抗体)を含むPBSに2.5%の魚皮ゼラチン、5%のヤギ血清、0.1%界面活性剤の溶液150μLで角膜をシェーカー(30rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
    3. 0.1% 界面活性剤 PBS を室温でシェーカー (30 rpm) で 1 時間 3 回すすぎます。
    4. 角膜をステップ4.3.2と同じ溶液にインキュベートし、1/500に希釈した二次抗体を入れ、シェーカー(30rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
    5. シェーカー(30rpm)の室温でPBSで1時間3回すすぎます。
    6. 角膜を150 μLのDNAインターカレーターで1/5000に希釈し、室温でシェーカー(30 rpm)で10分間インキュベートします。
    7. PBSで5分間2回すすぎます。
  4. 角膜の取り付け
    1. 角膜をスライドの上に置き、上皮をスライドに向け、メスを使って中心に届かないように4つのセクションを作成します。
      注意: 花の形を形成するために、互いに反対のセクションを行います。
    2. 角膜内皮をスライドに向けて置き、ティッシュを使用して角膜の周りのPBSを取り除きます。
      注意: 角膜の下のPBSを取り外さないでください。そうしないと、気泡が現れることがあります。その場合は、角膜にPBSを加え、気泡を取り除きます。次に、手順4.3.2からやり直します。
    3. 長方形のカバーガラスの四隅にモデルペーストを追加します。
      注:角膜は厚い組織であるため、モデルペーストはカバーガラスを持ち上げます。
    4. 50 μLの封入剤を角膜に滴下し、気泡が形成されないようにカバーガラスを慎重に上に置きます。
    5. カバーガラスをマニキュアで密封します。
  5. イメージング
    1. スライドを落射蛍光顕微鏡の下に置きます。
    2. モザイクのサイズと画像の深度を定義し、取得を開始します。
    3. 取得した画像にぼかし除去およびデコンボリューションプログラムを適用します。
      注:ステップ 4.6.3 は、データ取得ソフトウェア (Large Volume Computational Clearing [LVCC]) で選択されるオプションです。

5.角膜神経の局所レーザーアブレーション

  1. 直立した多光子顕微鏡と、光パラメトリック発振器と組み合わせたレーザーの電源を入れます。顕微鏡の加熱ステージ(37°C)を作動させ、マウスモデルに必要な波長に対応する850 nmと1100 nmにレーザーを設定します。
  2. パワーメーターを使用して、レーザーの出力を約20mWに同時に設定します。
  3. 手順1.4に従ってマウスを準備し、両眼に眼球ジェルを塗布します。
    注:このプロトコルに使用される動物は、角膜神経線維の内因性蛍光色素を発現するトランスジェニックマウス系統(MAGIC-Markerトランスジェニックマウス21)に由来する必要があります。
  4. 動物をヘッドホルダーに取り付けます。動物を90°回転させて、目的の目が天井を向くようにします。
  5. 動物のビブリッセをストラップで縛って、目の周りをきれいにします。動物の体を縛って、呼吸によって引き起こされる頭の動きを軽減します。
  6. 眼球ジェルの上の目の円形のカバースリップを配置します。カバーガラスは水平でなければなりません。カバーガラスが正しく配置されるように、動物の頭を動かすことを躊躇しないでください。
  7. カバーガラスの上にPBSを一滴加えます。動物を顕微鏡ステージに慎重に置き、対物銃塔を適切な距離にセットします。
  8. 水性20倍対物レンズと落射蛍光を使用して、眼と接眼レンズを介した神経支配の位置を特定します。
  9. レーザーをアクティブにして、照らす必要がある深度を定義します。
  10. 1024 x 1024(ピクセル)の画像を最大スキャン速度の70%〜85%の取得速度で取得します。
  11. 画像が取得されたら、動物を顕微鏡から取り出し、カバーガラスとストラップを取り外します。動物をヘッドホルダーから取り外し、必要に応じて眼球ジェルを追加し、加熱したプレートのケージで目を覚まします。
    注:神経支配の破壊は、イメージングの1週間後に観察できます。このプロトコルは、レーザーによって引き起こされる損傷を増やすために、週に一度数週間繰り返すことができます。
  12. 動物が自力で動いたら、ケージを厩舎に戻し、次の2日間の健康状態を確認します。

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結果

この研究は、マウスの角膜神経支配に損傷を与えるためのいくつかのプロトコルを提案しています。同様のプロトコルは、上皮の治癒の生理病理学を調査するために使用されてきましたが、私たちは、角膜神経支配再生を調査する新しい方法を適応させ、開発することを選択しました。神経支配を観察するために、2つの手法を使用しました。まず、免疫蛍光法を用いて、汎ニューロン抗体(BIIIチューブリン)を用いて神経線維を染色し、インターカレーターを用いて核を染色しました。第二に、神経線維に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス株を利用した。角膜は落射蛍光顕微鏡を用いて画像化した。

最初の方法では、0.5mmの錆リング除去剤を備えた眼科用バリを使用して、角膜上皮層を除去しました(図1A)。この研究は、上皮の内部に位置する神経支配に生じる損傷に焦点を当て、その再生に関与する細胞および分子成分を理解する手段としています。手術前は、基底上皮は無傷でした。基底神経叢下の神経線維は、渦と呼ばれる典型的なパターンを形成しました(

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ディスカッション

神経栄養性角膜炎はまれな疾患と考えられており、10,000人に5人が罹患しています。ただし、化学熱傷などの身体的傷害や、糖尿病や多発性硬化症などの症候群によるNKの罹患者は、これらの統計には含まれていません3。さらに、この状態は依然として著しく過小診断されており22、この疾患の有病率は過小評価されています。患者の視力を維持する手段として、軸索の再生を促進する新しい治療法と治療法が強く求められています。現在、NKの初期段階に罹患している患者に提供される唯一の利用可能な治療法は、角膜神経の再生をサポートする薬理学的点眼薬23,24,25の適用です。ただし、これらは特定のポイントまでしか有効ではありません。潰瘍などの角膜のより深刻な変化の場合、羊膜移植または角膜形成術3,4

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、トランスジェニックマウス系統MAGIC-MarkersへのアクセスについてKarine Loulier博士に感謝の意を表します。また、著者らは、フランス国立研究機関が支援するフランス・バイオイメージングの国家インフラの一員であるRAM-Neuro動物コア施設とイメージング施設MRIにも感謝している(ANR-10-INBS-04, "Investments for the future")。本研究は、ATIP-Avenirプログラム、Inserm、Région Occitanie、モンペリエ大学、フランス国立研究機関(ANR-21-CE17-0061)、Fondation pour la Recherche Médicale(FRM再生医療、REP202110014140)、Groupama Foundationの支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 &マイクロ;m seringeフィルターCLEARLINE51733
0.5 mm錆リング除去剤Alger Equipment CompanyBU-5S
2 mLプラスチックチューブEppendrof 
Algerbrush burr, Complete instrumentAlger Equipment CompanyBR2-5
Anti-beta III Tubulin antibodyAbcamab18207
AntigenfixDiapathP0016
Artificial tearLarmes artificielles MartinetN/A
BuprecareAnimalcareN/A
綿棒任意のプロバイダーN/A
解剖ツールファインサイエンスツールN/A
フルオレセインメルク103887冷
水魚の皮からのゼラチンシグマG7765
ヤギ血清メルクS26
ヘッドホルダーナリシゲSGM 4
加熱プレートBIOSEB LAB instrumentsBIO-HE002
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Imalgene 1000BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH FranceN/Aフランスの販売承認番号: FR/V/0167433 4/1992
LAS X softwareLeicaN/ALarge volume Computational Clearing(LVCC) process
Laser Chameleon Ultra IICoherentN/A
レーザーパワーメーターコヒーレントN/A
ライカ サンダーイメージャー 組織顕微鏡ライカN/A
多光子 ツァイス LSM 7MP 直立顕微鏡ツァイスN/A
Ocry-gelTVMラボN/A
パラメトリック発振器コヒーレントN/A
ペンライト 青コバルトフィルターキャップBernellALPEN
ペトリ皿Thermo Scientific150318軸切開プロトコル
PetridishThermo Scientific150288Cornea ホールマウント処理
Rompun 2%ElancoN/Aフランスの販売承認番号: FR/V/8146715 2/1980
滅菌生検パンチ 2.5 mmLCH 医療LCH-PUK-25
Triton X-100VWR0694
VectashieldEuroBioSciencesH-1000封入剤
30120094

参考文献

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