実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)の慢性自己免疫疾患で、脳実質への免疫細胞の限局浸潤、軸索を包むミエリン鞘の破壊、グリアの活性化、およびニューロンの喪失を特徴とする¹。病原性T細胞の確立された役割に加えて、複数の証拠が、CNSに対する自己免疫応答の媒介におけるB細胞の関与を強調しています。B細胞はMS脳でクローン増殖を起こし、ミエリン成分に対する抗体が脱髄病変内で検出されています^2,3。疾患発症時の末梢B細胞の選択的活性化が最近文書化されており、疾患開始におけるこの免疫細胞コンパートメントの推定上の役割も示唆されています⁴。抗CD20モノクローナル抗体などのB細胞枯渇療法の成功は、異常なB細胞機能と自己免疫性脱髄との間の機構的関係をさらに裏付けています^5,6。分子の観点から、B細胞は、自己抗原の提示、炎症誘発性サイトカイン分泌、および自己反応性抗体産生を介して疾患に寄与する可能性があります。

複雑なMS表現型の特定の特徴を再現するために、複数の動物モデルが開発されています。その中でも、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、 最も広く使用されているin vivo パラダイムであり、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)やミエリン塩基性タンパク質(MBP)⁷などのミエリンタンパク質に由来する短いペプチドによる実験動物の免疫に依存しています。EAE免疫動物は、脳原性ペプチド⁸に対する強力な体液性応答を含む、多くの面でMSに似た脱髄性病理を発症します。このため、EAE研究は、疾患の状況におけるB細胞と自己抗体の機能を解剖するのに役立ちました。たとえば、MS患者から単離されたMOG特異的抗体は、EAEモデル⁹の臨床経過を悪化させる可能性があることが実証されました。 特に、ヒトMOGにおける42位のプロリン残基は、自己抗体病原性を決定するために重要であることが示された¹⁰。最近では、MOG特異的自己抗体は、ミエリン喪失を媒介するだけでなく、CNS内の自己反応性T細胞の再活性化を促進することによっても疾患を促進することがわかっています¹¹。

CNS自己免疫における抗体応答の重要性を考慮して、この記事では、MOG35-55ペプチドで免疫したC57BL / 6JマウスEAEの自己反応性抗体の血清レベルを効率的に測定するためのELISAベースのプロトコルを紹介します。プロトコルの最初の部分では、心臓内穿刺 を介して 血清を採取する方法について説明します。その後、ELISAアッセイの設定とデータ取得の手順について詳しく説明します。最後に、データ分析と解釈について説明します。

マウスを含むすべての手順は、イーストカロライナ大学動物管理委員会(IACUC)によって承認された実験ガイドラインに準拠して実施されました。この研究では、8〜10週齢の野生型C57BL / 6J雌マウスを使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました(資料の表を参照)。EAEは、以前に発表された報告12,13,14に続いて誘発されました。

1.美容液コレクション

1. MOG35-55 免疫を介して EAE を誘導した後、必要な時点で CO₂ 窒息またはイソフルラン過剰摂取によって実験マウスを安楽死させます (施設で承認されたプロトコルに従う)。
   注:マウスの総数と血清採取の時点は、特定の実験によって異なる場合があります。
2. つま先や尻尾をつまんでバイタルサインがないことを確認したら、マウスを解剖トレイの背側横臥位にし、手足をピンやテープで固定します。マウスの体をLED光源( 材料の表を参照)に向け、動物の胸部を照らします。
3. マウスの毛皮に70%エタノールをスプレーし、解剖ハサミを使用して骨盤から剣状突起まで腹部に沿って3〜4cmの正中線切開を行い、臓器や主要な血管を避けます(図1A-C)。手順を容易にするために、鉗子を使用して剣状突起の上に皮膚をつかみます。
4. 横方向に切断し、スプリングはさみを使用して両側の端で胸郭を前方に切断し、正中線で胸骨に到達する前に停止します(図1D)。マウスの頭の上に作成したリブフラップを折りたたんで、心臓を露出させます(図1E)。
   注:胸骨を切ると、骨に隣接する主胸動脈が損傷し、収集できる血液の量が減少するため、避ける必要があります。
5. 1mLのシリンジに接続された25Gの針を左心室に挿入し、プランジャーを静かに引き戻して採血します(図1F)。針の穿刺を容易にするために、一対の鉗子に対して心臓をそっと支えます。
   注:血液がすぐに注射器に現れない場合は、針をゆっくりと回転させ、別の角度でテストする必要があります。ただし、血液が漏れる可能性のある心臓に不必要な穴を開けないように、最初の試みで針を適切に配置する努力を払う必要があります。
6. 血液を滅菌済みの1.5mLチューブに移し、室温で30分間凝固させます。2000 × gで4°Cで20分間遠心分離して血栓を除去します。 血清画分を表す上清を回収し、将来の試験のために、使い捨てアリコートを-80°Cの極低温チューブに保管します。

2. ELISAアッセイ

1. 凍結乾燥したMOG35-55ペプチド( 材料の表を参照)を水に再懸濁して、10 mg/mLのストックを得ます。実験を開始する前に、ストックをコーティングバッファー( 材料表を参照)で10 μg/mLに希釈し、最終溶液の100 μL/ウェルを96ウェルプレートにピペットで移します。プレートを粘着フィルムで密封して蒸発を防ぎ、プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
   注:各サンプルに対して少なくとも2つのウェルを計算する必要があり、ブランクコントロール用に2つの追加のウェルも含める必要があります。
2. 並行して、同じ数のウェルを、10 μg/mL 濃度のコーティングバッファーに溶解した 100 μL/ウェルのウシ血清アルブミン(BSA)でコーティングします。これらの追加の井戸は、バックグラウンドコントロールとして機能します。
   注:コーティングバッファーとブロッキングバッファーの組成が異なるため、コントロールウェルをBSAでコーティングすることをお勧めします。他の脳炎誘発ペプチド(PLP139-151やMBP84-104など)は、BSAの代わりに無関係な抗原として使用できることに注意してください。.
3. 翌日、0.05% Tween 20 (PBS-T) を添加したリン酸緩衝生理食塩水 200 μL/ウェルでプレートを 3 回洗浄します。続いて、PBS中の3%BSA製のブロッキング溶液(Tween 20なし)を100 μL/ウェル加え、ハイブリダイゼーションオーブンで37°Cで1時間密封したプレートをインキュベートします。
4. 200 μL/ウェルのPBS-Tでプレートを3回洗浄します。各血清サンプルをブロッキング溶液で1:100に希釈し、MOG35-55とBSAコーティングウェルの両方に100 μL/ウェルを加えます。ブランクとして指定されたウェルに同じ量のブロッキング溶液を追加します。プレートを室温で2時間密封し、一定の振とう(250rpm)でインキュベートします。
5. 200 μL/ウェルのPBS-Tでプレートを3回洗浄します。HRP標識二次抗体(1:2000、 材料表を参照)をPBS-T中の0.2% BSA溶液で調製した溶液で希釈し、すべてのウェルに100 μL/ウェルを加えます。プレートを室温で1時間密封し、一定の振とう(250rpm)でインキュベートします。
6. 200 μL/ウェルのPBS-Tでプレートを3回洗浄します。3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)基質( 材料表を参照)の100 μL/ウェルをすべてのウェルに加え、暗所で1〜5分間インキュベートし、青色の発育を観察します。
   1. 100 μL/ウェルの停止溶液( 材料表を参照)を加えて反応を停止し、波長450 nmに設定されたプレートリーダーを使用して各ウェルの光学濃度(OD)を測定します。
      注:TMB基質は、ウェルに添加する前に、室温で30〜60分間平衡化する必要があります。

3. データ分析

1. プレートから読み取ったOD値をExcelスプレッドシートに入力します。各サンプルの重複ウェル(MOG35-55とBSAコーティングの両方)から得られたOD値を平均化します。
2. 各サンプルについて、MOG35-55コーティングウェルの平均値からBSAコーティングウェルの平均値を差し引きます。結果として得られるバックグラウンド補正値は、さまざまな血清サンプル中の抗MOG35-55抗体の濃度に比例します。
   注:ブランクウェルは、0付近で補正された値になります。
3. マンホイットニーU検定などのノンパラメトリック統計的検定を適用して、2つの実験条件間の平均OD値を比較します。各条件に少なくとも3つの独立したサンプルを含めます。

本ELISAアッセイの頑健性を実証するために、この方法は、C57BL/6J雌マウスのコホートから分離された血清サンプルを、免疫後20日(dpi)に、100μgのMOG35-55ペプチドを完全フロイントアジュバント(CFA)に従ったもので、検証済みのEAE誘導プロトコル12,13,14に従って試験した。動物はまた、0日目と2日目に400ngの百日咳毒素を投与されました。ペプチドを含まない模擬免疫動物からの血清サンプルは、ネガティブコントロールとして役立ちました。すべてのEAEマウスは、11〜14dpiの間に疾患の最初の徴候を発症し、20dpiまでに0〜6スケールで平均スコア2.6±0.6(標準誤差、SE)に達しました(0、徴候なし、1、尾部緊張の低下、2、軽度の単麻痺または対麻痺、3、重度の対麻痺、4、対麻痺、5、四肢麻痺、および6、瀕死または死亡)12。予想通り、EAEサンプルは対照サンプルと比較して有意に高いOD値を示しました(図2)。これらのデータは、疾患のピーク時にMOGペプチドに対する強力なIgG免疫グロブリン応答が存在することを裏付けています。

図1:心臓穿刺処置(A-E)成体マウスの心臓にアクセスするための開胸術の代表的な画像。(F)マウス心臓の左心室に針を挿入するための正しい手順の代表的な画像。解剖を容易にするために、関連する解剖学的構造が各パネルに示されています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2:MOGペプチド自己抗体ELISAです。 抗MOG35-55 IgG免疫グロブリンの血清レベルは、報告されたELISAプロトコルを使用して、EAEおよび模擬免疫マウスで、免疫後20日(dpi)でテストされました。EAEサンプルでは、対照と比較して一貫して高いOD値が検出された。データは平均± SE (N = 3 per group)として表されます。グループ間の差は、片側マンホイットニーU検定*P ≤ 0.05によって評価されました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する利益はないと宣言している。