方法論記事

細胞質内精子注入後のマウス仔の血糖値のモニタリング

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DOI:

10.3791/66212

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2024年5月17日

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

この記事について

サマリー

ここでは、ICSIに起因する可能性のあるグルコース代謝の加齢に伴う変化を観察できるように、細胞質内精子注入(ICSI)-胚移植(ET)マウスを確立するためのプロトコルを提示します。

要約

人間の寿命はかなり長いですが、マウスモデルは比較的短期間で人間の全寿命をシミュレートでき、マウスの寿命の1年は人間の約40年に相当します。細胞質内精子注入法(ICSI)は、臨床現場で一般的に使用される生殖補助医療です。しかし、約30年前に登場した比較的最近のことを考えると、この技術が人類の発展に及ぼす長期的な影響は不明のままです。本研究では、マウスモデルを用いたICSIと胚移植(ET)を組み合わせた法を確立しました。その結果、正常なマウス精子は、 体外 培養とその後の顕微授精を受けた後、受精率89.57%、2細胞受精率87.38%を示しました。ET後、子孫の出生率は約42.50%でした。さらに、マウスの老化に伴い、グルコース代謝レベルの変動が観察されましたが、これはICSI技術の適用に関連している可能性があります。これらの知見は、マウスICSI-ET技術が、精子異常が胚発生に及ぼす影響や、特に糖代謝に関して、精子の異常が子孫の健康に及ぼす長期的な影響を評価するための貴重なプラットフォームを提供することを示しています。この研究は、ICSI技術が人間の発達に及ぼす潜在的な影響に関するさらなる研究に重要な洞察を提供し、この技術の長期的な影響についての詳細な調査の必要性を強調しています。

概要

不妊症の問題は、特に出生率の低下と不妊症の重症度の増加、有病率および重症度が目立つようになった現代社会において、医学的および社会学的な懸念の主要な焦点として浮上しています。生殖補助医療(ART)は、これらの課題に取り組むための幅広い可能性を提供し、細胞質内精子注入法(ICSI)は治療的介入として一般的に利用されています。

1992年にパレルモが細胞質内精子注入法(ICSI)による妊娠成功を初めて報告して以来、ICSIは生殖補助医療(ART)1において極めて重要な技術となっています。しかし、ICSIが臨床現場で使用されてきたのはわずか30年と、人間の寿命に比べて比較的短い期間であることを考えると、ICSIの長期的な影響、特に子孫の発育への影響は広く調査および解明されていません。現在、遺伝的背景が均一で寿命が短いという特徴を持つマウスは、医学研究で広く利用されている代替モデルとして浮上しています。さらに、マウスモデルは、マウスの1年が人間の約40年に相当する圧縮された時間枠内で人間の全寿命を再現することができます2。

過去10年間で、いくつかの小規模な研究で、顕注によって妊娠した人は、人生の後半で異常な血糖値などのメタボリックシンドロームを発症するリスクが高くなる可能性があることが報告されています3,4。エビデンスは決定的ではありませんが、この発見は、ICSIの長期的な健康への影響について、科学界内で深刻な懸念を引き起こしています。この状況は、ARTとその長期的な健康への影響について、より厳密な評価が急務であることを強調しています。特に、ヒト研究の限界と倫理的考慮に照らして、ICSI後のヒトの子孫の発達を正確に再現できる動物モデルの開発がますます重要になっています。このような状況において、マウスICSI-ET(Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer)モデルは、ヒトのICSIを模倣し、子孫の健康状態の長期モニタリングを容易にする能力があるため、ICSI技術が子孫に及ぼす潜在的な健康リスクを評価するための効果的なツールとなっています5。

この研究は、ランダム血糖モニタリング、空腹時血糖検査、およびマウスのグルコース代謝状態を評価するための耐糖能試験を採用することにより、一般的な代謝表現型、すなわち子孫のグルコース代謝健康に対するICSI-ET技術の影響を調査することを目的としています。ランダムな血糖モニタリングは、正常な生理学的活動中のグルコース代謝の自然な変動を捉えるために利用されますが、空腹時血糖および耐糖能試験は、潜在的な糖尿病予備軍の状態を評価するために使用されます。

プロトコル

以下に説明するICSI-ETのプロトコルは、ガイドラインに従っており、上海家族計画研究所の研究の動物倫理レビューによって承認されています。安全手順:化学物質や生体材料を取り扱うときは、常に適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。フードの使用:認定されたヒュームフードまたはバイオセーフティキャビネット内で、揮発性化学物質またはエアロゾルの発生を含むすべての手順を実行します。雌マウス(6-8週齢のB6D2F1系統)を過剰排卵手順に使用します。

1. マウスのICSI

  1. マウスの過剰排卵
    1. 初日の20:00頃に、妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)をマウスあたり7.5IUの用量で腹腔内注射します。
    2. 3日目の20:00頃(PMSG注射の48時間後)に、マウスあたり7.5IUの用量でヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の腹腔内注射を投与します。
  2. HTF培地を1 mLアリコートに調製し、雌マウスへのHCG注射の同日に5% CO2 インキュベーターで37°Cで一晩平衡化するために蓋をせずに放置します。
  3. ICSI受精液滴の調製
    1. 雌マウスへのHCG注射の同じ日に、50 x 9 mmの細胞培養皿の蓋を上半分と下半分に分けます。上半分を使用して、精子の配置に10%ポリビニルピロリドン(PVP)を使用して、それぞれ5μLの4〜6個の液滴を作成します。下半分を使用して、ICSI手順にM2培地を使用して、それぞれ5μLの8〜10個の液滴を作成します。
    2. PVPおよびM2中液滴を約3mLの鉱油で覆います(図1)。
  4. 培養皿の準備
    1. 雌マウスへのHCG注射の同日に、35 x 10 mmの細胞培養皿に20 μLのKSOM培地(MR-020P-D)12滴を均等に分注します。液滴を約3mLの鉱油で覆います。
  5. 精子採取:
    1. 4日目の午前9時00分頃(HCG注射の13時間後)に頚部脱臼により雄マウスを安楽死させます。
    2. 精巣上体尾部を分離し、滅菌ガーゼで優しく吸い取り、予め温めたHTF培地ですすいで、脂肪組織や血液の残りを取り除くために徹底的に洗浄します。
    3. 精子がHTF培地に自由に泳ぎ出せるように、尾精巣上体を切り開きます。鉗子を使用して尾部を静かに絞って精子を放出し、それらを事前に平衡化されたHTFチューブに集め、37°C、5%CO2 インキュベーターでカバーを外して、精子の能力をさらに使用できるようにします。
  6. 卵子の回収
    1. 子宮頸部脱臼による卵子回収を刺激された雌マウスを4日目の午前9時30分頃に安楽死させます。腹部の皮膚と筋肉層の正中線に沿って慎重に切開を行い、腹腔を露出させます。
    2. 細い鉗子を使用して、卵管の両側、特に膨らんだ膨大部から組織を穏やかに分離し、滅菌した培養皿でM2培地に移します。指定されたすべてのマウスから卵管が収集されるまで、この手順を繰り返します。
    3. 解剖顕微鏡下で、1 mLのシリンジ針を使用して、卵管の膨潤した膨大部の透明部分に穏やかに穴を開け、卵丘卵母細胞複合体(COC)の培地への放出を促進します。
    4. 同じシリンジを使用して、COCを慎重に選択し、100 μLの新鮮なM2培地を含む新しいディッシュに移します。すべてのCOCが元の卵管セグメントから正常に転送されるまで、この手順を繰り返します。
    5. 血液と組織液を拭き取り、解剖顕微鏡で卵管の膨大部を25Gの針で引き裂くと、多数のCOCが放出されます。
    6. 卵管と組織片を取り除き、COCをヒアルロニダーゼ(HY)を含むM2培地の液滴に移し、37°Cに予温します。
    7. 約5分間インキュベートした後、卵丘細胞と卵子の分離を容易にするために、穏やかなピペッティングを行います。中期II(MII)卵子をHY含有溶液から新鮮なM2培地に移します。その後、M2培地の複数の液滴に順次転写します。
    8. 2〜3ラウンドの洗浄後、卵子をKSOM培地の液滴に移し、37°C、5%CO2 インキュベーターに保管してさらに使用します。
  7. 4日目の午前10:00頃、容量のある精子の100μL(ステップ1.5.2を参照)を5秒間超音波処理し、46kHzの周波数で頭と尾を分離し、電力設定を50ワットにします。
    注:尾を切り詰めるために精子を超音波処理するときは、5秒を超えないように時間を制御するように注意してください。超音波処理の数秒後、精子を倒立顕微鏡で観察することができます。精子の約半分が切り捨てられた尾を示しているとき、超音波処理を停止します。
  8. ICSIの手続き
    1. 注入には、先端がフラットで内径が6μmの市販のマイクロマニピュレーション針を使用し、25°の角度で注入します。針の内側に0.5cmの長さの充填部分で作動液を針に充填します。液体のレベルが~0.5cmに達することを確認してください。
      注:注入中は、受精卵子の生存率を低下させる可能性のある高温を避けるために、室温を19°Cに維持してください。液面が0.5cmに達する精度は、注入プロセスの完全性を維持し、卵子の生存率を確保するために重要です。
    2. マイクロマニピュレーターの右アームに注射針を取り付け、保持キャップを締めてしっかりと固定します。マイクロマニピュレーターの左腕にマウス卵子用に設計された市販の先端フラットチップマイクロマニピュレーション保持ピペットを取り付け、注射針と保持ピペットを顕微鏡の視野内に配置します。
    3. ピペットを使用して、1μLの超音波処理精子をPVP溶液の液滴に加えます。
    4. 20個のMII卵子をM2培地の液滴に入れます。
    5. 注射針を使用して、PVP溶液中の10〜20個の精子頭部を吸引します。次に、卵子を含む液滴に注射針を移動します。
    6. 偏光顕微鏡で卵子内の中期紡錘体の位置を直接決定し、紡錘体装置が注入側にないこと、極体は通常、卵子の向きに対して12時または6時の位置に位置していることを確認します。
    7. 卵子を培養皿の底に接触させてください。卵子の透明帯と注射針が同じ平面にくるように焦点面を調整します。
    8. 注射針が透明帯に接触したら、注射針にわずかな負圧を加え、透明帯の一部を引き込みます。.
    9. 強度設定を5、周波数を1のピエゾパルスを同時に活性化し、透明帯に効果的に穿孔を作成し、注射針が通過できるようにします。
    10. 注射針をペリビテリン腔に進め、精子の頭を針の先端に押し込みます。注射針を卵母細胞に挿入し、透明帯の反対側に到達するまで挿入します。
    11. 強度1、周波数1に設定されたピエゾパルスを使用して、原形質膜に小さな細孔を作り、PVPの侵入を最小限に抑え、卵子の完全性を最適に維持しながら精子頭部を卵形質に注入します。
    12. ステップ1.8.11を繰り返して、20個の卵子をすべて注入し、その後、19°Cで15分間インキュベートします。
    13. 生き残った卵子をKSOM培地に移し、インキュベーターに入れます。2細胞、4細胞、桑実胚、および胚盤胞の形成速度を観察します。
      注:卵子への細胞質内単一精子注入(ICSI)のタイミングは、HCGの注入後14〜18時間以内に手順を完了することを目指して、制御する必要があります。

2. マウス胚盤胞の子宮移植

  1. 精管切除された雄マウスの調製
    注:研究には、6〜8週齢のICR雄マウスを使用してください。
    1. 体重 1.25 mL/10 g の投与量で 1.25% 2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射により麻酔を誘発します。痛みの反応がないことは、麻酔が成功したことを示しています。
      注:現在のプロトコルには、麻酔をかけた動物の目への獣医軟膏の塗布は含まれていませんが、目の乾燥を防ぎ、処置中の動物の健康と快適さを確保するためのベストプラクティスとして推奨されます。手術および回復プロセス全体を通じて、すべての手術器具は使用前に滅菌され、手術領域は消毒液を使用して準備され、清潔な操作環境を確保しました。
    2. 潜在的なストレスや怪我から保護するために、最初の回復段階で個別に手術を受けたマウスを飼育します。
    3. ブプレノルフィンを体重0.05 mg / kgの投与量で投与して、最適な痛みの緩和を確保します。.
      注:マウスの健康を確保するために、回復期間中はマウスを注意深く監視し、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを放置しないでください。
    4. 精巣よりも優れた下腹部に手術部位を準備します。毛皮を取り除き、ポビドンヨードで消毒します。滅菌ハサミを使用して、alba線に沿って縦方向に1cmの切開を行います。無菌でほこりのない紙で血液をやさしく取り除き、白線に沿って腹筋を鈍く解剖し、腹腔にアクセスします。
    5. 湾曲した鉗子を使用して、左の精巣とそれに関連する脂肪パッドをそっとつかんで露出させます。輸精管を特定し、先のとがった鉗子を使用して慎重に分離し、操作用に10mmのセグメントを作成します。
    6. 湾曲した鉗子をアルコールランプの外炎に数秒間保持して滅菌します。輸精管をそっとつかみ、焼灼により輸精管が平らになり、白くなります。最初の焼灼ポイントから3〜5mm遠位に2番目の焼灼ポイントを作成します。滅菌外科用ハサミを使用して、2つの焼灼ポイント間の輸精管のセグメントを切り取ります。
    7. 輸精管の焼灼された端を注意深く検査し、短く、平らになり、白くなったセグメントが残っていることを確認します。湾曲した鉗子を使用して、精巣とそれに関連する脂肪パッドを腹腔にそっと戻します。
    8. 手順2.1.6で説明した手順を反対側(右側)で繰り返します。
    9. 縫合糸を使用して手術部位を閉じますが、通常は筋肉層に1針、皮膚に3針を配置します。外科的切開部の適切な位置合わせを確認し、ポビドンヨードで消毒します。動物を観察のために加熱パッドに移し、動物が意識を取り戻すまで10〜15分間監視します。回復したら、動物を飼育ケージに戻します。
      注:精管切除術後、マウスは14日間の回復期間を必要とし、その後1週間の試験交配実験が必要です。
    10. この週の間、精管切除された男性と女性を継続的に交配させ、交尾プラグを呈しているすべての女性の妊娠状態を観察します。交配の成功は、雌マウスの膣口に黄白色のブロック状の膣栓が存在することによって示されます。
      1. 初日の午後4時から午後6時の間にマウスをペアリングし、2日目の午前7時から午前9時の間に膣栓を確認します。膣プラグを装着した女性は、0.5日で偽妊娠状態にあると考え、その後の胚移植実験に使用します。膣栓のない女性をレシピエントグループに戻します。
        注:膣栓のないこれらの女性は、偽妊娠中の女性を準備するための交配に引き続き使用できます。すべての差し込まれた女性が妊娠しないようにしてください。そうして初めて、精管切除された男性を正式な実験に使用することができます。
      2. 精管切除されたオスは毎日交尾することができますが、交配セッションの間に1日の休息をとってください。
        注:私たちの経験に基づくと、精管切除された男性は1年以上にわたって高い交尾プラグ率を維持できます。ただし、交配中の女性で4〜6回連続して交尾プラグを生成できない精管切除された男性は、研究から削除する必要があります。
  2. 偽妊娠女性の準備
    1. ICR雌マウス(生後7〜10週齢、体重25g以上)と精管切除した雄マウス(生後3〜6ヶ月)を1:1の比率で交配することにより、偽妊娠雌マウスを作製します。
      注:精管切除された雄は、雌マウスの子宮頸部を刺激するために使用され、その結果、黄体が活性化されました。
  3. 胚盤胞を移すためのピペットの準備
    1. 移植する胚をインキュベーターから取り出し、37°Cの温度でM2培地の液滴に移します。
    2. トランスファーピペットを使用して、少量の液体を吸引し、少量の空気を吸い込み、6〜10個の胚を吸引します。最後に、別の少量の空気を吸引してピペットをシールします。
      注意: トランスファーピペット内の液体の長さは0.5cmを超えてはなりません。
  4. 子宮移植(胚盤胞)
    1. 偽妊娠した雌マウス(交配後2.5日)の体重を量り、体重1.2 mL / 10 gの用量で1.25%2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射により麻酔をかけます。.鉗子で耳をやさしく押します。
    2. マウスに麻酔を投与し、アルコール消毒によって無菌を確保した後、腹側腹部に正中線縦切開を行います。緩んだ皮下組織を利用して、移植の必要に応じて切開部を左側または右側にずらします。小さなハサミを使用して、腰椎の外側~0.5cmで腹壁筋層の鈍的解剖を行い、腹腔にアクセスします。
    3. 非外傷性鉗子を使用して、卵巣、卵管、子宮を慎重に外部に形成します。
    4. 注射針の先端を使用して、血管を避けて、子宮卵管接合部の下の子宮壁に小さな上向きの角度の切開を行います。この切開は子宮腔へのアクセスを提供します。小さな穴に卵管を2〜3mm静かに挿入します。
    5. 胚のゆっくりとした注入中にトランスファーピペットを慎重に観察しながら、トランスファーピペットの端にある小さな気泡を慎重に排出します。培地の中央部分が排出されたことを確認したら、手順を停止し、トランスファーピペットを静かに取り外します。
    6. 卵巣、卵管、子宮を腹腔内に再配置します。筋肉層と皮膚を別々に縫合します。マウスが麻酔から回復するまで、マウスを加熱パッドの上に置きます。マウスの健康を確保するために、回復期間中はマウスを注意深く監視し、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを放置しないでください。
  5. 妊娠の観察
    1. 手術後、マウスを18〜21日間観察して、生まれた子孫の数を監視します。難産(難産)の場合は、帝王切開を行います。新生児マウスを同じ年齢層の授乳中の母マウスに育ててもらいます。

3.ランダム血糖値、空腹時血糖値、および耐糖能試験

  1. マウスの成長中のランダムな血糖値の追跡
    1. マウスの誕生以来、餌と楽しみの良い夜の後の午前9時に4週間ごとにランダムな血糖値を監視します。
      1. マウスの尾の先端に穴を開けて、尾静脈の血液を採取します。
      2. 血液の最初の一滴は、それと混合された組織液の存在により、より高い糖測定値を有する。したがって、きれいな吸収紙を使用して血液の最初の一滴をやさしく拭きます。
      3. 尾静脈からの2滴目(~4μL)からハンドヘルドグルコメーターで血糖値を測定します。
  2. マウス発生中の空腹時血糖値と耐糖能の変化の追跡
    注:最初の採血時点が15分であることを考慮すると、すべてのマウスは15分以内に注射する必要があります。各マウスの注入には20〜30秒かかるため、この時間枠内で注入が完了することを保証するために、各テストで使用できるマウスの最大数は30を超えることはできません。
    1. 空腹時血糖値と耐糖能試験は、生後4週間ごとに一晩絶食したマウスで実施します。
      1. 初日は、新鮮な照射された削りくずの寝具、清潔なケージ、蓋、水筒を準備します。マウスを餌のない新鮮なケージに移します。ケージに餌を与えないタグを追加します。
      2. 十分な10%グルコース注射(滅菌およびパイロジェンフリー)と1mLシリンジを準備します。.
      3. 各グループのマウスが1日目の午後5:00から2日目の午前9:00までの16時間絶食することを確認しますが、水への自由なアクセスを許可します。血糖値計を使用して、手順3.1.1.1-3.1.1.3で説明されている空腹時血糖値を測定します。
    2. マウスの体重を量り、尾に印を付けて、迅速な識別を容易にします。10 μL/gのマウス重量でグルコースシリンジを調製します。
    3. 30秒間隔で、10μL / gグルコースをマウスの腹腔内に注入します。.
      注:不正確な液体注入量を避けるために、ここでは注入技術に特別な注意を払う必要があります。操作の要点は次のとおりです。
      1. マウスを固定し、片手で尻尾を拘束します。腹腔内の臓器が頭に向かって移動し、十分な注射スペースが残るように、頭を臀部よりわずかに低く保ちます。
      2. 針を正中線と腰骨の間に置き、45度の角度で皮膚に挿入してから、針を皮膚表面と平行に0.5cm~0.5cm整列させながら、針を腹腔の奥深くまで優しく導きます。
        注:注射中の抵抗に注意を払い、内臓が誤って穴を開けたかどうかを判断してください。
      3. シリンジを腹腔内に排出します。
      4. インジェクションが開始された時間を記録し、タイマーを使用してインジェクションレートを制御します。タイマーの処理で時間を無駄にしないように、3 匹のマウスでタイマーを 90 秒に設定します。
    4. 尾静脈から希望の間隔(グルコース投与前の0、グルコース負荷の15、30、60、90、および120分)で血糖値を測定します。
      注:その後の血糖値検査も、マウスごとに20〜30秒かかる必要があります。
    5. 実験後、マウスを餌と水を備えた自宅のケージに戻します。

結果

当研究室では、マウスの精巣上体尾側精子を用いたICSIを用いて、受精率89.57%、2細胞受精率87.38%を達成しました。ET後の子孫の出生率は約42.50%です。驚くべきことに、すべての受精率、2細胞率、および子孫出生率は、ヒトARTで達成されるレベルに匹敵し、マウスでのヒトART技術のさまざまな段階の包括的なシミュレーションを可能にしました。詳細については、 表1 および 表2に示します。成長・発達過程において、自然生まれマウスと顕微授精マウスとの間でランダムな血糖値の変動は認められませんでした(図2)。しかし、雄の顕微授精マウスは、実験全体を通じて空腹時血糖値が継続的に高値を示し(図3)、空腹時血糖の恒常性が損なわれていることが示されました。興味深いことに、雌のICSIマウスは対照群と比較して変化を示さなかった。GTTでは、雄の顕微授精マウスと対照群の間で血糖値に有意な変化が見られ(図4)、雌マウスではそのような差は見られませんでした。これらの結果は、ICSI技術を使用して得られた子孫が糖尿病に罹患している可能性があり、その結果が性別に関連していることを示唆していました。雌マウスでは糖尿病の表現型は示されませんでしたが、雌雄のICSIマウスの過体重表現型は一貫していました(図5)。

ここで説明した細胞質内精子注入法(ICSI)プロトコルを使用して、マウスの受精率と胚発生率を高くしました。代表的な実験では、2つの前核の形成によって証明されるように、卵母細胞の89.57%が顕微授精後に受精しました。ICSIの24時間後では、受精卵の87.38%が2細胞胚期に発達しました。レシピエントの女性への胚移植後、生きた仔の出生率は42.50%でした(陽性の結果)。ここで説明した最適化された細胞質内精子注入法(ICSI)プロトコルを使用して、マウスの卵子と精子から効率的に子孫を生成しました。重要なことに、ICSI由来の動物の徹底的な特性評価により、重大な発達障害がない場合に代謝摂動が明らかになりました。

自然交配の対照群と比較して、雌ではない雄のICSIマウスは、空腹時血糖値の上昇(図3)と腹腔内耐糖能試験での耐糖能の低下(図4)によって証明された、グルコース恒常性の低下を示しました。これらの変化は、ICSIを介した受精中のリプログラミング欠陥、または精子操作中に発生した微妙な遺伝的/エピジェネティックな異常に起因する可能性があります。

さらに、雄と雌の両方のICSIマウスは、対照と比較して体重の増加を示し(図5)、肥満の傾向を示唆しています。マウスのICSI技術は、ヒトのICSIの結果を確実にモデル化しますが、観察された代謝表現型は、ICSI動物モデルの結果を注意深く解釈する必要性を強調しています。成長、健康状態、行動を包括的に評価することは、ICSIマウスの下流アプリケーションへの適合性を判断するために不可欠です。

まとめると、これらのデータは、マウスICSIプロトコルが研究のための子孫を効率的に生成するための有用性を示すとともに、ICSI由来動物の表現型結果を徹底的に評価することの重要性を強調しています。この例で観察された性別特異的な代謝異常は、ICSIマウスモデルの結果を注意深く解釈する必要性を強調しています。

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図1:マウスの細胞質内精子注入のための皿の準備の図。 細胞培養皿の蓋を上半分と下半分に分けました。上半分には、精子配置用の10%ポリビニルピロリドン溶液の液滴が含まれていました。下半分には、ICSI手順を実施するためのM2培地の液滴が含まれていました。すべての液滴は蒸発を防ぐために鉱物油で覆われていました。このディッシュセットアップにより、PVPとM2液滴の間で精子と卵子を順次移行し、ICSIプロセスが可能になりました。分離された領域は、処置中の媒体の混合を防ぎました。略語:ICSI =細胞質内精子注射;PVP =ポリビニルピロリドン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:出生後の発達中の自然繁殖コントロール(n = 5)および顕注型(n = 5)マウスの毎週のランダム血糖値。 血糖値は、血糖値計を使用して、対照マウスと顕微授精マウスの尾静脈から一晩絶食した後、毎週測定されました。データはSEM±平均として示され、統計的有意性は、2因子ANOVA、ns、P > 0.05を使用して評価されました。略語:SEM =平均の標準誤差。ICSI = 細胞質内精子注入;ns = 重要ではありません。NM = 自然交配。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:自然繁殖の対照群(雄はn = 7、雌はn = 7)と顕石処理マウス(雄はn = 7、雌はn = 7)の出生後の発達中の毎週の空腹時血糖値。 夜間絶食後、絶食対照マウスと顕微授精マウスの尾静脈から血糖値を毎週測定しました。ICSIで治療した雄のマウスは、雌ではなく、8週齢以降の性別を一致させた対照と比較して、空腹時血糖値が有意に上昇したことが観察されました。±統計的有意性は、二元配置ANOVA、ns、P > 0.05、***P < 0.001、****P < 0.0001)を使用して評価されました。略語:SEM =平均の標準誤差。ICSI = 細胞質内精子注入;ns = 重要ではありません。NM = 自然交配。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:16週齢の自然交配対照(n = 5)およびICSI処理雄マウス(n = 5)の腹腔内ブドウ糖負荷試験。 一晩の絶食の後、マウスは腹腔内グルコース注射を受けました(2 g / kg体重)。次に、血糖値は注射後0、30、60、および120分で測定されました。ICSI処理を受けた雄のマウスは、IPGTT中の30分、60分、120分で、自然交配の対照群と比較して有意に高い血糖値を示しました。データはSEM±平均として示され、分析は二元配置ANOVAを使用して実行されました。ns、P > 0.05。※P<0.05です。略語:IPGTT =腹腔内ブドウ糖負荷試験;SEM = 平均の標準誤差ICSI = 細胞質内精子注入;ns = 重要ではありません。NM = 自然交配。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:生後4週齢から20週齢までの自然繁殖対照群(n = 5匹の雄、n = 5匹の雌)と顕微授精剤で処理されたマウス(n = 5匹の雄、n = 5匹の雌)の体重追跡。 毎週の測定により、ICSIで治療したマウスは、8週齢から、性別を一致させた対照と比較して、雄と雌の両方の体重が有意に増加したことが明らかになりました。データはSEM±平均として示され、分析は二元配置ANOVAを使用して実行されました。P < 0.001 です。P < 0.0001 です。略語:SEM =平均の標準誤差。ICSI = 細胞質内精子注入;ns = 重要ではありません。NM = 自然交配。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

卵子ザイゴット施肥率(%)2セル2セル率(%)4-8セル4-8セル率(%)桑 実 胚桑実胚率胚盤胞胚盤胞率
尾状精子 ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
尾状精子 ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
尾状精子 ICSI3605083.334284377432642856
トータル23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

表1:マウスICSI後の発生転帰。 略称:ICSI = 細胞質内精子注入。

いいえ。いいえ。移植された胚の数いいえ。出生率(%)男性女性出生率(%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
トータル401710742.5

表2:ICSIマウス胚の子宮移植後の出生転帰。 略称:ICSI = 細胞質内精子注入。

ディスカッション

この研究では、マウスの細胞質内精子注入(ICSI)と胚移植(ET)技術を統合して、ヒト生殖補助医療(ART)を包括的に再現し、ETと組み合わせたICSIが子孫の発達に与える影響を調べました。正常なマウス精子に顕微授精法を適用したところ、高い受精率(86.76%)と2細胞率(88.48%)が得られました。ET後の仚マウスの出生率は約42.50%であり、技術プラットフォームの堅牢性を示しています。この研究で最も注目すべき発見は、ICSIの子孫におけるグルコース代謝レベルの加齢に伴う変動であり、これはICSI技術の適用に起因する可能性があります6。

グルコース代謝レベルの変動の観察は、この研究で注目すべき発見を構成します。この知見は、ICSI技術が子孫の健康、特にグルコース代謝7に及ぼす潜在的な長期的影響を示唆している。この現象の背後にある理由を解明するために、ICSI手順に含まれる重要な技術的ステップを包括的に検討しました。その結果、マイクロインジェクションの温度(19°C)、超音波切断時間(5秒以内)、およびトランスファー液量(<0.5cm)を制御することが、胚の生存率と着床率を上昇させるために重要であることがわかりました。トランスファーピペットのサイフォン効果の制御は、正確な胚移植のための重要なステップとして浮上しました。トランスファーピペットを調製する際、チューブの直径の均一性を確保することは、サイフォン効果を軽減し、チューブ内の液体の動きをより適切に制御するための鍵となります。この措置は、胚移植の成功率と精度を高めるのに役立ちます。さらに、胚移植中の長期 にわたるin vitro 培養や過密状態を避けることも、発生能力の向上にも役立ちました。最適化されたプロトコルを採用した結果、ET後の受精率は86.76%、出生率は42.50%を達成し、ICSIの処置自体が本質的に生存率を損なわなかったことが示唆されました。したがって、グルコース代謝の変動は、明白な胚損傷ではなく、ARTプロセスによって誘発された微妙な細胞内変化ともっともらしく関連していました。

ARTは安全であると広く見なされていますが、証拠が増えていることを示していますが、一見正常なARTの子孫でさえ、不自然な生殖特性と配偶子および胚発生中の介入の重要な期間のために、人生の後半でさまざまな健康リスクを示す可能性があることを示しています5,8,9,10,11,12,13 .私たちの調査結果は、ARTの潜在的な代謝効果についての新たな洞察を提供し、ARTが子孫の健康に及ぼす長期的な影響に関するさらなる研究の必要性を強調しています14。

この研究ではマウスモデルが採用されていることを認識することが重要です。したがって、結果は直接ヒトの被験者に伝達できない場合があります。それにもかかわらず、マウスとヒトとの間には生物学的に相当な類似性があることから、これらの知見は相当な参照的意義を保持している15。さらに、臨床診療で顕微授精を受ける患者は、精子に異常があることが多いことを認識することが重要です。一方、本研究では、正常マウスを顕微授精に用いたため、精子異常マウスのICSI仔に関するデータが不足していた。しかし、精子の異常は、ICSI技術の長期的な影響により深刻な影響を与えると予想するのが妥当です。したがって、この研究の結果は、注目すべき参照上のメリットを維持しています。

私たちの研究のもう一つの限界は、精子の固定化におけるマウスモデルとヒトの臨床実践との間の方法論的な不一致です。ICSIの臨床応用では、マイクロピペットで尾を物理的に破壊することにより、ヒトの精子を固定するのが一般的です。しかし、マウスモデル実験では、マウスの胚操作で日常的に用いられている超音波テールクリッピングを用いて精子を調製しました。このアプローチは、特に超音波が引き起こす可能性のある精子の完全性と機能への損傷の可能性を考慮すると、モデルにばらつきと潜在的なバイアスを誤って導入する可能性があることを認識しています。この方法論の違いにより、私たちの発見の直接的な翻訳可能性が制限される可能性があります。今後の研究では、マウスの精子の尾を乱すためのマイクロピペットの使用を探求する予定です。この調整は、精子への意図しない影響を最小限に抑え、ヒトのICSI手順で観察された条件と結果をより適切に再現することを目的としています。私たちは、調査結果の臨床的関連性を高めるために、研究慣行を継続的に改善することに取り組んでいます。

前述の技術プラットフォームに基づいて、将来の研究では、ICSI技術が心血管の健康や免疫系などの他の子孫の健康の側面に与える影響をさらに調査します。さらに、ICSIの長期的な影響を包括的に理解するためには、長期的な追跡調査も不可欠です。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この作業は、上海市張江国家独立イノベーション実証区特別開発基金の主要プロジェクト計画(ZJ2022-ZD-006)、上海市科学技術委員会対象資金プロジェクト(22DX1900400)、上海市衛生委員会の青年プログラム(20204Y0276)の支援を受けました。中国国家自然科学基金会(32070849)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.25% アベルチン (2,2,2-トリブロモエタノール)麻酔のための南京愛北M2960
学的なペトリ皿 35 x 10 mm スタイル w/堅い蓋、結晶グレードのバージン ポリスチレン、滅菌BD353001
細菌学的なペトリ皿 50 x 9 mm スタイル w/タイトな蓋、結晶グレードのバージン ポリスチレン、滅菌BD351006
バイオセーフティ キャビネットESCOclass figure-materials-1 BSC無菌手術、培養皿作り、試薬の分注など
CO2インキュベーターサーモ8000DH胚培養
解剖顕微鏡オリンパスSZX16マウス胚移植での使用
フロリナート FC-770シグマF3556フロリナート FC-770 は、高い絶縁耐力と抵抗率を持つ熱的に安定した完全フッ素化液体で、作動流体
ハンドヘルドグルコメーターロシュAccuChek performa血液として使用されますグルコース測定
HTFメルクMR-070-Dマウス体外受精用に設計されたEmbryoMax Human Tubal Fluid(HTF)(1x)液体は、50mLのフォーマットで入手可能で、胚培養用に最適化され、検証されています。
油圧マイクロインジェクターEppendorfCellTram 4r オイル、5196000030精子注入用
倒立顕微鏡NikonTI2-Uマイクロマニピュレーション観察ホスト
KSOMMerckMR-020P-D(1x), 粉末, フェノールレッドなし, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), 液体, フェノールレッド
マイクロマニピュレーターナリシゲNTX-N4マイクロマニピュレーションアーム
鉱物油 SIGMAM8410鉱物油は、さまざまな分子生物学アプリケーションで蒸発と交差汚染を制御するためのカバー層として使用するのに適しています。
ニードルカッター南京愛平サッター MF-800マイクロマニピュレーション針の製造に使用
ニードルプーラー南京アイベイサッターモデルp-100マイクロマニピュレーション針を作るための使用
ピエゾドリルトリップムース ICSI エッペンドルフ5195000.087ICSI注射針の応用。
圧電マイクロマニピュレーター(メンブレーカー)エッペンドルフエッペンドルフ PiezoXpertマイクロパルスを使用して卵子の透明帯と卵子の尾孔を切断します
空気圧マイクロインジェクターエッペンドルフCellTram 4r Air, 5196000013卵子の固定用
すぐに使えるヒト絨毛性ゴナドトロピン(Hcg)南京愛北M2520滅菌試薬、腹腔内注射 50 IU/mL
Ready-to-use Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG)Nanjing AibeiM2620滅菌試薬、腹腔内注射 50 IU/mL
実体顕微鏡OlympusSZX7卵子の採血と胚発生の観察
細菌付き

参考文献

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