方法論記事

スリッパカサガイ、Crepidula fornicataの幼虫の実験室および野外培養

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DOI:

10.3791/66208

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2024年1月5日

1Department of Biology, Dickinson College

この記事について

サマリー

この論文では、腹足類 Crepidula fornicata の幼生培養の方法を、少量の実験室スケールのシステムと、野外に展開可能な常温海水メソコズムシステムでの方法を紹介しています。

要約

カリプトラエイド腹足類の軟体動物であるCrepidula fornicataは、幼虫の発生生物学、生理学、および生態学の研究に広く使用されています。この種の陰雛性ベリガー幼虫は、成虫による自然放出後にふるいに吸い上げて収集し、200 / Lの密度で培養物に分配し、1 x 105細胞/ mLでIsochrysis galbana(T-ISO株)を給餌しました。殻の成長と変態能力の獲得は、周囲空気または定義された大気ガス混合物に対して平衡化するように設計された換気された800mL培養物で飼育された兄弟幼虫について文書化されました。これらの実験室培養条件とは対照的です。また、繁殖成虫の野外集団に位置する15Lのフロースルー環境海水メソコズムで飼育された幼虫の生育と能力のデータも収集されました。実験室培養における変成能力の成長率とタイミングは、以前に発表された研究で報告されたものと同様でした。野外で育てられた幼虫は、メソコズムは、実験室での研究で報告されているよりもはるかに速く成長し、早く変態しました。これらの方法を組み合わせることで、実験室で事前に決定された制御条件下で、および野外で自然に発生する条件下で幼虫の発育を調査するのに適しています。

概要

スリッパカサガイ、Crepidula fornicata(Gastropoda:Calyptraeidae)は、発生モデルとしての有用性と侵入種としての広範な影響により、現在および歴史的な研究文献でよく表されています。これは、古典的な実験発生学の時代における螺旋状発達の基礎的な例であり1、ロフォトロコゾアの初期発生のメカニズムを解剖するための現代のイメージングおよびゲノムツールの適用により、関心の復活を経験しました2,3。その生活史のもう一方の端では、他の調査は、北アメリカ東部の元の分布から遠く離れた温帯沿岸の海洋環境におけるこの生態系工学の成体集団の影響に焦点を当てています4,5。胚と成虫の間で、この種のベリガー幼虫は、幼虫の発育と生態学、特に成長と変態能力の獲得に影響を与える要因、幼虫の定着を媒介する内部および外部の手がかり、および幼虫の経験が幼若の成績に及ぼす影響に関する多数の研究の対象となってきました6,7,8,9,10,11 .最近の研究では、C. fornicataの幼虫と幼魚の海洋酸性化に対する回復力が明らかになり、この動物の生産的な研究利用のためのさらに別の道が開かれました12,13,14,15,16。

海洋幼生生物学の研究における C.fornicata の利点は、鞭毛虫 Isochrysis galbanaの単一食餌で実験室で天然または人工海水で比較的簡単に成長できることです。培養方法は、著者によって以前の方法に焦点を当てた印刷出版物17で詳述されています。現在の貢献の理由は2つあります。まず、文化の確立とケアに関連する日常的な物理的操作は、概念的には非常に単純ですが、実践的なデモンストレーションやビデオデモンストレーションなしで正しく実行することは困難です。次に、海洋酸性化、富栄養化、酸素枯渇などの環境ストレス要因に対する応答の実験室および野外研究に特に適した、前述の培養方法の2つのバリエーションについて説明します。1つ目は、少量の気泡ガスを介して海水中のpHや溶存酸素を操作するのに適した低容量(800mL)の培養システム、もう1つは、野外に設置でき、周囲の海水を自由に交換できる大容量(15L)のメソコズムシステムです。

プロトコル

1. C. fornicataの幼虫培養を確立し維持するための日常的な操作

注:この方法は、繁殖したベリガーの幼虫を放出したばかりの成虫 のC.fornicata を含む海水のガロン(3.8 L)の瓶から始まります。成体は、現場で収集されるか、 材料表 に記載されている供給者から入手することができます。成虫は原生性の雌雄同体で、交配スタックに生息し、スタックの下部には固着した雌がいます。大人のスタックを壊さないでください。繁殖の季節性と、季節外れの産卵のために成虫を条件付けする方法は、以前に説明されている17。幼虫は、放流後2〜3時間以内に採取するのが最善で、地理的に陰性が高く、瓶の表面近くに集中します。

  1. 400 mLの三角使い捨てプラスチックビーカーの底を切り取り、236 μmのナイロンメッシュのパネルに接着してふるいにかけます。この目的、特にメソコズム構造(下)には、ポリエチレンへの良好な接着性のために配合されたホットメルト接着剤を使用してください。
  2. 成虫の瓶からエアレーションを取り出し、破片が落ち着き、幼虫が水面に簡単に泳げるように、15〜20分間放置します。
  3. 上記のように準備された60〜80 cmの軟質プラスチック水槽用チューブの端に貼り付けられた短い長さ(15〜20 cm)の5 mmガラス管を介して幼虫をふるいにかけ、600 mLのガラスビーカーに吊り下げて、過剰な海水がガラスビーカーをオーバーフローさせ、幼虫がふるいに保持されるようにします。ふるいの底を水中に保ち、幼虫が座礁しないようにします。
  4. ふるいをビーカーから簡単に持ち上げ、ろ過された海水(FSW)の噴出ボトルを使用して、幼虫を低出力の解剖顕微鏡で操作するのに便利なサイズのFSWのガラスボウルにすすぎます。
    注:C. fornicataの幼虫は、塩分濃度30 ppt付近のろ過された天然海水、または塩分濃度32 pptまでのインスタントオーシャン人工海水で、20-25°Cで繁殖します。< 1 μmでのろ過は、実験室培養で問題を引き起こす可能性のあるファウリングする流行性原生生物を排除するのに十分です。
  5. パスツールピペットを使用して、必要な数の幼虫を培養ジャーに手動で移し、カウントします。最良の結果を得るには、 C. fornicataの培養量1匹/5mLを使用してください。幼虫を数え、数を推定する誘惑を避けてください。
  6. 培養が開始されたときには、微細藻類の所望の飼料を幼虫に給餌し、培養水が交換されるときは、一日おきに微細藻類を交換します。
    注:1 x 105 細胞/ mL Isochrysis galbana (T-ISO株)の食事は、実験室の成長率がほぼ最大になる優れた標準食です。T-ISOの食物配給と培養方法は、以前の出版物17で提供されています。
  7. 上記のステップ1.3のように、ビーカー内のふるいに培養物の内容物を注いで、一日おきに培養水を交換します。ふるいを持ち上げ、FSWの噴出ボトルを使用して、幼虫を新しい食物で新鮮なFSWの培養瓶にすすぎます。
    注:ベストプラクティスは、幼虫の培養に使用されるガラス製品を分離し、そのガラス製品が固定剤、可溶性重金属塩、または洗剤と接触しないようにすることです。定期的なクリーニングは、重曹(NaHCO3)のペーストとナイロン製のスクラブパッドで行うのが最適ですが、ミネラルの堆積物は、ホワイトビネガーまたは希釈HClのマイルド酸洗浄で取り除くことができます。

2. C. fornicata幼虫の換気培養物の構築

注:推奨されるガラス瓶(材料の表)には、海水に対して不活性で、換気ガス流のチューブバーブインレットを固定するための適切な厚さのポリプロピレン製の蓋が付いています。

  1. 各培養瓶の蓋(蓋の内側ライナーを含む)に、それぞれ端から約1.5 cmの反対側に5 mmの穴を2つ開けます。(13/64インチのインペリアルまたは#7 ASME標準の機械工のドリルビットも適切なクリアランス穴を作ります)。
  2. 10-32ナイロンナットを使用して、蓋の外面にチューブバーブが付いた状態で、各穴に1/8インチx10-32ネジ付きナイロンチューブアダプターを取り付けます。
  3. チューブアダプターの1つのねじ込み内側部分の開口部にシリコーンゴムアクアリウムシーラントを軽くたたき、長さ20 cmの2 mm(外径)ポリエチレンチューブを内側から開口部に押し込み、チューブバーブの外側の開口部から数mm突き出るようにします。
  4. チューブの端には、チューブのとげから突き出た水槽用シーラントの小さなプラグがありますが、とげの端のすぐ向こうに透明なチューブが見えます。シーラントを硬化させてから、ポリエチレンチューブの突き出た端をトリミングして、チューブのバーブの端と同じ高さになるようにします。
  5. 培養ジャーの上部の肩から1cm以内までFSWを培養ジャーに充填し、蓋をねじ込み、ポリエチレン製換気チューブを保持するチューブバーブに換気用空気または実験用ガス混合物の供給を取り付けます。換気チューブの長さをトリミングして、その端が瓶の底にきちんとくとくるようにします。
  6. 換気用空気またはガス混合物の流れを調整して、泡の流れを遅くします(図1)。一般的な水槽ギャングバルブを備えた水槽用エアポンプを使用して、周囲空気で換気を供給するか、他の実験用大気ガス混合物14にマスフローコントローラーを使用します。

3. C. fornicata幼虫の野外展開可能なメソコズム培養物の構築

  1. 標準的な7ガロンのポリエチレンバケツの側面に、それぞれ25 cm x 14.5 cmの等間隔の長方形の開口部を4つ切ります。各開口部の底を、バケツの内側の底から約3.5cmの位置に配置します(図2A)。この目的には、刃の細かい刃が付いたハンドヘルド電動サーベルソーが最適です。切り出したくずはそのままに、テーブルソーで縦に2cm幅にスライスします。
  2. 236 μmのナイロンメッシュのパネルを4枚、それぞれ30 cm x 20 cm以上切り取り、バケツの切り欠き開口部と快適に重なるようにします(少なくとも2 cm)。メッシュパネルの一方の端を、小さなスプリングクランプまたは洗濯ばさみを使用して、切り欠きの長い方の端に一時的に固定します。
  3. メッシュパネルの端をバケツの開口部に接着します ポリエチレン用に配合されたホットメルト接着剤。最初のエッジを固定したら、張力を維持しながら他のエッジを接着して、メッシュパネルの表面をぴんと張らせます。
  4. ステップ3.1からバケツの廃棄物片のストリップの長さをトリミングして、メッシュパネルがバケツの開口部と重なる接着領域をきれいに覆う補強ストリップを作成します。各カバーストリップをたっぷりのホットメルト接着剤で所定の位置に押し込み、接着剤が固まる前に各ストリップを所定の位置に素早く配置します。
  5. バケツの外側から取り付けたナイロンブラインドリベットで各ストリップの端を固定します。補強ストリップの外側の端から余分な接着剤とメッシュをユーティリティカミソリナイフでトリミングします。
    注意: 各リベットには15/64インチのパイロット穴が必要です。リベットの内部(ブラインド)部分は、 図2Bの完成したメソコズムの内側に見えます。
  6. メソコスムを、バケツの上部を水面から十分に上に保持するフローティングラックに展開します(図2C)。示されているフローティングラックは、2インチのスケジュール40PVCパイプの30cmセグメントから作られており、エルボージョイントとティージョイントでセメントで固定され、4つの複製メソコズムの列を保持できる気密構造になっています。
  7. 地域の状況によっては、メッシュパネルが1〜2日で汚れ、メソコスムを介した海水の交換が妨げられることがあります。これが発生する範囲で、汚れたメソコズムを水から2/3rd 引き出し、2 Lピッチャーでその底から新鮮なメソコズムに繰り返しベイリングすることにより、幼虫を新鮮できれいなメソコズムに移します。
  8. 20〜25回の反復を実行して、ほとんどの幼虫を移すか、汚れたメソコズムで幼虫が観察されなくなるまで転送します。重曹(NaHCO3)のペーストを詰めた柔らかいスポンジでメッシュパネルをやさしくこすり洗いし、水道水ですすいで、汚れたメソコズムをきれいにします。

結果

幼虫の成長と変態能力の獲得は、1つの卵塊から孵化し、1 x 105細胞/ mLの密度でIsochrysis galbanaを給餌した幼虫の兄弟バッチに由来する、それぞれ160匹の幼虫を含む800 mL換気培養物の4回の同時複製で測定されました。pHは7.9-8.0、温度は20-21°C、塩分濃度は30-31pptでした。成長と変態は、600匹の幼虫を含む15Lメソコズムの1回の試験でも、米国マサチューセッツ州バザーズベイに展開され、実験室の培養物と同様のpH、温度、塩分の条件下で展開されましたが、メソコズムのメッシュパネルを流れる周囲の海水中の天然植物プランクトンによって供給されました。測定されたpHは7.8-8.3、温度は20-24°C、塩分濃度は26-28pptでした。成長は、殻の長さの変化として決定されました(図3)。幼虫は、孵化後の最初の4〜5日間で、実験室培養物(54μm/日)よりもメソコズム(71μm/日)で速く成長しました(図4)。5日目から6日目にかけて、メソコズムの幼虫は自然に変態し始め、6日目にメソコズムに残った幼虫は、5日目よりも平均して181μm大きくなりました。メソコズムからのそれ以上の幼虫の測定はなかった、なぜならほとんどの個体が7日目までに変態していたからである。実験室培養中の幼虫は、4日目から8日目(41μm/日)および8日目から13日目(31μm/日)まで、はるかに遅い速度で成長しました。これらの幼虫は、8日目に変態に対して有能になり始め、8に記載されている[K +]が上昇したサブサンプルの刺激によって決定されるように、12日目までにほぼ全員が有能になりました。実験が終了した13日目まで、実験室の培養物(<10%)に自発的な変態はほとんどありませんでした。生存率は実験室培養で91%〜100%であり、メソコズムでは、メソコズムの体積と表面からすべての個体を検査して回復することが困難であったため、決定されませんでした。

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図1:換気された培養セットアップ。 図は、 Crepidula fornicataの幼虫を含む800 mLの換気培養物を示しており、1幼虫/5 mLの密度でストックされています。特に瓶2と4に見られる細い泡の流れに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:フィールド展開可能なメソコズム培養のセットアップ。 図はフローティングラックに展開された15Lメソコスム、(A)側面図、(B)上面図、(C)セットアップを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:孵化後4日目の Crepidula fornicata のヴェリガー幼虫。 破線はシェルの長さ測定の軸を示します。略語:s =シェル;v = ベルム;f =足;o = 蓋。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:実験室および野外培養における Crepidula fornicata の幼虫の成長。 800 mLの実験室培養物(破線、白丸)および15 Lフィールドメソコズム(実線、塗りつぶされた正方形)での幼虫の成長。各点は、4つの複製実験室培養のそれぞれからの15匹の幼虫の平均、または単一のメソコズムからの25匹の幼虫の平均を表します。エラーバーは±1SDです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

C. fornicataの幼生は、他のプランクトトローフの海洋幼生と比較して比較的培養が容易であるが、優れた培養実践の基本に注意を払うことは依然として不可欠である17,19。健康な幼虫は孵化後すぐに摂食を開始する必要があります。これは、孵化の翌日に、藻類細胞が詰まった腸全体を、透過照明付きの解剖顕微鏡を使用して観察することで簡単に確認できます。健康な幼虫の殻は、清潔で明るく、密集した文化で急速に広がる茎状の繊毛虫原生生物や固着性ペネート珪藻による目に見える汚れがないようにする必要があります。貝殻の汚れは、遊泳や摂食を阻害し、死亡を引き起こし、通常は培養物中の幼虫の密度が高すぎることを示しています。

ここで文書化された換気実験室培養における幼虫の成長率および能力のタイミングは、幼虫密度、pH、温度、塩分、および食物配給13,14,16の同様の条件下で、この方法の以前のバージョンを使用した実験室実験からの公表された結果と類似している。ここで説明した方法と後者の研究で使用された方法との唯一の実質的な違いは、本実験では、換気ガスの流れが、培養ジャーの表面のヘッドスペースを通過するのではなく、培養ジャーの底から泡の流れを生成する2mm(外径)チューブを介して導入されたことです。したがって、気泡流によって作り出される水の循環および混合は、幼虫の成長および能力の獲得に悪影響を及ぼさず、変化するガス混合物に対する培養海水の迅速な平衡化を必要とする実験、例えば、生産的な沿岸海洋環境で発生するようなCO2および溶解O2の分圧におけるディールサイクルの影響を調査する実験に利点を有する可能性がある20。21.

メソコズムの結果は、実験室での研究から発表されたものを超える幼虫の成長率をもたらし、また、変態のための能力の獲得までの最短時間をもたらしました22,23。本結果は、幼虫の成長と発達にとって明らかに非常に有利な圃場条件下で得られたものであるが、この方法は、管理と修復の目的で関心のあるリスクのある生息地や劣化した生息地など、環境ストレス要因の自然発生的な組み合わせを示す圃場での幼虫のパフォーマンスを調査するために最も有益であるはずである24。

開示事項

報告すべき利益相反はありません。

謝辞

少量換気培養システムの初期開発は、全米科学財団(CRI-OA-1416690からディキンソン大学へ)によって部分的に支援されました。Lauren Mullineaux博士は、このシステム(図4)のために提示されたデータが収集されたウッズホール海洋研究所の実験施設を提供してくれました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バケツ、ポリエチレン、7ガロン米国プラスチック16916、メソコズム
Crepidula fornicataMarine Biological Laboratory、Marine Resources Center、760大人の親魚
ホットメルト接着剤、Infinity Supertac 500Hotmelt.comINFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB
ジャー、ガラス、32オンス、ポリプロピレン蓋付きUlineS-19316P-Wfor 800 mL ventilated cultures
Nitex mesh, 236 & マイクロ;エムダイナミックアクアサプライ(株)NTX236-136メソコズム
用 ナット、六角、ナイロン、10-32 スレッドホーム デポ1004554441チューブ バーブを固定
リベット、ナイロン、ブラインド、直径 15/64 インチ、5/32 インチ -5/16 インチ グリップ範囲、8NAPA 自動車部品BK 66528444 パック メソコズムごとに必要
チューブ バーブ 1/8 インチ x 10-32 スレッドUS プラスチック65593培養瓶
ごとに 2 必要チューブ、ポリエチレン、外径2.08 mmフィッシャーサイエンティフィック14-170-11G、培養ジャー内のガス流を換気するための
、タイゴン、1/8 "x3/16" x1/32 "USプラスチック57810、換気培養用のバーブに適合し
ポリエチレンチューブはます

参考文献

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