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方法論記事

ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のモデリング、アッサンブロイドの構築、合成組織の設計のためのin vitro培養技術

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DOI：

10.3791/66229

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2025年4月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

この記事について

サマリー

オルガノイドは、臓器開発、創薬、疾患研究のための個別化組織モデリングに革命をもたらします。オルガノイド工学は、複雑な合成組織の作成へと進歩しています。その目的は、形態形成、アッサンブロイド技術、およびバイオマトリックスを統合して、組織工学を進歩させることです。このプロトコルは、肝臓の器官形成をモデル化し、合成組織構築のガイドラインを確立するのに役立ちます。

要約

慢性肝疾患は流行の割合に達し、世界中で8億人以上が罹患しています。現在の治療法である同所性肝移植には、いくつかの制限があります。肝臓再生医療の分野では、有望な解決策が生まれており、肝臓の器官形成は大きな可能性を秘めています。E8.5から11.5の間に起こる初期の肝臓器官形成は、形態形成、肝索形成、および集団移動につながる上皮間葉系相互作用の形成を伴います。しかし、このプロセスのin vitroモデリングの方法は不足しています。この研究では、ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のさまざまな段階と側面のモデリングを可能にする一連の詳細な方法が提示されます。1つのメソッドシリーズでは、肝臓(HEP)および間葉系(MES)スフェロイドを用いたアセンブロイド技術を利用し、肝臓の器官形成に見られる初期構造を再現し、初期の形態形成をモデル化し、in vivoで見られる間質細胞の遊走を実証しています。これらの革新的なアッセンブロイドシステムは、アッセンブロイドの形成と移動に影響を与える要因を特定するのに役立ちます。HEPスフェロイド培養システムは、集団移動と分岐形態形成をモデル化するためにも採用されました。間葉系条件培地(M-CM)は、用量依存的な分岐移動を開始する上で重要な役割を果たします。提示されたすべての方法は、高い成功率で高い再現性があることが示されました。これらの事象を結びつけることで、私たちの研究は、in vitroおよびin vivoで器官形成をリバースエンジニアリングするための連続的な形態形成事象の再現を可能にします。

概要

肝細胞の遊走は、肝臓の器官形成、疾患、および細胞治療において重要な役割を果たします。肝臓器官形成(E8.5-9.0、マウス)では、周囲の間葉や心臓から発せられる誘導的なシグナルにより、腹側前腸の肝前皮が肝臓遺伝子を発現し始めます。E9.0では、細胞が直方体から偽層状の円柱状形態に移行すると、前腸上皮が肥厚し、肝臓diverticulum1,2が形成されます。この重要な段階では、肝憩室はわずか~1,500個の細胞で構成されています。次に、肝憩室の内側を覆う肝内胚葉が肥厚し、剥離し、移動する肝芽細胞(HB)のコードを形成します。これらのHBは、内皮細胞および間葉系細胞と共遊走し、周囲の間葉系組織に分岐し、三次元の集団細胞遊走を開始して肝臓bud3,4を形成します。実際、この段階では、細胞は集合的に(1)共遊走、または他の細胞タイプと一緒に移動し、(2)分岐形態形成または分岐管状構造の形成、および(3)間質移動、または他の細胞の上または他の細胞間での移動を経験します。E11.5までに、移動は停止し、原始的な肝臓が形成され、103fold3に拡大します。ラット胎児HBsの発現は、3D集団細胞移動、形態形成、および細胞外マトリックスリモデリングに関連する高度にアップレギュレーションされた遺伝子の証拠を示しているため、肝臓器官形成の後期にも肝細胞の移動が必要になる可能性があります5。3D集団移動は、初期の肝臓器官形成における役割に加えて、進行性肝細胞がん(HCC)の局所的な広がりと転移と複雑に関連しており、最終的には予後を悪化させ、治療抵抗性の増加につながります6。成人および胎児の肝細胞は、肝臓の再増殖中に脾臓から肝臓内に移動するときにも集団移動を利用します。In vivoイメージング研究では、移植された肝細胞が数時間以内に門脈に入り、次に毛細血管に入り、肝臓の正弦波を横切って肝臓組織を通過することが示されています7,8,9。最後に、最近の研究では、移動するHBはマウスとヒトの肝臓の再生中に発生することが示されており、sheets10での動きの証拠がいくつかあります。全体として、複数の形態形成モードが可能な肝臓集団移動は、器官形成、癌、肝細胞治療、および肝臓再生において重要な役割を果たします。

数多くの遺伝学的研究により、3D肝臓集団細胞移動の根底にある分子経路が調査されてきました。これらの研究は、肝索の欠如が肝臓形成を妨げることを明らかにし、肝臓形成のための肝索形成の必要性とそれらが支持細胞と相互作用することを強調しています1,11,12,13.また、これらの研究は、心臓の中胚葉から分泌されるFGF-2、周囲の間葉から分泌されるBMP4、HGF、内皮細胞の相互作用など、さまざまな因子によって肝臓の成長が始まることも示しています。さらに、HEX、PROX1、TBX3などの移行関連転写因子が重要な役割を果たします2,14。結論として、遺伝学的研究は、転写因子の発現につながる可溶性因子シグナル伝達が、HBとその周囲の間葉との間の移動、シグナル伝達、および分子相互作用を促進するという証拠を提供しています。

初期の肝臓器官形成における細胞移動は広く研究されていますが、現在の肝移動のin vitro研究では、in vivo腫瘍モデル15と並んで、高度に遊走性HCC細胞を利用した2Dアッセイが頻繁に使用されています。これらの研究は、TGFβ-116、c-Myc17、YAP18、goosecoid19、actopaxin20、miRNAs21,22,23 など、いくつかの要因に関する洞察を提供してきました.3D肝細胞遊走の分子メカニズムの理解には注目すべき進歩が見られましたが、2D細胞遊走と3D細胞遊走の明確な違いから、2Dアッセイには固有の限界があることが示唆されています。さらに、これらのモデルには、遊走と増殖の両方に不可欠な間葉系細胞型が含まれていないことがよくあります。支持する間葉を統合する肝臓移動の3Dモデルの開発が進んでいますが、これらのモデルは、集団移動の多様なモードを探求するのではなく、主に共移動を強調しています。

さまざまな自己組織化および形態形成プロセスを通じてスフェロイドから組織を生成する能力は、合成組織の科学的探求を促進します。これらの組織は、医薬品の開発とスクリーニング、疾患モデリング、治療、およびその他の生物医学的およびバイオテクノロジー的応用に幅広い用途があります。肝臓の3D集団移動の異なるモードを示すように設計されたいくつかの3Din vitro培養システムの方法論的詳細が提供されます。これらのシステムは、(1)マトリックス中のHEPおよびMESスフェロイドとの共スフェロイド培養、(2)M-CMで培養したHEPスフェロイドマトリックス液滴、(3)HEP-MES混合スフェロイド、および(4)高密度のMES細胞で培養したHEPスフェロイドマトリックスから構成されます。これらのシステムにより、3D環境での肝臓集団移動のロバストなモデリングが可能になり、肝臓の器官形成、がん、治療の根底にある分子および細胞プロセスの理解が深まります。

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プロトコル

研究で使用された試薬と機器の詳細は、資料表に記載されています。この記事で使用されている略語は、補足ファイル1で定義されています。

1. 1%低電気浸透(EEO)アガロース溶液の調製

  1. 2.5gの低EEOアガロース粉末を秤量し、ビーカーに移します.
    注意: ビーカーが、溶液調製中のバブリングに対応するために、目的の容量の少なくとも2倍のサイズであることを確認してください。
  2. メスシリンダーを使用して250 mLの蒸留水を測定し、ビーカーに注ぎ、最終濃度(w / v)1%を目指します。
  3. ビーカーの開口部をラップで覆い、換気用の小さな穴を残します。ビーカーを電子レンジで30秒間加熱します。
  4. ビーカーを慎重に取り外し、中身を渦巻きます。このプロセスを30秒ごとに繰り返して、完全に溶解します.
    注意: 電子レンジで加熱されたガラス製品は、適切な手袋を使用して慎重に取り扱ってください。過熱や沸騰を防ぐために、溶液を注意深く監視してください。
  5. 均質な溶液が得られたら、ビーカーを電子レンジから取り外します。溶液を静かに渦巻いてから、滅菌済みのボトルに移します。溶液をオートクレーブし、使用する準備ができるまでアガロース溶液を室温(RT)で保存します。

2. 96ウェルプレートのコーティング

注:384ウェルの超低付加スフェロイドマイクロプレートは、これらの実験およびさらなる実験に利用できます。

  1. 滅菌1%アガロース溶液を含むボトルのキャップを緩めます。.溶液が液相に移行するまで、電子レンジで30秒間隔で溶液を温めます。次に、キャップを締めます.
    注意: 電子レンジで加熱されたガラス製品は、適切な手袋を使用して慎重に取り扱ってください。過熱や沸騰を防ぐために、溶液を注意深く監視してください。
    注:これらの手順は、滅菌組織培養層流フードの下で行ってください。
  2. 1%アガロース溶液をウェルあたり55-65 μLに移して、96ウェル組織培養プレートをコーティングし、すぐにプレートを回転させます。
  3. 1%アガロース溶液を所望の数のウェルに移したら、プレートを4°Cの冷蔵庫に20〜30分間入れて、アガロースを固化させます。使用する前に、プレートを室温に戻してください (図 1A)。

3. HEPスフェロイドの調製

  1. DulbecccoのModified Eagle Medium(DMEM)から成る完成増殖培地(cDMEM)を使用し、10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のPenicillin-Streptomycin(Pen-Strep)を添加した完成増殖培地(cDMEM)を使用して、T-75フラスコでHepG2-WT細胞を培養します。細胞培養を37°Cおよび5%CO2に維持し、増殖培地を毎日交換します。
  2. 80%のコンフルエントに達したら、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎ、リンスを廃棄します。0.05%のトリプシン-EDTAを5 mLフラスコに加え、37°Cおよび5%CO2で5〜10分間インキュベー
    3. トします。
  3. 等量のcDMEMを加え、フラスコから細胞を洗い流します。細胞が剥離したら、混合物を15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに移し、細胞懸濁液を300 x gでRT.
    で5分間遠心分離します。 注:このプロトコルで概説されているすべての遠心分離ステップは、室温(RT)で実施しました。ただし、これらの遠心分離手順は、代わりに低温で実行できます。
  4. 細胞懸濁液を新鮮なcDMEMに再懸濁し、細胞をカウントして細胞/mLの最終濃度を決定します（図1B)。
  5. 細胞の色素標識
    注: これはオプションの手順です。
    1. 所望量の細胞懸濁液を15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに移し、細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
    2. 細胞ペレットを無血清増殖培地に再懸濁して、最終濃度1.0 x 106細胞/mLを達成します。細胞懸濁液1 mLあたり5 μLの蛍光細胞標識溶液を添加し、細胞懸濁液を37°Cおよび5%CO2で20分間回転させてインキュベートします
      注:無血清増殖培地はDMEMであり、1%ペン連鎖球菌のみが補充されます。細胞懸濁液密度に基づいて均一な染色を行うために、インキュベーション時間を調整します。
    3. インキュベーションが完了したら、細胞懸濁液を450 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮なcDMEMに再懸濁します。この洗浄プロセスをさらに 2 回繰り返します (図 1C)。
  6. スフェロイドの形成
    1. 細胞を新鮮なcDMEMに懸濁して、細胞数に基づいて5.0 x 104細胞/mLの最終濃度を達成します。細胞懸濁液をウェルに混合し、ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液をアガロースコーティングされた96ウェルプレートに移します><。 注:細胞懸濁液密度は、アガロースコーティングされた96ウェルプレートでウェルあたり5,000細胞を達成するように設定されています。384ウェルプレートを使用する場合、細胞を最終濃度2.0 x 105細胞/mLで懸濁し、ウェルあたり50μLの細胞懸濁液を1ウェルあたりに移して、1ウェルあたり10,000細胞の濃度を達成します。
    2. プレートを340 x gで10分間遠心分離し、37°Cおよび5%CO2で5〜9日間インキュベートします(図1D).
      注意: めっき後は1日おきに増殖培地を交換し、cDMEMの50%を静かに取り除いて交換します。HEPスフェロイドは、HEP-MESアッサンブロイドモデルまたはM-CMモデルに適しています。

4. MESスフェロイドの調製

  1. DMEMで構成され、10%FBSおよび1%ペン連鎖球菌が補充されたcDMEMを使用して、T-175フラスコでHFF / MRC-5細胞を培養します。細胞培養液を37°C、5%CO2に維持し、培地を1日おきに交換します。
  2. 80%のコンフルエントに達したら、1x PBSで細胞のすすぎを行い、すすぎを捨てます。0.25%のトリプシン-EDTAを5 mLフラスコに加え、37°Cおよび5%CO2で5〜10分間インキュベー
    3. トします。
  3. 等量のcDMEMを加え、フラスコから細胞を洗い流します。細胞が剥離したら、混合物を15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに移し、細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
  4. 細胞懸濁液を新鮮なcDMEMに再懸濁し、細胞をカウントして細胞/mLの最終濃度を決定します（図1B)。
  5. 細胞の色素標識
    注: これはオプションの手順です。
    1. 所望量の細胞懸濁液を15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに移し、細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
    2. 細胞ペレットを無血清増殖培地に再懸濁して、最終濃度1.0 x 106細胞/mLを達成します。細胞懸濁液1 mLあたり5 μLの蛍光細胞標識溶液を添加し、細胞懸濁液を37°Cおよび5%CO2で20分間回転させてインキュベートします
      注:無血清増殖培地はDMEMであり、1%ペン連鎖球菌のみが補充されます。細胞懸濁液密度に基づいて均一な染色を行うために、インキュベーション時間を調整します。
    3. インキュベーションが完了したら、細胞懸濁液を450 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮なcDMEMに再懸濁します。この洗浄プロセスをさらに 2 回繰り返します (図 1C)。
  6. スフェロイドの形成
    1. 細胞を新鮮なcDMEMに懸濁して、細胞数に基づいて最終濃度を1.0 x 105細胞/mLにします。細胞懸濁液をウェルに混合し、ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液をアガロースコーティングされた96ウェルプレートに移します><。 注:細胞懸濁液密度は、アガロースコーティングされた96ウェルプレートでウェルあたり10,000細胞の密度を達成するように設定されています。
    2. プレートを340 x gで10分間遠心分離し、37°Cおよび5%CO2で5〜9日間インキュベートします(図1D).
      注意: めっき後は1日おきに増殖培地を交換し、cDMEMの50%を静かに取り除いて交換します。MESスフェロイドは、HEP-MESアッセンブロイドモデルに適しています。

5. HEP-MESアッセンブロイドの形成

注: HEP (図 2A) と MES スフェロイド (図 2B) の形成については、ステップ 3 とステップ 4 を参照してください。

  1. HFF/MRC-5スフェロイドは、96ウェルプレートのピペットを使用して個別に収集します。それらを新鮮なcDMEMを含む15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに移します。スフェロイドをチューブ内に5分間沈殿させた後、温かいcDMEMでやさしくすすいでください
    注意: すすぎプロセスは、優しく注意して行ってください。
  2. ピペットを使用して、単一のHFF/MRC-5スフェロイドをHepG2-WTスフェロイドを含むウェルに静かに移します。氷冷成長因子還元型(GFR)マトリゲル(MG)またはラットテールコラーゲン(CG)を1:1および1:5希釈液で添加し、37°C、5%CO2で3時間インキュベートします(図2C).
    注:MGは、2°C〜8°Cの冷蔵庫で氷の上で一晩解凍します。MGを取り扱う際は、10°C以上でゲルを形成するため、予冷したピペット、チップ、チューブを使用してください。
  3. インキュベーション後、75 μLの新鮮なcDMEMを各ウェルに加え、5% CO2で37°Cで2〜3日間インキュベートします><。 注意: めっき後は1日おきに増殖培地を交換し、cDMEMの50%を静かに取り除いて交換します。アッセンブロイドは、最大3〜4日間、培地を交換しなくても形成されます。HEP-MESアッセンブロイド形成は、マトリックスを使用せずに行うことができます。

6. HEPスフェロイド液滴の形成

注:HEPスフェロイドの形成については、ステップ3を参照してください（図3A)。HEPスフェロイドを液滴に懸濁するために、2つの異なる材料を使用することができます。2つの方法を以下に示します。

  1. GFR MG液滴
    1. 96ウェルプレートのピペットを使用してHepG2-WTスフェロイドを個別に収集し、氷上の15 mLの滅菌円錐形遠心分離機に沈殿させます。
    2. 別の15 mL滅菌円錐遠心チューブで、1 mLの氷冷GFR MGと氷冷コントロール増殖培地を1:1の希釈で混合します。HepG2-WTスフェロイドを含む15mLチューブからピペットを使用して培地を吸引し、氷上に置きます.
      注:MGは、2°C〜8°Cの冷蔵庫で氷の上で一晩解凍します。MGを取り扱う際は、10°C以上でゲルを形成するため、ピペット、チップ、チューブをあらかじめ冷却してください。
    3. MG溶液をHepG2-WTスフェロイドに添加すると、MG溶液内にスフェロイドが均一に分布します。
    4. 200 μLのピペットを使用して、MG溶液中の1つの回転楕円体を15 μLの量に集め、60 mmのシャーレ(図3B)にゆっくりと播種します。
      注:液滴ごとに複数のスフェロイドが播種されている場合は、適切に取り除いて再播種してください。スフェロイドは、液滴の中心にくるように、必要に応じて再配置されます。最適なスフェロイド播種を行うには、逆ピペッティングを使用して気泡の形成を最小限に抑えることを検討してください。
  2. ラットテールCG液滴
    注:すべてのCGの準備は氷上で行う必要があります。
    1. 96ウェルプレートのピペットを使用してHepG2-WTスフェロイドを個別に収集し、氷上の15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに沈殿させます(図3B)。
    2. 微量遠心チューブに、358.8 μLの脱イオン水、10x PBS100 μL、12.1 μLの1 N NaOH、および529.1 μLのストックラットテールCGを加えて、総容量1 mL
      注:ストックラットテールCGは、必ず最後に追加する必要があります。
    3. HepG2-WTスフェロイドにCG溶液を添加すると、CG溶液内にスフェロイドが均一に分布します。
    4. 200 μLのピペットを使用して、CG溶液中の15 μLの単一スフェロイドを回収し、60 mmのシャーレにゆっくりと播種します><。 注:液滴ごとに複数のスフェロイドが播種されている場合は、適切に取り除いて再播種してください。スフェロイドは、液滴の中心にくるように再配置されます。最適なスフェロイド播種を行うには、逆ピペッティングを使用して気泡の形成を最小限に抑えることを検討してください。
  3. 液滴を37°Cおよび5%CO2で60分間インキュベートしてから、増殖培地を添加します。
  4. 5 mLの所望の増殖培地をペトリ皿にゆっくりと加え、37°Cでインキュベートし、3日ごとに増殖培地を交換しながら5% CO2をインキュベートします(図3C).
    注:HEP飛沫形成アッセイにはM-CMを使用しました。

7. M-CMの準備

  1. HFF/MRC-5細胞を回収し、播種密度5,000細胞/cm2のT-75組織培養処理フラスコに播種し、フラスコを37°C、5%CO2で15mLのcDMEM.
    で72時間インキュベートします 注:この期間中はフラスコを監視して、最適な細胞の健康状態を確認してください。
  2. 72時間のインキュベーション後、M-CMを15 mLの滅菌円錐形遠心チューブに回収します。M-CMを290 x gで5分間遠心分離して破片を除去し、滅菌のために0.2μmフィルター(図4A)を使用してろ過します。
  3. M-CMを完全な増殖培地で1:1から1:7の希釈比で希釈し、所望の実験に加えます（図4B)）
    注:HEP液滴形成アッセイでM-CMを利用します。

8. HEP-MES混合スフェロイドの形成

注:HepG2-WT細胞懸濁液調製についてはステップ3.1-3.5.を、HFF/MRC-5細胞懸濁液調製についてはステップ4.1-4.5を参照してください。

  1. HepG2-WT細胞を新鮮なcDMEMに懸濁して、各細胞懸濁液の最終濃度が1.0 x 105細胞/mLになるようにします。
  2. HFF/MRC-5細胞を新鮮なcDMEMに懸濁して、各細胞懸濁液の最終濃度が1.0 x 105細胞/mLになるようにします。
  3. HepG2-WTおよびHFF/MRC-5細胞懸濁液を15 mLの滅菌円錐遠心チューブに1:1の比率で移し、最終濃度2.0 x 105細胞/mLを得ます。細胞懸濁液を完全に混合し、1ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液をアガロースコーティングされた96ウェルプレートに移します><。 注:細胞懸濁液密度は、アガロースコーティングされた96ウェルプレートでウェルあたり20,000細胞を得るように設定されています。
  4. プレートを340 x gで10分間遠心分離し、37°Cおよび5%CO2で1〜2日間インキュベートします(図5C)。
  5. フィブリンハイドロゲルの添加
    注:これは、HEP-MES混合スフェロイドをめっきしてから72時間後に行われるオプションのステップです。
    1. 15 mLの滅菌円錐形遠心チューブで、フィブリノーゲン(3.25 mg/mL)とトロンビン(12.5 units/mL)を4:1の比率で混合してフィブリンを形成し、チューブを氷上に置きます。
  6. 既存の混合スフェロイドをウェル内の現在のcDMEMと1:1の希釈で各ウェルにフィブリンを移します。プレートを37°Cおよび5%CO2で30分間インキュベー
    7. トします。
  7. インキュベーション後、75 μLの新鮮なcDMEMを各ウェルに加え、5% CO2で37°Cで1〜2日間インキュベートします><。 注意: めっき後は1日おきに増殖培地を交換し、cDMEMの50%を静かに取り除いて交換します。

9. 高密度MES移動モデル

注:HepG2-WTスフェロイド調製(図6A)のステップ3とHFF/MRC-5細胞懸濁液調製(図6B)のステップ4.1-4.5を参照してください。

  1. HFF/MRC-5細胞を新鮮なcDMEMに懸濁して、最終濃度6.0 x 105細胞/mLを達成し、氷上に置きます。
  2. HFF/MRC-5細胞懸濁液と氷冷MG/CGを1:1希釈で混合します(図6C).
    注:細胞懸濁液密度は、アガロース被覆96ウェルプレート中のウェルあたり30,000細胞を得るように設定されています。MGは、2°Cから8°Cの冷蔵庫で氷の上で一晩解凍します。MGを取り扱う際は、10°C以上でゲルを形成するため、ピペット、チップ、チューブをあらかじめ冷却してください。
  3. 100 μLのHFF/MRC-5およびMG溶液をピペットでHepG2-WTスフェロイドを含むウェルに移します。プレートを37°Cおよび5%CO2で30分間インキュベー
    4. トします。
  4. インキュベーション後、75 μLの新鮮なcDMEMを各ウェルに加え、5% CO2で37°Cで最大12日間インキュベートします。

10. 統計分析

  1. Microsoft Excelまたは統計/グラフ作成ソフトウェアを使用して収集したデータを確認および分析します。
    注:2つのグループ間の統計的評価のために、スチューデントのt検定(2つの裾を持つタイプII)が行われ、0.05以下のp値は統計的有意性を持つと見なされ、テキストと図/図の凡例内で定義されます。

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結果

疾患モデリング、創薬、組織工学などの幅広い生物医学的応用（図7）に向けた合成組織への関心が高まっています。この分野において、ヒト多能性幹細胞（hPSC）由来のオルガノイド、スフェロイド、および細胞は、より合成的で複雑かつ大規模な組織へと変換されつつあります。この変換には、形態形成の原理の適用、マイクロファブリケーションなどのツールの活用、およびバイオマトリックスの統合が含まれており、これにより合成組織の精密なエンジニアリングが可能になります（図7）。ここでは、この包括的なテーマに沿ったいくつかの手法を紹介します。

クラスター形成がスフェロイド形成に及ぼす影響
本研究で用いた手法は、3Dスフェロイドの正常な形成に基づいています。スフェロイドが5日から9日の間に融合し、最終的に完全に完全なスフェロイドが形成されることで、正常な形成が確認されました。初期の成功の兆候としては、培養プレートの遠心分離後にウェルの中心に細胞がクラスタ...

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ディスカッション

本プロトコルは、単純な集合体と複雑な集合体の両方を培養するための複数の方法、ならびに初期の肝臓器官形成において3D集団細胞遊走を誘導するための技術を網羅している24,25。概説されたプロトコルでは、スフェロイド形成がすべての方法論の中心的な側面であるいくつかの重要なステップを強調しています。マイクロウェル(96ウェルまたは384ウェル)は、非接着プレートまたはアガロースコーティングプレートのいずれかで利用され、スフェロイド形成を実現します。この方法により、予想されるサイズに達しないスフェロイドや不規則な形状のスフェロイドを考慮して、その後の実験のためにスフェロイドが豊富に生成されます。望ましい基準を満たさないスフェロイドは、下流の実験で除外されます。スフェロイド形成の初期効率は、ユーザーの専門知識を含むさまざまな要因によって異なります。オルガノイドを扱うには、スフェロイド(またはオルガノイド)の形成、ウェル間の移動、スフェロイドへのバイオマトリックスの付加、ウェルごとの複数のスフェロイドの配置などの側面を含む、かなりのス...

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開示事項

NPは、急性および慢性肝疾患の治療法を開発するオルガノイドエンジニアリング会社であるKhufu Therapeuticsの創設者です。

謝辞

著者は、この論文で使用されたデータに対する貴重な貢献に対して、オゲチ・オゴケとオサマ・ユセフに心から感謝したいと思います。NPは、UB CBEスタートアップファンド、Mark Diamond Fellowship、New York State Stem Cell Science C024316、UB Stem Cells in Regenerative Medicine(ScIRM)センター、University at Buffalo Center for Cell, Gene, Tissue Engineering(CGTE)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
384ウェル ブラック/クリア ラウンドボトム 超低アタッチメント スフェロイドマイクロプレートコーニング3830
96-wl 細胞培養プレート フラット,TC,STRL,1/pk,100/CSラボラトリープロダクツ 販売701001
アガロースSigma-AldrichA0576低EEO
Axiovision ソフトウェアZEISSversion 4
細胞培養ディッシュ, 60mm, TC, STRL, 20/pk、500 / CSラボ製品販売705001
細胞培養フラスコ、175cm²、ベント、TC、STRL、5 / pk、40 / CSラボ製品販売709003
細胞培養フラスコ、75cm²、ベント、TC、STRL、5 / pk、100 / CSラボ製品販売708003
遠心分離チューブ、15mL、PP、STRL、グラッド、50 / BG、500 / CSラボ製品販売L226010
コラーゲンI、ラットテール、100 mgCorning354236
DMEM、高グルコース、GlutaMAX Supplement、ピルビン酸サーモフィッシャーサイエンティフィック10569010
EVOS 蛍光、位相差顕微鏡EVOSAMEFC4300R1,360 x 1,024 ピクセル密度
ウシ胎児血清、認定済み、米国ThermoFisher Scientific26140079
ヒト血漿由来フィブリノーゲンSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCC SCRC-1041
ImageJIJ1.46r;
https://imagej.net/ij/ Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membraneマトリックス、LDEVフリー、10 mLCorning354230
MRC-5 ATCCCCL-171
MSCGMT ヒト間葉系幹細胞増殖 BulletKitロンザPT-3001
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
ヒト血漿由来トロンビンSigma-AldrichT6884-100UN100 ユニット
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25300062
トリプシンEDTA(0.25%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25200072
Vybrant DiD細胞ラベリングソリューションサーモフィッシャーサイエンティフィックV22887
Vybrant DiI細胞ラベリングソリューションサーモフィッシャーサイエンティフィックV22885
Vybrant DiO細胞ラベリングソリューションThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio 蛍光顕微鏡ZEISSSE64、1,344 ×、1,024 ピクセル密度

参考文献

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